Abstracte achtergrond
West Virginia heeft de slechtste mondgezondheid in de Verenigde Staten te karakteriseren, maar de redenen hiervoor zijn onduidelijk . Deze pilot-studie onderzocht de oorzaak van dit verschil met behulp van cultuur-onafhankelijke analyses om bacteriële species geassocieerd met orale ziekte te identificeren.
Methods
bacteriën in subgingivale plaque monsters van twaalf deelnemers in twee onafhankelijke West Virginia dental-gerelateerde studies werden gekarakteriseerd met behulp van 16S rRNA gen sequencing en Human Oral analyse Microbe Identificatie Microarray (HOMIM). Unifrac analyse werd gebruikt om fylogenetische verschillen tussen bacteriële verkregen van plaque van de deelnemers met een lage of hoge orale ziekte, die verder werd geëvalueerd met behulp van clustering en Principal Coördinaat analyse te karakteriseren.
Resultaten
Statistisch verschillende bacteriële handtekeningen (P
& lt; 0,001) werden geïdentificeerd in subgingivale plaque van individuen met een lage of hoge orale ziekte in West-Virginia op basis van 16S rRNA gen sequencing. Low ziekte bevatte een hoge frequentie van Veillonella
en Streptococcus
, met een matige aantal Capnocytophaga
. High ziekte vertoonden aanzienlijk toegenomen bacteriële diversiteit en is inclusief een groot deel van de Clostridiales cluster bacteriën (Selenomonas
, Eubacterium, Dialister
). Fylogenetische bomen gebouwd met behulp van 16S rRNA-gen sequencing onthulde dat Clostridiales werden herhaald kolonisatoren in plaque geassocieerd met hoge orale ziekte, waaruit blijkt dat de orale omgeving een of andere manier de bacteriële handtekening in verband met de ziekte beïnvloedt.
Conclusies
Cultuur-onafhankelijke analyses geïdentificeerd een atypische bacteriële handtekening geassocieerd met een hoge orale ziekten in West Virginians en het bewijs geleverd dat de orale omgeving beïnvloed deze handtekening. Beide bevindingen geven inzicht in de etiologie van de mondelinge ongelijkheid in West Virginia
Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel. (Doi:. 10 1186 /1472-6831-11-7) bevat aanvullend materiaal , die beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers. achtergrond
West Virginians hebben de slechtste mondgezondheid in het land, met bijna het dubbele van het nationale gemiddelde (48,2%) van de volwassenen 65 1 jaar of meer hebben al hun natuurlijke tanden gewonnen [ ]. Deze statistieken worden alarmerend wetenschap die infecties van de mondholte zijn geassocieerd met chronische ziekten, zoals diabetes, hart- en vaatziekten en atherosclerose [2-4]. Noch de oorzaak van een slechte mondgezondheid in West Virginia, noch haar relatie met systemische ziekte wordt begrepen. Centraal voor dit probleem is een bepaling van de microbiële populaties belast orale infecties. Historisch gezien moeilijk geweest vanwege de complexiteit van de microbiome in orale biofilms, en moeilijkheden bij het kweken bacteriën verkregen uit de orale omgeving.
Biofilms een beschermende (probioticum) of pathogene rol speelt, hetzij in orale gezondheid afhankelijk van de microbiële samenstelling . Orale biofilms worden geïnitieerd door kolonisatie van probiotische Gram-positieve kokken, streptokokken in de eerste plaats, die vastzit aan het tandoppervlak, samen met coaggregating Actinomyces Kopen en Veillonella
[5]. Coaggregation is gemeengoed in plaque ontwikkeling en vroege koloniserende bacteriën worden overbrugd door middel van bacteriën, zoals Fusobacteriën, te laat kolonisators. De successie van microbiële populaties van vroeg koloniserende Gram-positieve coccen late koloniserende Gram-negatieve anaëroben diverse morfotypen leidt tot een verschuiving van biofilm samenstelling die correleert met het optreden van gingivitis en periodontitis [6]. Specifieke organismen zijn verbonden met orale aandoeningen. Tandcariës optreedt als gevolg van een verschuiving in de biofilm Gemeenschap voor acidogene en zuurtolerante bacteriën, in het bijzonder Streptococcus mutans Kopen en lactobacillen [7]. In subgingivale plaque, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia Kopen en actinobacillus actinomycetemcomitans
sterk zijn geassocieerd met parodontitis [8, 9]. Tot voor kort waren associaties microben met orale ziekten gebaseerd op in vitro kweek. Zoals het nu wordt erkend dat slechts ongeveer 60% van de soorten in orale biofilms zijn bebouwbare [10], is het gebruik van de cultuur-onafhankelijke analyses heeft geleid tot een nieuw niveau van begrip van mondelinge bijbehorende microben [11].
