Abstracte achtergrond
Een aantal pathogenen kan in de loop van parodontitis ernstige vernietiging van het parodontale apparaat veroorzaken. Het doel van dit werk was de ontwikkeling van een diagnostische inrichting voor het gebruik bij het Point of noodzakelijk voor de detectie van parodontitis een gepersonaliseerde therapie voor de behandeling van parodontitis mogelijk.
Methods
Dit testsysteem is gebaseerd de polymerase kettingreactie van DNA geïsoleerd uit periodontale pathogenen en onderzocht nauwkeurig detecteren species-specifieke sequenties op een roterende chip met gevriesdroogde reagentia voor polymerase ketenreactie. Het behoud van de reagentia werd geoptimaliseerd om de stabiliteit tijdens de opslag te waarborgen.
Resultaten
In het huidige werk, hebben we een model point-of-care apparaat ontwikkeld en liet een proof of concept. Het vereist lage monster volume, is tijdbesparend en kan dus een vroege diagnose en behandeling van parodontale aandoeningen te vergemakkelijken.
Conclusies
De ontwikkelde apparaat kan een snelle diagnose van de samenstelling en hoeveelheid van orale flora van patiënten te bieden en kan helpen om het te beoordelen stadium van parodontitis infectie. Dit kan een optimalisatie van de therapeutische benaderingen
Sleutelwoorden
Bacteriële kwantificering Parodontitis Real-time PCR Microbiële diagnostiek Vriesdrogen Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit te vergemakkelijken met het oog op een aantal van de meer ernstige gevolgen van de ziekte te voorkomen. artikel (doi:. 10 1186 /s12903-015-0155-y) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is achtergrond
Ongeveer 90% van de wereldbevolking ervaring tandheelkundige of orale problemen tijdens hun. levens [1]. 11,2% van de volwassenen getroffen door ernstige parodontitis, waardoor het een relevant onderwerp in de tandheelkundige gezondheidszorg [2].
Parodontitis is een complexe ontstekingsrespons van het menselijk lichaam tegen micro-organismen, wat kan leiden tot ernstige weefselvernietiging in de mondholte [3].
Risicofactoren leiden tot infecties geïdentificeerd roken, diabetes, voorkomen van speciale micro-organismen, obesitas, psychologische en hygiënische aspecten. Bovendien genetische factoren, leeftijd, geslacht en etniciteit zou ook een rol bij de ontwikkeling van parodontitis spelen [4].
Voor de diagnose van periodontitis, zijn verscheidene werkwijzen vastgesteld. Direct parodontale onderzoeken onder patiënten anamnese, metingen van pocketdiepte en klinisch niveau gehechtheid, en het nemen van tandheelkundige röntgenfoto's. Bovendien genetische gevoeligheidstests of het onderzoek van de subgingivale microflora en creviculaire fluïdum mogelijke methoden om parodontitis te evalueren [5]. Afhankelijk van de resultaten van de medische diagnose en stadium van de ziekte, een geschikte behandeling volgt. Benaderingen zoals het optimaliseren van mondhygiëne, regelmatig professioneel schoonmaken, scaling /debridement en rootplaning, het gebruik van antibiotica voor het beheersen van bacteriële vorming en ontsteking plaque, zelfs in extreme gevallen een operatie kan noodzakelijk zijn om tanden te voorkomen [6].
van de ongeveer 600-700 soorten bacteriën die leven in subgingivale gebieden, slechts een paar van hen worden geassocieerd met parodontitis en kan leiden tot significante veranderingen in de orale microbiële gemeenschap, hoeveelheid en samenstelling [7, 8]. Om het stadium van parodontitis infecties beoordelen en initiëren effectieve behandelingen, is het nuttig om zowel de identiteit van de interagerende soorten als het totale aantal pathogenen die in periodontale pockets bepalen. De hier gepresenteerde werk gericht op bacteriesoorten aangetoond geassocieerd met periodontitis, die in drie klassen kunnen worden afgebakend gebaseerd op pathogeniciteit: E. corrodens, F. nucleatum, blz micra Wat zijn enigszins pathogeen, P. intermedia, C. rectus, E. nodatum Wat zijn matig pathogene en A. actinomycetemcommitans, P. gingivalis, T. denticola
sterk pathogene organismen [9]. Hoewel verdere species, de expressie van typische biomarkers en de individuele levensstijl mensen kunnen de ontwikkeling van de ziekte te beïnvloeden en kan de detectie van deze merker soorten een eerste stap in het proces het identificeren van een ziekte of medische aandoening te meer gegevens.
