Associatie van een genetisch polymorfisme (-44 C /G SNP) in het menselijk DEFB1 gen met expressie en induceerbaarheid van meervoudige β-defensines in tandvlees keratinocyten

Abstracte achtergrond
Human β-defensines (hBDs) zijn antimicrobiële peptiden met een rol in aangeboren immuunsysteem. Ons laboratorium toonden eerder aan dat een enkele nucleotide polymorfisme (SNP) in het 5 'niet getranslateerde gebied van het gen hBD1 (DEFB1
), aangeduid -44 (rs1800972), gecorreleerd met bescherming orale Candida
. Omdat deze SNP verandert het vermeende mRNA structuur veronderstelden we dat het verandert hBD1 expressie.

Methoden Transfectie van reporter constructen en evalueren van antimicrobiële activiteit en mRNA expressie in keratinocyten van meerdere donors werden gebruikt om het effect van deze evaluatie SNP op constitutieve en geïnduceerde niveaus van expressie.
Resultaten
Transfectie van CAT-constructen die de 5 'onvertaalde gebied toonde dat het -44 G allel leverde een 2-voudige toename in CAT-eiwit in vergelijking met andere gewone haplotypes suggereren een cis
effect op de transcriptie of translatie. De constitutieve hBD1 mRNA niveau menselijke orale keratinocyten was significant groter in cellen van donoren met de -44 GG genotype vergeleken met die van de gemeenschappelijke CC genotype. Verrassenderwijs hBD3 het mRNA niveau als antimicrobiële activiteit van keratinocyten extracten ook gecorreleerd met de -44 G allel. Geïnduceerde niveaus van hBD1, hBD2 en hBD3 mRNA werden onderzocht in keratinocyten blootgesteld aan Toll-like receptor 2 en 4 liganden, interleukine-1β, TNFa en interferon-γ (IFNy). In tegenstelling tot constitutieve expressie, IFNy-geïnduceerde keratinocyten hBD1 en hBD3 mRNA expressie was significant groter in cellen met een gemeenschappelijke CC genotype, maar er was geen duidelijke correlatie tussen genotype hBD2 expressie.
Conclusie Ondernemingen De DEFB1
-44 G allel is geassocieerd met een toename van de totale constitutieve antimicrobiële activiteit en expressie van hBD1 en hBD3 op een wijze die verenigbaar is met bescherming tegen candidiasis, terwijl de meer gemeenschappelijke C-allel is geassocieerd met IFNy induceerbaarheid van deze β-defensines en waarschijnlijk beschermend omstandigheden die IFNy expressie te bevorderen zoals chronische periodontitis is. Deze resultaten wijzen op een complexe relatie tussen genetica en defensin uitdrukking die parodontale gezondheid en aangeboren immuunrespons kan beïnvloeden
Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi:.. 10 1186 /1472-6831-9 -21) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers. achtergrond
de gezondheid van mucosale oppervlakken, de mondholte en de huid wordt gehouden door een complex evenwicht tussen commensale en pathogene organismen en afweer [1- 4]. Epitheliale cellen brengen meerdere antimicrobiële peptiden die fungeren als een eerste lijn van verdediging en helpen om deze microben in evenwicht te houden (beoordeeld door Dale en Fredericks [5]). Naast het functioneren als antimicrobiële agentia, deze peptiden hebben immunomodulerende eigenschappen en dienen als verbindingen tussen de aangeboren en verworven immuunsystemen. Bijvoorbeeld, het β-defensines fungeren chemokines en signalering moleculen op antigeen presenterende cellen [6, 7] en dus functioneren breder in de afweer als initiators van het verworven immuunsysteem.
Dan 30 menselijke β-defensines genen geïdentificeerd [8], hebben echter de meeste studies gericht op hBD1, -2 en -3, worden uitgedrukt in de mondholte [9-14], skin [15], darmen en andere epithelia [16-18]. HBD2 en hBD3 geïnduceerd door verschillende bacteriële bestanddelen en cytokinen, terwijl hBD1 constitutief tot expressie wordt gebracht [5]. Toch is de mate van expressie hBD1 varieert tussen individuen en er is gesuggereerd dat dit verschil wordt veroorzaakt door genetische verschillen in de DEFB1
gen dat codeert hBD1 [12, 13, 19]. Dit type variatie is belangrijk bij de functionele diversiteit die de regulering van aangeboren immuunsysteem grondslag en blijkt in veel onderdelen van het aangeboren immuunsysteem [20].