Moleculaire analyses parodontale microflora nog niet eerder gebruikt om de bacteriële profiel van subgingivale plaque West Virginians onderzoeken. Het doel van dit onderzoek was om te gebruiken 16S rRNA gen analyses om inzicht te krijgen in het ontstaan van de mondgezondheid verschillen waargenomen in deze populatie. In deze voorstudie waren we in staat om significant verschillend 16S bacteriële fylogenetische handtekeningen identificeren rRNA in plaque van individuen met een hoge of lage orale ziekte, en de handtekening hoge ziekte was duidelijk in twee onafhankelijke populaties die een breed scala aan leeftijdsgroepen overspannen. Over het algemeen vonden we dat de gemeenschappen rijk aan Veillonella Kopen en streptokokken verschoven naar gemeenschappen rijk aan Selenomonas en overig Clostridiales in combinatie met een daling van de mondgezondheid, mogelijk koppelen van een atypische bacteriële handtekening met orale ziekte in West Virginians. De vaststelling dat een atypische bacteriële handtekening kan worden gekoppeld aan orale gezondheid verschillen waargenomen in West-Virginia wijst op de noodzaak van verdere analyses van bacteriële soorten geassocieerd met een hoge en lage orale ziekte bij deze populatie om de oorsprong van deze verschillen te begrijpen.
methoden
Onderwerp populatie
Subgingivale plaque monsters die in deze studie werden in combinatie verkregen met twee onderzoeksprojecten uitgevoerd in West Virginia. Plaque van een leeftijd 23-48 populatie werd verkregen door middel van het Center for Oral Health Research in Appalachia (COHRA studie), een samenwerkingsverband tussen de Universiteit van West Virginia en Universiteit van Pittsburgh onderzoeken genetische, epidemiologische, microbiologische en gedragsmatige factoren die bijdragen tot de mondgezondheid. Plaque van een oudere populatie werd verkregen door middel van de Oral Health Verschillen Onder Elders met en zonder Cognitive Impairment (Cognitive studie), uitgevoerd in samenwerking met de Universiteit van West Virginia School voor Tandheelkunde en het Center on Aging. We kozen ervoor om onderwerpen uit twee onafhankelijke West Virginia bevolking zwembaden (gemiddelde leeftijd 23-48 of leeftijd & gt; 70) op te nemen in ons onderzoek om te helpen uit te breiden een goed begrip van de relevantie van onze bevindingen aan een breed monster van de West Virginian bevolking. Gefinancierd als proefproject, relatief weinig onderwerpen uit elke groep konden worden geanalyseerd. Alle procedures werden uitgevoerd met behulp van Institutional Review Board goedgekeurd protocollen.