Indien de typen bacteriële soorten die in periodontale pockets kunnen worden geïdentificeerd, kan deze informatie gebruikt worden om beter te classificeren de aard en ernst van de infectie en op maat een gepersonaliseerde behandeling het meest geschikt zijn loop [10] omkeren.
Slechts enkele point-of care apparatuur voor nucleïnezuur gebaseerde detectie zijn ontwikkeld en vastgesteld op de markt tot nu toe. Cepheid GeneXpert, bijvoorbeeld, is een geautomatiseerde inrichting voor polymerasekettingreactie (PCR) met speciale monstervoorbereiding patronen voor tuberculose pathogenen, MRSA of groep-B-streptokokken. Echter, deze high-cost systeem niet de optie in te schakelen om verschillende multiplex reacties uit te voeren in een test uit te voeren. IQuum onlangs de PCR-gestuurde analyse van HIV in 1,5 h met de LIAT analysator en Lutz et al.
Toonden een lab-on-a-folie systeem realiseren van een amplificatiereactie van MRSA in minder dan 20 minuten [11]. Bovendien Van Oordt et al. [12] gerapporteerd in 2012 over een geïntegreerd systeem voor nucleïnezuurdetectie of immunoassays met behulp van een wegwerp Labdisk platform.
In deze studie, de ontwikkeling van een eenvoudig te gebruiken, goedkope lab-on-chip systeem voor de detectie, identificatie en kwantificering van parodontale bacteriën is de belangrijkste overweging bij het ontwerp van de moleculair biologische test en diagnostisch apparaat. Het diagnostische systeem bestaat uit twee elementen: een microfluïdische cartridge, die vereist PCR reagentia in gedroogde vorm bevat, en een apparaat verantwoordelijk voor het aandrijven en besturen van de workflow. De laatste is een radiaal verdeelde verwarmingsblok samenstel met meerdere stabiele temperatuurgebieden voor de verschillende stappen van de PCR in combinatie met een centraal gelegen rotatiemotor met een bevestiging voor een polycarbonaat (PC) PCR chip. Deze chip herbergt de patiënt monster in reactiekamers en draaibaar temperatuurzones op het verwarmingsblok om de PCR uit te voeren. De stijgende hoeveelheid amplicon kan worden gedetecteerd via fluorescentiemetingen.
Conceptueel soortgelijke rotatie inrichtingen bestaan, zoals de Focus 3M ™ geïntegreerde Cycler, waarbij de combinatie van centrifugaalkracht infraroodenergie als warmtebron voor de PCR gebruikt. Monsteranalyse wordt uitgevoerd hetzij in een wegwerp universeelschijf voor de gebruiker testen of bepaalde ziekten in een chip specifieke kits die vele pipetteerstappen of koelen van reagentia [13]. Ook de zon et al.
[14] toonde 2007 een circulaire microchip voor versterking toe te passen ferrovloeistoffen en magnetische krachten, waaruit het probleem van de lage monster doorzet. Ondernemingen De lab-on-a-chip gebaseerde amplificatie en meetsysteem gepresenteerd in dit werk heeft het potentieel om parodontitis conventionele diagnostiek in de toekomst te optimaliseren door het minimaliseren laboratorium behandelingsstappen en maken een snelle uitvoering van PCR, vermijden een lange levertijd van patiëntenmonsters. Bovendien kunnen de chip-setup worden geïntegreerd met modules voor DNA-isolatie in latere versies. Op deze manier willen we tijdrovende en arbeidsintensieve stappen tijdens de voorbehandeling te elimineren.