Groeiend bewijs verbindt antimicrobiële peptiden met resistentie of gevoeligheid voor infecties en ziektegevoeligheid mucosale [18, 21-23]. Zo niveaus van hBD2 en LL-37 zijn laag bij personen met atopische dermatitis [24] en LL-37 en α-defensines slecht uitgedrukt in een ernstige genetische vorm van parodontitis [25]. Twee typen van genetische polymorfismen zijn geïdentificeerd in de genen die coderen defensines, kopienummer polymorfismen (CNPs) en single nucleotide polymorphisms (SNPs). Kopieaantal polymorfisme in het α-defensine gencluster is geassocieerd met expressieniveau in neutrofielen [26, 27]. Lage expressie van zowel α - en β-defensines worden geassocieerd met specifieke vormen van de ziekte van Crohn en low-β defensinegenen kopienummer stijgt gevoeligheid voor de ziekte van Crohn colon [28, 29]. Meerdere SNPs binnen de DEFB1
gen [30-33] zijn ook in verband gebracht met gezondheidsrisico's. Vorige werk in ons laboratorium is gebleken dat een C → G SNP in de DEFB1
5 'onvertaalde gebied (UTR) op positie -44 ten opzichte van het eiwit augustus initiatieplaats (SNP rs1800972) is gecorreleerd met lage orale niveaus van de gemeenschappelijke gist Candida albicans
[34]. Dit SNP is ook geassocieerd met bescherming tegen chronische obstructieve longziekte [35] en verticale overdracht van HIV-infectie [36-38], en de ziekte van Crohn [39]. In de huid deze SNP geassocieerd met atopische dermatitis [40] terwijl hoog kopieaantal in het β-defensine gencluster het risico van psoriasis [41] vergroot. Ondernemingen De doelstelling van deze studie was om de associatie van de DEFB1 -44 SNP en expressie van hBD1 in orale keratinocyten. We gebruikten twee onafhankelijke methodes om het effect van deze SNP op constitutieve niveaus van eiwit en /of mRNA-expressie en de antimicrobiële activiteit van epitheliale celextracten geëvalueerd. We evalueerden ook de vereniging van deze SNP met expressie van constitutieve en geïnduceerde niveaus van hBD2 en hBD3 die worden gecodeerd door genen in een cluster in de buurt van de DEFB
1-gen op chromosoom 8p22-23 [42]. Onze resultaten tonen aan dat de -44 SNP is geassocieerd met verhoogde expressie van hBD1 en hBD3 en de DEFB1
-44 SNP heeft een complex effect op expressie en induceerbaarheid van verschillende β-defensines.
Methods
humane orale keratinocyten (Hoks)
menselijke orale keratinocyten (Hoks) werden bereid uit meerdere individuele donateurs in overeenstemming met een goedgekeurd protocol Universiteit van Washington Institutional review Board. Orale cellen werden verkregen en gekweekt zoals eerder beschreven [12]. In het kort, primaire epitheliale cellen van gingivaweefsel werden gekweekt in keratinocyten basaal medium (KBM, Cambrex Bioscience, Walkersville, MD) met keratinocyten groeimedium (KGM) supplementen in 0,03 mM Ca 2 + drie passages, vervolgens verhoogd tot ofwel 0,15 mM of 0,6 mm Ca 2 + om differentiatie te induceren. Cellen werden geoogst voor DNA of RNA na groei gedurende nog 48 uur en geoogst voor eiwit na 96 uur zoals hieronder beschreven. Voor geïnduceerde kweken cellen bij 80% confluentie werden gestimuleerd met 100 ng /ml eindconcentratie van Escherichia coli
lipopolysaccharide (LPS) (Sigma, St. Louis, MO), PAM3CSK4 (Invitrogen, San Diego, CA), interleukin1β (IL1β , Cell Sciences, Canton, MA), TNFa (Cell Sciences), en interferon-γ (IFNy, Cell Sciences) voor 18 uur in 0,15 mM Ca 2 vervolgens geoogst voor RNA, de E. coli
serotype 0127: B8 LPS werd verder gezuiverd door fenolextractie zoals eerder beschreven [43]
Genotypering
Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit Hoks (DNeasy weefsel kit, Qiagen, Valencia, CA) en de concentratie gemeten door absorptie Nanodrop (. ThermoScientific, Wilmington, DE). HBD1 de 5 'UTR sequentie werd in de Dept. Genome Sciences, University of Washington, met dank aan Dr. Robert Livingston of Polymorphic DNA Technologies Inc. (Alameda, CA) onder gebruikmaking van primers die specifiek zijn voor exon 1 (tabel 1) .table 1 Oligonucleotide PCR-primers gebruikt
Name
Sequence