Onderwerp evaluaties
Criteria voor de mondelinge evaluatie gezondheid, de wijze van plaque collectie van de deelnemers, en kalibratie van onderzoekers in de COHRA project zijn eerder beschreven [12]. Onze studie onderzocht subgingivale plaque zeven COHRA deelnemers, welke werd verkregen uit vier molaren (# 3, 14, 19 en 30). Dezelfde plaatsen werden beoordeeld op pocketdiepte (PD), recessie en bloeding na sonderen (BOP), zoals samengevat in Tabel 1. Cariës beoordeling was gebaseerd op het coronale tandoppervlakken en tanden werden geclassificeerd als geluid, vervallen, gevuld of ontbreekt. Procent geluid tanden per deelnemer in tabel 1. Orale status van COHRA proefpersonen werd bepaald op basis van parodontale onderzoeken (begrensd door stippellijnen in tabel 1): laag ziekte gedefinieerd als & lt; 3,5 mm PD, 0-25% BOP plaatsen; hoge ziekte gedefinieerd als & gt; 4,5 mm PD, 100% BOP sites. Subgingivale plaque werd bemonsterd met een curette, gesuspendeerd in 100-500 ui TE (10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA) bevattende 20% glycerol en bewaard bij -70 ° C tot bewerking. Meerdere exemplaren van individuele deelnemers werden samengevoegd voor analyses.Table 1 COHRA studie klinische evaluaties
Patient code
DB
DC
DF
DL
DG
DI
DA
Leeftijd
30 jaar
23 jaar
32 jaar
32 jaar
48 jaar
40 jaar
35 y
Sex
F
F
M
F
M
M
F
Race
White
Afr/Am
White
White
Mixed
White
White
Smoker
No
No
Sometimes
No
Yes
Yes
Sometimes
Parodontale 1
|
|
|
|
|
|
(Gemeten op 4 locaties: 3,14,19,30)
|
|
|
|
|
|
|
Tastertechniek diepte (gemiddeld mm /site)
& lt; 3,5
& lt; 3,5
4,5
4,5
5,2
5,2
5,2
Recessie (% positive/site)
0
0
0
25
0
75
100
Bleeding Op indringende (% van de sites)
25
0
100
100
100
100
100
Gingivitis - localized
0
0
0
0
0
0
0
generalized
0
Yes
Yes
0
0
0
0
hyperplasia
0
0
0
Yes
Yes
Yes
Yes
Cariës
|
|
|
|
|
|
|
kunstgebit (onder /boven)
0
0
0
0
0
0
0
Sound tanden (% van 28 tanden)
64,3
78,6
92,9
53.6
78,6
67,9
50
1 Binnen de lijnen grenzen aan klinische parameters gebruikt om de mondelinge status van COHRA deelnemers aan de studie te bepalen.
Cognitive studie deelnemers werden geselecteerd op basis van: 1) de leeftijd van 70 jaar en ouder, 2) inwoner van West Virginia, 3) gemeenschap wonen, en 4) dentate (op ten minste vier natuurlijke tanden). Mondelinge evaluaties werden uitgevoerd door gekalibreerde onderzoekers met behulp van richtlijnen en protocollen van de National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES IV) [13]. Subgingivale plaque werden verzameld met behulp van steriele parodontale curettes zes gebieden als volgt: de buccale oppervlak van de voorste molair in elk kwadrant en het buccale oppervlak van # 11 en # 31. Plaquemonsters werden opgeslagen en samengevoegd voor analyse zoals hierboven. Criteria voor parodontale evaluatie in het Cognitive studie omvatte PD, gingivitis en tandsteen. Cariës evaluatie opgenomen soort van kunstgebitten en percenten geluid, het missen, gevuld, rotte of gekroond tanden. Beide evaluaties worden weergegeven in Tabel 2. De orale status van cognitieve proefpersonen werd bepaald op basis van cariës onderzoeken (begrensd door stippellijnen in tabel 2): laag ziekte gedefinieerd als & gt; 60% geluid /vol tanden aanwezig; hoge ziekte gedefinieerd als & gt; 40% tanden ontbreken of decayed.Table 2 Cognitive studie klinische evaluaties
Patient code
DT
DQ
DV
DAA
DZ
Age
74
93
77
91 y
77 y
Sex
F
F
M
F
F
Race
Afr/Am
White
White
White
White
Smoker
No
No
No
Yes
No
Parodontale
|
|
|
|
|
(aantal tanden gesondeerd)
22
26
22
nd1
10
Tastertechniek diepte (gemiddelde
|
|
|
|
|
mm /site)
3.01 ± 0.53
1.98 ± 0.71
2.45 ± 0.55
nd
1,66 ± 0,41
gingivitis (% positief sites)
68.2
4,5
9.1
nd
80
Calculus (% positief sites)
0
0
4,5
nd
30
cariës
|
|
|
|
|
kunstgebit (lagere)
0
Gedeeltelijke
0
0
0
kunstgebit (boven)
0
0
Gedeeltelijke
Gedeeltelijke
Volledige
Tooth-index (% van de 32 tanden)
|
|
|
|
|
Sound
59.4
31.3
40.6
37.2
21.9
Missing
31.3
15.6
31.3
40.6
65.6
Filled
6.25
40.6
18.8
15.6
9.4
Decayed
3.1
0
0
6.3
3.1
Crown
0
12.5
9.4
0
0
1no parodontale onderzoek gegevens werden verkregen voor DAA.