Methods
Bacteriële stammen /teeltomstandigheden /DNA-isolatie
Parodontitis-veroorzakende bacteriën werden verkregen uit de Duitse collectie van micro-organismen and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Duitsland) en gekweekt in geschikt medium (zie Extra file 1: Tabel S1). Kolonies of bacteriën tot pellet van vloeibare media door centrifugeren kan worden opgehaald voor DNA-isolatie. DNA zuivering werd bereikt met behulp van de QIAamp DNA Mini Kit® (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. DNA opbrengst en zuiverheid werden gemeten met de NanoDrop instrument 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA).
PCR
De opsporing en kwantificering van parodontale bacteriën amplificatie werden uitgevoerd met behulp van een LightCycler 480 II. Primersequenties worden gegeven in Extra file 2: Tabel S2. De primers voor amplificatie van de soortspecifieke DNA-fragment werd ontworpen tijdens dit project met behulp van de Primer3 software. 16S universele primers werden uit Kommedal et al goedgekeurd. . [15]
Fietsweerbericht voor de amplificatie waren als volgt: 5 minuten aanvankelijke incubatie bij 95 ° C, gevolgd door 40 amplificatiecycli (95 ° C gedurende 10 s, 51 ° C gedurende 10 s en 72 ° C 15 s). Na elke PCR run werd een aanvullende smeltcurve analyse uitgevoerd om het geproduceerde DNA-moleculen karakteriseren.
Standaardcurves
Voor vaststelling standaard curves, verdunningsreeks van bacterieel DNA variërend van 2-2.000.000 genoomequivalenten gebruikt in een viervoudige poging kwantitatieve real-time PCR. Standaard krommen werden standaard gemaakt met de methode fit punten van het LightCycler programma. Voor de totale kiemgetal,
Porphyromonas gingivalis diende als een vertegenwoordiger van 16S PCR met een gemiddeld aantal kopieën van vier 16S gen exemplaren. De standaard is opgezet om een geschat ziekteverwekker nummer voor kwantificatie te bereiken. Het is bekend dat verscheidene kopieën van het 16S gen kan plaatsvinden binnen een prokaryote genoom, met een maximum van 15 kopieën van Bacillus thuringiensis
. Dit feit maakt het moeilijk om een realistische totale aantal bacteriën te schatten in een diverse populatie van bacteriën sterk wisselende kopie-aantallen tussen de individuele soorten. De parodontitis veroorzaken organismen die worden gebruikt in ons onderzoek worden verondersteld te zijn in het lagere aantal kopieën bereik volgens de gegevens in de ribosomaal RNA Operon Copy Number Database [16]. Om dit te bewijzen, het onbekende aantal kopieën voor E. corrodens
werd bepaald in de loop van dit werk. Voor unsequenced organismen, kan kopiegetal bepaling worden bereikt met behulp van Southern Blot analyse. Een 16S sonde kan het aantal gelijkwaardige gebieden op te sporen in het beperkte genoom, zoals eerder door Lee et al getoond. [17].
Southern blot Belgique Om bepalen 16S kopienummer van E. corrodens
via Southern blot, ongeveer 10 ug DNA werd gedigereerd met restrictie-enzymen Eco RI
HF, Hind III
(New England Biolabs, Ipswich, USA), Nco
I, PST
I, Xba
I (Jena Bioscience GmbH, Jena, Duitsland) en Xho
ik FD (Thermo Fisher Scientific, Waltham, VS) bij 37 ° C overnacht. De monsters, tezamen met de 16S PCR amplicon als positieve controle, werden gescheiden op een 1% agarose gel bij 4 ° C. De gel werd bereid capillaire blot met depurinering (0,25 M HCl), denaturatie (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) en neutralisatie (3 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl), gevolgd door overnacht blotten op een nylon membraan.