Onthard. Temp.
DNA Sequencing


HBD1 SEQ
AACTCTAGCAGGTACCAGAGCTTACCT
< td>
65

CTAACCTAGAAAACCAAACAGGAGGAG


DEFB1 SNEST

TGAGGCCATCTCAGACAAAA

65

GCTCCAGGCGTAAAGCTAAA



QPCR

Primer Efficiency

HBD1
CACTTGGCCTTCCCTCTGTA
1.91

56

CGCCATGAGAACTTCCTACC


HBD2
GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA

1.98
65

CCAGCCATCAGCCATGAGGGT


HBD3
GTGAAGCCTAGCAGCTATGAGGAT
1.68
60

TGATTCCTCCATGACCTGGAA


RPO
GCCTTGACCTTTTCAGCAAG
2.04
59

GCAGCATCTACAACCCTGAAG



Beta-actine
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT
1.75
63


AGCACTGTGTTGGCGTACAG


Vermeende RNA vouwen
hBD1 mRNA vouwen kenmerken werden geschat met behulp van het programma MFOLD (Rensselaer Polytechnic Institute , Troy, NY) [44].
Plasmide constructen
We bereidden vier constructen die de meest voorkomende haplotypen van de drie bekende hBD1 5 'UTR SNPs (-20, -44, -52) [31] (GenBank toetreding geen. U50930; rs 11.362, 1.800.972, 1.799.946) stroomopwaarts van de chlooramfenicol acetyltransferase (CAT) reporter-gen met behulp van de pc DNA3CAT plasmide (Invitrogen, Carlesbad, CA). Voor details van het plasmide constructie zien Aanvullende bestandsinformatie 1. Een bouwen met de CMV-5 'UTR en een promoter pGEM-NCMV werden gecreëerd en diende als controlegroep. pKTCAT is een promoter CAT reporter plasmide dat de BamHI-Hind III CAT fragment van pSV0 CAT gekloond in de Aatll-Hind III plaatsen van pUCl8 [45] bevat. pcDNA3CAT is een positieve controle CAT plasmide. De constructen met de gemeenschappelijke haplotypes waren: pGEM-ACG (-20 = A, C = -44, -52 = G), pGEM-GCA en pGEM-GGG; een extra construct pGEM-GCG, werd ook bereid als een directe controle van pGEM-GGG, hoewel dit haplotype werd niet waargenomen in de algemene populatie [31].
Celkweek en transfecties
COS-7-cellen werden gekweekt en getransfecteerd als eerder beschreven [46] met gebruik van Lipofectamine Plus reagens (Invitrogen) bij 20 ug /ml. De cellen werden voorbijgaand getransfecteerd met 1 ug van elk van de vijf constructen pGEM, pcDNA3CAT of pKCAT (a promoter pcDNA3CAT) en co-getransfecteerd met pSVβ-gal (Promega, Madison, WI) normaliserende transfectie-efficiëntie mogelijk. Na 4 uren werd foetaal bovien serum tot een eindconcentratie van 10% toegevoegd. Cellen werden geoogst na 48 uur.
CAT en β-galactosidase assays
twee methoden om CAT-eiwitexpressie een radioactieve enzymactiviteitsanalyse en een enzymgekoppelde immunosorbenstest (ELISA) op eiwit kwantificering meten. Eiwitextracten, bereid volgens het protocol van de fabrikant in Reporter Lysis Buffer (Promega) werd gebruikt voor CAT-activiteit assay en β-galactosidase ELISA assay (Promega). Voor de radioactieve CAT enzym assay werden cellysaten bereid met chlooramfenicol (50 uM eindconcentratie) en 14C-butyryl-coenzym A (8,3 uCi /mmol eindconcentratie) (Moravek Biochemicals, Brea, CA) en toegevoegd aan 4 ml Econofluor II scintillatievloeistof (PerkinElmer, Wellesley, MA) (5 ml totaal volume) zoals beschreven door Neumann et al [47]. De radioactiviteit overgedragen aan chlooramfenicol door CAT werd geteld gedurende 0,5 min /buis, en tellingen werden bij 45 min tussenpozen herhaald tijdens de test periode tot telt plateaued. Commercieel CAT enzym (Promega) diende als een positieve controle. CAT-activiteit, zoals bepaald door het aftrekken van de activiteit van schijn-getransfecteerde monsters (geen DNA toegevoegd), werd genormaliseerd tot ß-galactosidase activiteit. CAT en β-galactosidase eiwitten werden gekwantificeerd met behulp van ELISA-bepalingen (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) volgens de instructies van de fabrikant. CAT-eiwit werd genormaliseerd aan P-galactosidase eiwit. Beide methoden voor het evalueren reporter eiwitexpressie werden uitgevoerd in duplo en herhaalde minimaal drie keer. T-toets van de Student's werd gebruikt om de CAT-activiteit niveaus tussen de pGEM-GGG -44 G construct en de andere 5 'UTR -44 C met constructies te analyseren. De Wilcoxon Rank Sum-test werd gebruikt om de CAT eiwitconcentraties indien niet normaal gegevensverspreiding analyseren.