2Dashed lijnen grenzen aan klinische parameters gebruikt om de mondelinge status van Cognitive deelnemers aan de studie te bepalen.
DNA-extractie en 16S rRNA gensequentie-analyse
DNA werd geëxtraheerd en gezuiverd uit subgingivale plaque met de UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO Bio Labs, Carlsbad, CA). Het 16S rRNA-gen werd met PCR geamplificeerd met behulp van de universele bacteriële 16S rRNA primers (voorwaarts, 5'- GAGTTTGATYMTGGCTCAG, omgekeerd, 5'-GAAGGAGGTGWTCCADCC [14]). Elk PCR reactie bevatte 1 pl gezuiverd DNA, 0,4 uM universele voorwaartse en achterwaartse primers, 5 ui 10X platina PCR-buffer, 1,5 mM MgSO 4, 0,2 mM dNTPs en 0,5 pi Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, Life Technologies Corp , Carlsbad, CA). PCR-omstandigheden waren: 94 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 45 seconden, 60 ° C gedurende 45 seconden en 72 ° C gedurende 90 seconden, met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 15 minuten. PCR producten werden geanalyseerd door 0,8% agarose gelelektroforese en reacties waarbij producten van ~ 1500 bp werd gekloneerd met behulp van de TOPO TA Cloning Kit voor sequentiebepaling (Invitrogen). Ligatieproducten werden geëlektroporeerd in Escherichia coli
(TOP10 chemisch competente cellen, Invitrogen) en transformanten werden geïncubeerd in 250 gl SOC medium (2% trypton, 0,5% gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 10 mM MgClz < sub> 2, 10 mM MgSO 4, 20 mM glucose) gedurende 1 uur bij 37 ° C, voorafgaand aan uitplaten op LB-agar dat 50 ug /ml kanamycine en 25 gl bekleding van 2% X-gal. Na incubatie overnacht, ~ 100 kolonies die inserties (witte kolonies) werden geïsoleerd uit elk monster en gekweekt bij 37 ° C geïncubeerd in 96 well platen met LB-bouillon met 50 ug /ml kanamycine. Een 2 pl volume van bacteriecultuur uit elk putje werd met PCR geamplificeerd met gebruikmaking van M13-primers (voorwaarts, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT, reverse 5'-CAGGAAACAGCTATGAC). Reacties bevatten 0,2 uM van elke primer, 5 ui 10X PCR buffer Qiagen (Qiagen, Valencia, CA), 0,2 mM dNTP en 0,2 pi Taq DNA-polymerase (Qiagen). PCR-omstandigheden waren: 94 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 45 seconden, 52 ° C gedurende 45 seconden en 72 ° C gedurende 90 seconden, met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 15 minuten. PCR producten van elk putje werden onderzocht door elektroforese en producten van de juiste grootte werden gesequenced door een commerciële faciliteit (SeqWright, Houston, TX).
16S rRNA gensequentie analyse
Elk DNA-sequentie werd gescand op een enkel segment van de oorspronkelijke primersequentie (ATCAAACT) tussen bp 440 en 520 aan de 16S rRNA gen te identificeren en te helpen uit te sluiten hersenschimmen. Het eerste gedeelte van elke sequentie die ongewenst basen (N) werd verwijderd, waarbij het distale gedeelte (vectorsequentie) werd geknipt op de primer en de sequentie werd omgekeerd om standaardrichting. Nucleotidesequenties die uit dit onderzoek zijn gedeponeerd in GenBank, de toetreding nummers HQ894465 -. HQ895588
sequenties werden ingedeeld BLASTN analyse tegen zowel een lokale database en de GenBank niet-redundante (nr) database. De lokale database werd geassembleerd in een iteratieve proces: als er een nieuwe experimentele reeks komt niet overeen met & gt; 98% identiteit, werd een nieuwe database samengesteld toevoegen matching soort sequenties verkregen van GenBank en de Ribosomaal Database Project (RDP) [15]. De huidige lokale database bevat 375 sequenties georganiseerd in 122 'groepen'. Elke groep nauw verwante sequenties en is gevalideerd niet overlappen door BLAST analyse van afzonderlijke groepen tegen de gehele database zijn. Deze aanpak leverde een mate van gedetailleerdheid die informatief voor de indeling van bacteriële sequenties was. Software die in sequentie analyses omvatten: 1) BLAST, met de NCBI server [16] met resultaten opgemaakt als XML; 2) UniFrac, met behulp van de server [17, 18]; 3) fylogenetische boom bouw, met behulp van de RDP-server; 4) lokale BLAST, met behulp van de 'legacy' executable blastall van NCBI [19]. Andere software run lokaal inbegrepen: R [20] en de Analyse van Phylogenetics en Evolution (APE) pakket voor de aanleg en het plotten van fylogenetische bomen en het uitzetten van de Principal Coordinate Analysis (PCOA); ClustalW2 [21] en spier [22] voor multiple sequence alignment; en Python [23] om te stappen in de analyses te automatiseren en produceren van de heatmaps (gegenereerd met behulp van matplotlib).