voor hybridisatie, biotine PCR Master Labeling (Jena Bioscience, Jena, Duitsland) werd gebruikt om een probe te genereren. 16S primers en template DNA van E. corrodens
werden aangebracht op een gebiotinyleerde amplicon door incorporatie van gebiotinyleerde dUTPs produceren gedurende PCR. De sonde werd gezuiverd met de NucleoSpin® Gel en PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland). Een volledige doelsequentie voor hybridisatie te waarborgen, een onderzoek naar mogelijke snij plaatsen binnen de sequentie werd uitgevoerd: een enzymatische incubatie van de 16S amplicon met bovengenoemde enzymen en daaropvolgende controle door de band grootte van uitgegist amplicon vergelijken met de controle DNA in een agarose gel uitgevoerd.
Na pre-hybridisatie overnacht bij kamertemperatuur gevolgd door 2 uur incubatie bij 42 ° C, hybridisatie met probe 200 ng /ml buffer werd uitgevoerd. Hybridisatie en detectie procedures werden uitgevoerd zoals beschreven in de Biotine chromogene Detection Kit (Thermo Scientific, Schwerte, Duitsland), wat resulteert in een gekleurde neerslag.
PCR-on-a-chip
De PCR werd uitgevoerd op 1 mm dikke PC chips met holtes die een volume van 10 gl reactiemengsel houden. De chips werden afgesloten met afdichtingsfoliën (nerbe plus GmbH, Winsen /Luhe, Duitsland) vanaf beide zijden met de PCR mix ingesloten.
Voor amplificatie, PCR de chip draait op de thermische cycli-inrichting, die is getoond in Fig. 1. In het kort is het samengesteld uit zes cirkelvormig aangebrachte pie-slice-vormige verwarmingsblokken Drie daarvan voor het bereiken van denaturatie, annealing en elongatiestappen en drie extra blokken voor de verwezenlijking van snelle temperatuursveranderingen in de holtes. Fig. 1 thermische cycli-inrichting met verschillende temperatuurzones en een roterende PCR chip. Links: Een schematische tekening illustreert de rangschikking van de verwarmingselementen (Ta = annealing temperatuur) en de fluorescentiedetector. Een roterende chip geeft elke zone en bij 72 ° C het fluorescentiesignaal wordt gemeten. De rechter afbeelding toont het laboratorium opzet, inclusief de aandrijfmotor en temperatuurregeling
Voor proof of concept van de inrichting, een gevestigde PCR van S. aureus
(ATCC 2592), met een grootte van amplicon 279 bp werd gebruikt. Fietsomstandigheden waren een aanvankelijke 5 minuten denaturatie, gevolgd door 30 s bij elk van de opeenvolgende 95, 61 en 72 ° C stappen voor amplificatie voor een totaal van 40 cycli, met 5 s besteed aan de platen gelegen tussen elk van de drie.
het reactiemengsel zelf werd geoptimaliseerd met verscheidene toevoegsels zoals beschreven in de volgende "lyofilisatie sectie om de PCR-verenigbaarheid van PC verlengen en vriesdrogen van het mengsel mogelijk.
vriesdrogen
Een test om de bepalen effect van vriesdrogen PCR-reagentia op de amplificatiereactie werd uitgevoerd met behulp van E. corrodens
specifieke PCR en gekarakteriseerd testsysteem. Het PCR mengsel bevatte een eindconcentratie van 0,25 uM voor elke primer, 50% 2x SBYR Green Mastermix (Roche, Mannheim, Duitsland), 5% trehalose, 0,25 ug /ul BSA, 0,75% PEG 8000, 10 ng DNA en de rest DDH
2O. Het vriesdrogen mengsel werd bevroren bij -80 ° C gedurende 15 min en tenslotte gevriesdroogd gedurende drie uur in een voorgekoelde vriesdroger. Langdurige opslag tot vier maanden bij 4 ° C en kamertemperatuur werden vergeleken met mengsels beschermd tegen licht, zowel met als zonder de toevoeging van trehalose polymerase stabiliseren, met het LightCycler systeem voor real-time PCR. Een negatieve controle werd uitgevoerd tijdens het vriesdrogen om besmetting tijdens het proces uit te sluiten.