Human Mondelinge Microbe Identificatie Microarray (HOMIM) analyse
Voor HOMIM 16S rRNA-gen microarray-analyse, gezuiverd DNA uit subgingivale plaque monsters werd naar de HOMIM Core Facility op Forsyth Institute (Boston, MA). Deze faciliteit biedt een hoge throughput analyse van ~ 300 van de meest voorkomende orale bacteriële soorten en biedt een uitgebreid verslag van de bacteriële profielen binnen DNA-monsters [24].
Resultaten en discussie
Identificatie van bacteriële populaties in subgingivale plaque dat individuen onderscheiden met een hoge of lage orale ziekte in West Virginia
Vorige studies gevonden soorten bacteriën in de 'rode complex' sterk samen te hangen met parodontitis [25]. Om te onderzoeken of deze zelfde bacteriën werden geassocieerd met orale ziekten in West Virginia, gebruikten we 16S rRNA gensequentie om bacteriën in subgingivale plaque van COHRA deelnemers gediagnosticeerd als lage of hoge orale ziekte gebaseerd op parodontale onderzoek (Tabel 1, begrensd door stippellijnen karakteriseren ). Analyses werden uitgevoerd in 96-well plaat formaat, en door de relatief hoge kosten van DNA sequentiebepaling ons praktische doel was om 96 klonen per reeks monsters, beseffen dat we niet in staat bacteriële soorten in lage frequentie detecteren. In werkelijkheid het aantal klonen gesequenced per monster varieerde 55-133, met lage aantallen ten gevolge van problemen verkrijgen van hoge kwaliteit sequenties voor een aantal monsters. Verkregen sequenties werden geanalyseerd door BLAST tegen GenBank database die alle bekende bacteriële 16S rRNA gen sequenties bevat, en met een lokale gegevensbank die indeling van bacteriële 'types' op basis van ≥95% sequentiegelijkheid vergemakkelijkt. Verdere evaluatie van de reeks gegevens met behulp van de Human Microbiome Oral Database (HOMD) BLAST server [26] leverde bijna identieke resultaten, met uitzondering van een paar veranderingen veroorzaakt door herclassificatie van Clostridiales type stammen, die een aantal opdrachten Kopen en Lachnospiraceae Eubacterium beïnvloed.
De eerste fase van sequencing onderzocht 2 laag (DB en DC) en 5 hoog (DF, DL, DG, DI, DA) ziekte COHRA deelnemers. Een extra laag ziekte monster (DM), geëvalueerd op basis van parodontale criteria, werd verkregen door de West Virginia University TandKliniek en diende als een niet-COHRA control laag ziekte. Het percentage van een bacteriële soort in elk monster in verhouding tot het totale aantal klonen gesequenced (aangegeven aan de onderkant van elke kolom) wordt in de heatmap in figuur 1. Zoals eerder gerapporteerd [6], verhoogde bacteriële diversiteit bleek in tandplak individuen gediagnosticeerd met hoge orale ziekte. Echter, onverwacht een groot aantal high ziekte bacteriële soorten werden ingedeeld in de Clostridiales cluster (Selenomonas
, Eubacterium
, Dialister
), die volledig afwezig laag plaque ziekte waren. Ook opmerkelijk in hoge ziekteactiviteit was de lage frequentie van bacteriële soorten traditioneel verbonden met parodontitis (Porphyromonas
, Tannerella
, Treponema Kopen en Aggregatibacter
). Plaque van lage ziekte vertoonde een duidelijk verschillende bacteriële populatie, met inbegrip van met name Streptococcus Kopen en Veillonella hotels met een matig aantal Capnocytophaga
. De bacteriële diversiteit in lage ziekte COHRA monsters was zeer consistent met een recente studie, die Streptococcus
, Veillonella Kopen en Capnocytophaga geïdentificeerd
in 100% van de plaque monsters afkomstig van personen met gezonde orale holtes [27]. Dus, terwijl de bacteriën in verband met mondgezondheid in West Virginia was sterk reflecterende van andere regio's in de Verenigde Staten, een atypische pathogene fylogenetische handtekening die Selenomonas en overig Clostridiales cluster bacteriën bevat leek te worden in verband met de daling van de mondgezondheid in West Virginia. Figuur 1 Identificatie van bacteriële populaties in subgingivale plaque van West Virginians. Bacteriële samenstelling in plaque monsters werd bepaald met behulp van 16S rRNA-gen sequencing in 2 laag en 5 hoge ziekteactiviteit COHRA deelnemers mondeling, gerangschikt op basis van parodontale examens, en 5 Cognitieve deelnemers aan de studie, gerangschikt op basis van cariës index. DM is een lage parodontitis controle monster verkregen door middel van de West Virginia University Dental Clinic. Elk genummerd box geeft het percentage klonen van de typespecifieke bacteriële 16S rRNA gen in verhouding tot het totale aantal klonen de sequentie die is weergegeven onder aan elke kolom. De kleur van de doos weerspiegelt waargenomen telt.
COHRA studie deelnemers varieerden in leeftijd 23-48, and Cognitive studie deelnemers (leeftijd 73-93) verschaft een middel om te beoordelen hoe bacteriële soorten in verband met tooth-status later in het leven. De parodontale gezondheid van de 5 Cognitieve proefpersonen in dit onderzoek was uitzonderlijk goed, zoals blijkt uit sonderen diepte van 3 mm of minder, getoond in tabel 2. Zoals verwacht voor deze tijd, aanzienlijke variatie werd waargenomen in gezondheid cariës (Tabel 2, begrensd door stippellijnen), waarbij DT met het hoogste percentage van gezonde tanden en DAA en DZ met het hoogste percentage ontbrekende /rotte tanden. Onderzoek van bacteriële soorten in subgingivale plaque van DT bleek vooral Veillonella
, Streptococcus Kopen en Capnocytophaga
(figuur 1), zoals waargenomen voor laag ziekte COHRA deelnemers. Ter vergelijking, DAA en DZ had bacteriële patronen die toegenomen diversiteit en soortenrijkdom van Selenomonas
, Eubacterium
Dialister
, in aanvulling op veel van de andere bacteriële soorten waargenomen in hoge ziekteactiviteit COHRA deelnemers orale inbegrepen. Deze gegevens zijn consistent met de bacteriële handtekening van oude West Virginians met tandverlies die overeenkomt met die van jongere West Virginians met parodontitis.
Statistische analyses van bacteriële soorten die in subgingivale plaque
Unifrac analyse [17], waarbij rekening houdend met fylogenetische afstanden, is uitgegroeid tot de methode van keuze voor de analyse van de verschillen tussen microbiële gemeenschappen en werd gebruikt in onze studies statistische validatie van de verschillen in lage en hoge ziekte plaque omgevingen. De werkwijze vereist een geworteld fylogenetische boom als invoer, en we gebruikten de POP server naar de boom, die bijzonder geschikt voor rRNA aanpassingen zoals die zich Infernal werk [28] dat is gebaseerd op de voorspelde secundaire structuur. De boom werd gebouwd door de buurman-toetreding methode [29], met behulp van AAP in R. Het werd verankerd door het opnemen van Thermotoga maritima