Resultaten
Standard bochten
voor de detectie en kwantificering van de tien-parodontitis veroorzakende bacteriën gebruikt in deze studie, en de detectielimieten te bepalen kwantitatieve PCR assays werden vastgesteld. Door gebruik verdunningsreeks van bacteriële genoom kopie-aantallen werden standaardkrommen gemaakt op basis van de verkregen amplificatiecurven. Als voorbeeld, de standaard curves van C. gingivalis Kopen en E. corrodens Wat zijn gegeven in Fig. 2. betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijgen, moet de efficiëntie van de PCR groter dan 1,8 zijn. Standaard krommen werden opgezet voor de overige parodontale bacteriën op dezelfde manier. Fig. 2 Standaard curves: het oversteken van punt (CP) versus monster concentratie. een C. gingivalis met een rendement van 1,80 variërend van 20-2.000.000 bacteriën, en (b) E. corrodens met een rendement van 1,99 variërend van 200-2.000.000 bacteriën. Alle gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD
detectielimieten bepaald door de LightCycler 480 II is als volgt: P. intermedia
2000 kopieën /reactie, C. gingivalis
20 kopieën /reactie, C. rectus
2 kopieën /reactie, A. actinomycetemcommitans
10 kopieën /reactie, P. gingivalis
10 kopieën /reactie, E. corrodens
200 kopieën /reactie, P. micra
2000 bacteriën, T. denticola
20.000 kopieën /reactie, algemene telling 200 kopieën /reactie.
Southern Blot Ondernemingen De restrictie-endonucleasen Eco
RI, Hind
III, Nco
I, PST
I ,
Xba I en Xho I
werden gebruikt om het aantal 16S operons aanwezig in het genoom van E. corrodens schatten.
Deze enzymen werden bovendien getest om te verzekeren dat er geen knipplaats in de 16S regio wanneer de detectie probe hybridiseert tijdens de Southern Blot, teneinde het optreden van teveel bands gevolg van binding van de probe aan doelsequenties snijden voorkomen. Zoals getoond in Fig. 3, kan een maximum aantal van vier banden gedetecteerd worden na het knippen met Eco
RI, Hind
III en Pst
I. De aanwezigheid van minder zichtbare banden voor de beperking met Nco
I, Xba
I en Xho
ik kon het gevolg zijn van de opkomst van de lange DNA-strengen die twee of meer 16S regio's na enzymatische incubatie zijn. Volgens ons onderzoek, een 16S operon aantal vier is zeer waarschijnlijk voor E. corrodens
; het gebruik van P. gingivalis
, die hetzelfde operon 16S nummer bevat, als de standaard voor het schatten van de totale kiemgetal, lijkt zeer geschikt. Fig. 3 16S kopienummer van E. corrodens bepaald door Southern hybridisatie. Genoom DNA werd geknipt met 1) Eco
RI, 2) Hind
III, 3) Nco
I, 4) Pst
I, 5) Xba
I, 6) Xho
I. 7) positieve controle. Eco
RI, Hind
III en Pst
toon ik het maximale aantal van 4 bands
PCR-on-a-chip
Eerste fluorescentie metingen werden uitgevoerd met de Qiagen ESElog fluorescentie meetsysteem geplaatst boven de 72 ° C temperatuurzone van de thermische cycli-inrichting, die verantwoordelijk is voor de rek stap van de PCR. De ESElog USB E470 /D520 is geschikt voor detectie van de DNA-intercalerende kleurstof SYBR Green in de PCR mastermix.
Verzamel gedurende welke het monster met chip geleid door elk van de verschillende temperatuurzones op de thermocycli apparaat, de voortdurende stijging van de fluorescentie die overeenkomt met het bedrag van S. aureus
-specifieke amplicon aanwezig op dat moment werd gemeten. De resulterende toename van fluorescentie gemeten over 40 cycli door de detector kan worden gezien in Fig. 4. Fig. 4 Real-time fluorescentie detectie. Singleplex PCR op het lab-on-chip systeem. een fluorescentiemeting exemplarisch getoond voor twee monsters. b resulterende amplicon op een 2% agarosegel
Tijdens de verwarmingsstappen, belvorming in de PCR kamers tot aberraties tijdens amplificatie als exemplarisch in cyclus 20 en 39 van monster 2 (zie fig. 4a) getoond. Toch is de verwachte toename van fluorescentie en een positief PCR resultaat van de beoogde 279 bp van S. aureus
werden aangetoond in de aanvankelijke testen (zie fig. 4b).
Vriesdrogen
behoud van de biologische activiteit van het polymerase na vriesdrogen werd aangetoond voor de onderzochte periode van vier maanden. E. corrodens
-specifieke PCR-evaluatie blijkt dat dit op lange termijn opslag bij 4 ° C na vriesdrogen heeft niet geleid tot wijzigingen van de versterking curve, terwijl opslag bij kamertemperatuur het typisch verloop van de curve en zijn karakteristieke exponentiële afgeplat toename. In dit geval, de real-time PCR kruispunten zich in een vertraagde wijze (zie figuur 5 en aanvullende bestandsinformatie 3. Tabel S3). Fig. 5 Vriesdrogen-test. Vergelijking van de polymerase-activiteit na 1 (a) en 4 (b) maanden opslag gevriesdroogd PCR mixes.1-3) opslag bij 4 ° C, 4) opslag bij 4 ° C zonder toevoeging van trehalose, 5-7 ) opslag bij kamertemperatuur 8) opslag bij kamertemperatuur zonder toevoeging van trehalose, 9) PCR negatieve controle, 10) negatieve controle bewaard bij 4 ° C, 11) positieve controle na lyofilisatie
toevoeging van trehalose aan de PCR mix bleek essentieel voor langdurige opslag, vooral bij kamertemperatuur. Amplificatie met het reactiemengsel zonder trehalose tot een slecht signaal, lagere totale fluorescentie niveaus en vertraagde CP na opslag bij kamertemperatuur gedurende vier maanden.
Discussie en conclusies
Periodontitis is een alomtegenwoordige ziekte wereldwijd de behoefte aan effectieve diagnostische , snelle behandeling en remming van de progressie om tanden te voorkomen. Bovendien kunnen orale infecties mogelijk leiden tot ernstige secundaire ziekten zoals sepsis, systemische of cardiovasculaire ziekte en longontsteking [18].
Om de detectie en kwantificering bacteriesoorten indicatie van de ziekte te vergemakkelijken, hebben we een PCR-gestuurde point-of-care apparaat voor parodontitis geassocieerd pathogeen identificatie en toonde basisfunctionaliteit. Ondernemingen de kwantitatieve PCR-test voor bacteriële stammen werd met succes ontwikkeld en standaard curves werden opgezet met de LightCycler systeem. Voor absolute kwantificering kan onbekende concentraties van monsters worden vergeleken met reeds standaard bochten, waarbij ten minste één standaard van bekende concentratie die binnen het bereik van de ingevoerde curve moet worden opgenomen in elke PCR-run te dienen als referentie. Ximénez-Fyvie et al.
Al toonde in 2000 dat subgingivale plaque monsters van gezonde patiënten bevatten vaak beduidend lager bacteriële aantallen, zodat de bereikte detectielimieten van hier slechts twee bacteriën in sommige gevallen geschikt zijn om te analyseren de vaak zeer hoge bacteriële belasting in geval van bestaande parodontitis [19]. Ontwikkeling van de inrichting verder wordt de beschreven procedure kwantificering overgebracht worden op het apparaat point-of-care proeven op patiënt afgeleide monsters mogelijk in de toekomst.