SL7 als een outgroup. De Unifrac algoritme werd gebruikt om de unieke fractie van scheutlengtes voor elk monster te berekenen. Deze resultaten (die fylogenetische afstanden scheiden van de individuele monsters) werden geanalyseerd met behulp van clusteranalyse (UPGMA) en PCOA en genegeerd dubbele sequenties. Zoals getoond in Figuur 2A, PCOA gescheiden laag ziekte van zieke monsters in twee clusters langs de eerste eigenvector. Clusteranalyse ook split lage ziekte en zieke monsters in verschillende clades, met voorbeeld DT (gelabeld T in figuur 2), de minst zieke monster op basis van cariës resultaten in de cognitieve studie splitsing van de lage clade ziekte. Steun voor de clusters werd geëvalueerd door jackknife testen (1000 repliceert; Figuur 2B). Bij analyses opnieuw werden uitgevoerd met alle sequenties opnieuw gelabeld als ziek of gezond, Unifrac analyse bleek de twee omgevingen om statistisch verschillend zijn (P Restaurant & lt; 0,001), al dan geen dubbele sequenties werden beschouwd. Figuur 2 Statistische analyses van bacteriële populaties in lage en hoge plaque ziekte. A) Principal coördineren van analyse van bacteriële gemeenschappen subgingivale plaque van West Virginians met lage orale ziekte (blauw) in vergelijking met de plaque van West Virginians met een verschillende mate van orale ziekte (rood). B) De Unifrac algoritme werd gebruikt om de unieke taklengte voor een bepaalde sub-monster te berekenen. Cluster analyse split laag (blauw) en zieke monsters (rood) in verschillende clades. Steun voor de clusters werd geëvalueerd door jackknife testen (1000 herhalingen). T was de minst aangetaste monster in de cognitieve studie, zoals gerangschikt in Tabel 2. De 'D' is verwijderd uit het monster notaties in deze cijfers voor de duidelijkheid.
Analyse van de bacteriële populaties in plaque met behulp van HOMIM analyseert
Aangezien rRNA gen sequentiebepaling onthulde een onverwachte bacteriële plaque ondertekening West Virginians met hoge orale ziekten, vroegen we of dit patroon kan worden gedetecteerd met een alternatieve 16S rRNA gen analyse HOMIM. In HOMIM worden meerdere primers aanvankelijk gebruikt voor 16S rRNA genen in een DNA-monster, die vervolgens worden getest op de aanwezigheid van specifieke 16S rRNA genen middels probes ontworpen om detectie van 272 verschillende soorten bacteriën [30] optimaliseren amplificeren. Unlike 16S rRNA sequentie, die kwantificering van de frequentie van bacteriële klonen toelaat, de uitlezing van HOMIM een relatieve signaalintensiteit voor elke gedetecteerde 16S rRNA sequentie op een schaal van 0 tot 5. In onze studies HOMIM resultaten worden weergegeven als de som van de signalen voor alle orale taxa binnen elk geslacht. Vergelijkingen van HOMIM en DNA sequentieanalyse van plaquemonsters van 4 lage ziekte (DB, DC, DM, DT) en de 5 hoogste ziekte (DA, DI, DG, DZ, DAA) deelnemers in ons onderzoek zijn weergegeven in Figuur 3. HOMIM analyses van plaque van lage ziekte ontdekte een hoge frequentie van Veillonella
, Streptococcus
Capnocytophaga
, op de voet parallel resultaten van 16S rRNA sequencing (figuur 3A). Minder voorkomende bacteriële soorten ontdekt in 16S rRNA sequencing, zoals Gemella
, Fusobacterium
, Actinomyces
, Granulicatella
, Neisseria
en Haemophilus
, werden bevestigd door HOMIM. Extra bacteriële soorten, vermoedelijk bij een te lage frequentie op te sporen door sequencing, werden ook gedetecteerd in lage ziekte door HOMIM, de meest voor de hand daarvan waren Campylobacter
, Prevotella
, Leptotrichia
, Lautropia
Aggregatibacter
. Deze resultaten benadrukken de verschillen die kunnen worden waargenomen tussen de DNA-sequentie en HOMIM door methodologieën in HOMIM dat de gevoeligheid van detectie van specifieke bacteriële species te verhogen met 10 maal. Figuur 3 Vergelijking van 16S rRNA-gen geanalyseerd middels sequencing en HOMIM. De frequentie van bacteriële soorten (in percentage), bepaald door 16S rRNA sequentie van 4 plaquemonsters lage ziekten en 5 plaquemonsters van hoge ziekte West Virginians, gerangschikt op basis van criteria van Materialen en Werkwijzen, werd vergeleken met de microarray signaalintensiteit verkregen uit dezelfde monsters HOMIM analyses. Bacteriële soorten boven de rode streep kwamen vaker voor bij lage ziekte.