Southern blotanalyse vier kopieën van het 16S regio kunnen identificeren in het genoom van E. corrodens
. Deze werkwijze omzeilt sequentiebepaling van het volledige genoom E. corrodens
, waarvan de volledige sequentie nog niet beschikbaar. Echter kan dit getal hoger bij onvolledige snijden zijn de restrictie-enzymen of in het geval van twee of meer 16S gebieden zijn gelegen op een DNA-fragment die voortvloeien uit restrictie-digest. Toch hebben deze resultaten blijkt dat het gebruik van P. gingivalis
als vertegenwoordiger voor periodontopathogenic bacteriën geschikt voor het genereren van de standaardcurve voor de totale bacteriële tellingen met een typische 16S is kopienummer van vier. Het gebruik van deze bacterie voor het genereren van een universele standaard curve voor de beoordeling van de totale microbiële tellingen werd reeds beschreven door Kirakodu et al.
[20].
Als proof of concept, de PCR-test kan worden aangetoond om te werken in PCR-chips draaien over meerdere verwarmingszones op een speciaal ontworpen thermocycli apparaat. Vanwege de kleine reactievolume vereist en het gebrek aan noodzakelijkheid voor verwarming en koeling stappen van de verwarmingsblokken zelf, de reactietijd was een derde sneller dan conventionele thermocyclers ook zonder extra zorg besteed aan de individuele PCR stappen verder te optimaliseren.
in de toekomst, zal deze reactie worden geoptimaliseerd ingekort denaturatie /uitgloeistappen en PCR-additieven of snel polymerasen, bijvoorbeeld een Fast KAPA2G DNA Polymerase (Kapabiosystems, Wilmington, USA) met een verlenging van ongeveer 1 s /kb , hetgeen leidt tot een aanzienlijk kortere totale reactietijd. Bovendien kan een verdere reductie van het reactievolume de warmteoverdracht te versnellen, dus het verlagen van de benodigde hoeveelheid reagens en kosten [21]. In onze
point-of-care systeem worden pipetteerstappen individuele reagentia geminimaliseerd waardoor er minder foutbronnen en verhogen het comfort voor de eindgebruiker. Daarom is het gebruik van gelyofiliseerde reactiemengsels werd getest om langdurige opslag mogelijk te maken. Aangetoond werd dat Taq polymerase
kan worden beschermd tegen afbraak en verlies van inactiviteit indien bewaard bij 4 ° C, terwijl sommige verminderde activiteit bleek bij opslag bij kamertemperatuur gedurende maximaal vier maanden. Op basis van deze resultaten de reactie mix is geschikt voor opslag in conventionele koelkasten.
Echter op lange termijn studies om te onderzoeken van de houdbaarheid van de reactie mengsels worden momenteel uitgevoerd om te worden uitgevoerd om te zien of Taq
is beschadigd na een langere periode na het droogproces. Ondernemingen de optisch systeem voor fluorescentiedetectie is geïntegreerd in de inrichting, waaruit het probleem van belvorming in het monster gedurende PCR. PCR-mix ontgassen, hoger glycerolgehalte en veranderende hydrofobiciteit zoals voorgesteld door Trung et al. Kopen en Jankowski et al.
[22, 23] heeft dit probleem en incidentele afwijkingen tijdens fluorescentiemetingen niet volledig elimineren waargenomen . Aanpassing van het systeem met een verwarmingsblok of hete lucht ventilator bovenaan de chip met hogere holten kunnen helpen verdamping en daaropvolgende belvorming te voorkomen.
Bij de verdere ontwikkeling van deze inrichting, een on-chip DNA zuiveringsmodule zal worden geïntegreerd in de chip en multiplex reacties met sequentiespecifieke fluorescerende probes te worden om het gebruik van niet-specifieke intercalerende kleurstoffen voorkomen worden vastgesteld. Bovendien zou biomarkertests worden geïmplementeerd in de schilferconstructie, die helpt te karakteriseren en optimaliseren van de gezondheidstoestand van de patiënt en.