In plaque van individuen met een hoge ziekte, HOMIM analyses bevestigde de aanwezigheid van geslachten uit de Clostridiales orde, met inbegrip van Selenomonas
, Eubacterium Kopen en Dialister
(Figuur 3B). Met name, zoals bij sequentiedata, bacteriën in het "rode complex waren ofwel afwezig of aanwezig in lage niveaus in HOMIM analyses. Net als bij lage ziekte plaque, onevenredig hoger signalen voor bepaalde bacteriën, in het bijzonder Campylobacter
, Prevotella
Leptotrichia
, werden waargenomen in HOMIM analyse ten opzichte van sequencing, wederom verklaard door de verhoogde gevoeligheid van microarray detectie methodieken. Belangrijk is dat conclusies uit HOMIM analyses bevestigd die uit 16S rRNA sequencing, en geïdentificeerd verhoogde genus rijkdom en hoge intensiteit signalen voor Selenomonas
, Eubacterium Kopen en Dialister
in combinatie met een daling van de mondgezondheid.
Origin van bacteriële soorten in hoge plaque ziekte
fylogenetische bomen van bacteriële types ontwikkeld met behulp van 16S rRNA sequencing ook voorzien van inzicht in het ontstaan van bacteriële handtekeningen geassocieerd met een hoge orale ziekten. Bijvoorbeeld, een vergelijking van 16S rRNA gensequenties bleek dat diverse Selenomonas
spp. waren eigenlijk herhaalde kolonisatoren van de hoge ziekte orale omgeving. De 16S rRNA structuur weergegeven in figuur 4 toont de grote diversiteit van Selenomonas
phylotypes teruggewonnen in één plaque monster uit een subject met plagen (DA). Daarentegen dezelfde clade in een monster van een lage ziekte subject (DB) bevatte slechts lage diversiteit Veillonella
phylotypes. De orde Clostridiales heeft een fylogenetische opdracht de Firmicutes (typisch Gram-positief), maar er is een grote familie, de Veillonellaceae die obligaat anaërobe dat vlekken Gramnegatieve door een poreuze pseudo-buitenmembraan zijn. Lage ziekte Veillonella
hebben bijna identieke sequenties typisch een enkele soort (& gt; 97% 16S rRNA gensequentie identiteit), zoals weergegeven in figuur 4. In onze studies hebben wij de strakke cluster van Veillonella
waargenomen bij lage ziekte werd in plaque van de hoge ziekte vervangen door een brede uitbreiding van andere leden van de familie Veillonellaceae, zoals Selenomonas Kopen en Dialister
. Tegelijkertijd in hoge ziekte was een uitbreiding van Gram-positieve Uit de Clostridiales, vooral in de families Eubacteriaceae en Lachnospiraceae. De breedte van deze bacteriële groep groot is (ten minste ~ 85% identiteit), en deze lieten zien dat Clostridiales werden herhaald kolonisators in plaque van individuen met hoge orale ziekten, zoals weergegeven door de fylogenetische diversiteit van Selenomonas
in figuur 4 . Deze bevinding is belangrijk omdat het wijst op de rol van de orale omgeving (in tegenstelling tot in situ evolutie door horizontale genoverdracht) bij het ontstaan van bacteriële handtekeningen geassocieerd met hoge orale ziekten in West Virginia. Figuur 4 Fylogenetische bomen van Selenomonas en Veillonella geïsoleerd uit individuele plaque monsters. 16S rRNA-gen-sequenties uit een eenmalige hoge ziekte plaque monster (DA, rode tekst) en een enkele laag ziekte plaque monster (DB, blauwe tekst) werden gebruikt om fylogenetische bomen van Selenomonas Kopen en Veillonella
genereren, respectievelijk. De x-as geeft procentuele verschil in 16S rRNA gensequentie. De gescheiden clusters van Selenomonas
laten zien dat deze populatie afstammen van onafhankelijk koloniseren maar fylogenetisch verwante bacteriën. Veillonella
van DB tentoongesteld beperkte diversiteit.
Conclusies
De oorzaak van de slechte mondgezondheid leidt tot het hoge verlies van tanden statistieken in West-Virginia is onbekend. Het doel van dit onderzoek was om inzicht te krijgen in dit probleem met behulp van 16S rRNA-gen analyseert om de bacteriële species te karakteriseren in subgingivale plaque van West Virginians met hoge orale ziekte. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
| 