Het algemeen een groot probleem voor de behandeling en preventie van parodontitis is dat tot nu standaardstartpagina tandverzorgingsproducten zoals tandenborstels en floss niet volledig elimineren bacteriële plaquevorming en het optreden van de ziekte [9] te voorkomen. Therapeutische maatregelen bijv. chirurgie, het trekken van tanden en uiteindelijk prothesen zijn een enorme financiële last voor patiënten of tandartsverzekering, indien gekocht. Bij elkaar genomen, dit toont het belang van het ontwikkelen van een snelle toe te passen, betrouwbaar systeem point-of-care voor de diagnose en kwantitatief onderzoek naar de parodontale infecties met het oog op de onmiddellijke uitvoering van de optimale gezondheidszorg plan dat ter beschikking staat te vergemakkelijken en voor de diagnose stadium van de ziekte. Socransky et al.
[10] toonden 1998 in hun complexe theorie dat er typische vroege en late kolonisten in de parodontale progressie van de ziekte, met vermelding van verschillende manifestaties van parodontitis die respectieve geïndividualiseerde behandeling.
Te weten te komen over de microbiële samenstelling van subgingivale monsters van patiënten, tandartsen hebben meestal om plaque monsters op te sturen naar een klinisch laboratorium. Teelt, immunologische, of DNA-probe-analyse en onlangs gevoeliger nucleïnezuur gebaseerde test systemen zoals de microIDent® (Hain Lifescience, Nehren, Duitsland) kan informatie voor een optimale therapie leveren, maar nog steeds met de noodzaak en de kosten van verzending naar laboratoria [24 ]. Ondernemingen de eenvoudige, model point-of-care systeem hier gepresenteerde, die gemakkelijk in elke tandartspraktijk kan worden toegepast, vermindert de tijd en kosten voor diagnose en elimineert de noodzaak voor het vervoer naar externe laboratoria en maakt daarom van cruciaal belang snel behandelingen in de toekomst. Bovendien kan de chip worden aangepast en gebruikt voor verdere toepassingen in de medische gebieden met een behoefte aan snelle detectie en analyse van pathogenen, zoals het veroorzaken van sepsis of regionale /wereldwijde pandemie.
Beschikbaarheid van ondersteunende gegevens
aanvullende gegevens van aanvullende file 1: Table S1, extra file 2: Tabel S2 en extra file 3: Tabel S3 ondersteuning van de methoden en resultaten van dit artikel worden opgenomen in de aanvullende Excel-bestanden
Afkortingen
BSA:.
Bovine serumalbumine
CP:
Crossing punt
PCR:
Polymerase kettingreactie
PC:
Polycarbonaat
PEG:
Polyethyleenglycol
verklaringen
Dankwoord
Dit project werd gesteund door het federale ministerie van Economische zaken en Energie (AIF-project KF2302705AK1). Verder danken wij Dr. David M. Smith voor opbouwende kritiek en de herziening van het manuscript logo VPRO AccessThis artikel wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http:.. //Creativecommons org /licenties /by /4. 0 /), die het mogelijk maakt onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elke vorm, mits je de juiste krediet te geven aan de oorspronkelijke auteur (s) en de bron, een link naar de Creative Commons licentie, en aangeven of wijzigingen zijn aangebracht. De Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http: //creativecommons org /publicdomain /zero /1 0 /.) Is van toepassing op de ter beschikking gestelde in dit artikel, tenzij anders vermeld data
Extra. bestanden
Extra file 1: Tabel S1. Organismen en teeltomstandigheden. (XLSX 11 kb) Extra file 2: Tabel S2. Primersequenties en product grootte. (XLSX 12 kb) Extra file 3: Tabel S3. Kruispunten (CP) gevonden volgens Fig. 5 (XLSX 10 kb) Concurrerende belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.
Auteurs bijdragen
CG opstellers van het manuscript, met KN uitgevoerd vriesdrogen experimenten en PCR-on-a-chip samen . LG heeft bijgedragen aan Southern Blot analyse en JB, NL, LR betrokken zijn geweest bij real-time PCR-experimenten. CB hielp met de montage van het apparaat en de software voor PCR-analyse ontwikkeld. KV en DK bedacht het project, namen deel aan het ontwerp en de coördinatie. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