RNA-extractie en real time kwantitatieve PCR (QPCR)
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit cellen HOK behulp van de RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Reverse transcriptie werd uitgevoerd met 500 ng RNA HOK met de RETROscript kit (Ambion, Austin, TX) met oligo (dT) primers volgens het protocol van de fabrikant. Het reactiemengsel bevatte 250 nM oligo (dT) primer, 10 mM deoxynucleoside trifosfaat mengsel, 50 U van reverse transcriptase en 13 U van RNase inhibitor, en buffer. QPCR versterking van de resulterende cDNA werd uitgevoerd voor hBD1, hBD2, hBD3, beta-actine en de huishoud-gen ribophosphoprotein, RPO uitgevoerd. Tabel 1 vermeldt primers gebruikt. QPCR werd uitgevoerd in een MyiQ iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA) met de iQ SYBR ® Green Super Mix (Bio-Rad). Smelt curve analyse bevestigde dat het signaal werd gegenereerd door het verwachte amplificatieproduct. De drempel cycli voor de detectie niveau van hBD1, hBD2, hBD3, en beta-actine werden genormaliseerd aan het huishoudelijk gen RPO en vergeleken onder cellijnen met drie genotypen van het -44 SNP (CC, CG, en GG). De relatieve voudige verandering werd berekend door de Pfaffl methode [48]. Omdat deze werkwijze een standaard voor vergelijking vereist, gebruikten we een referentie bestaande uit mRNA samengebracht uit 4 HOK donoren willekeurig geselecteerd en gecombineerd basislijn voor de hele studie. De resultaten worden uitgedrukt als relatieve voudige verandering voor elk mRNA individueel genotypes vergeleken met deze gecombineerde RNA referentiebasislijn. MRNA expressie data werden log-getransformeerd door niet-normale gegevensverspreiding.
Antimicrobiële bepalingen
Epitheelcel eiwitextracten voor ELISA en microbiële testen werden bereid uit drievoud na confluente celculturen gekweekt in 24-wells platen. De kweken werden gewassen met PBS en geëxtraheerd met ijs extractie koude buffer (50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EGTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 bevattende proteaseremmers (1 mini-protease inhibitor tablet (Roche Applied Science) per 7 ml buffer) met een totaal van 100 pl en opgeslagen in porties. HOK Totaal eiwit werd gemeten met de BCA assay (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL).
hBD-3 peptide in HOK extracten werd bepaald met ELISA ( PeproTech, Rocky Hill, NJ) met behulp van konijnen anti-hBD-3 volgens procedure. Eiwitextracten fabrikant werden verdund 1/20 en standaard hBD-3 peptide (PeproTech) werd verdund, zodat de buffer concentratie equivalent in monster en de standaard peptide verdunningen was .
Radial diffusie test voor de remming van bacteriële groei werd gewijzigd van de beschreven door Lehrer en medewerkers [49] procedure. In het kort, Gram-positieve Staphylococcus epidermidis
UW3 [50] is gegroeid tot mid-log fase en gecentrifugeerd, gewassen en opnieuw gesuspendeerd in 10 mM fosfaatbuffer, pH 7,4. Bacteriën (4 x 10 6) werden aan 10 ml 1% LMP agarose (Invitrogen) bevattende 1% Todd Hewitt bouillon, 10 mM fosfaatbuffer, pH 7,4 toegevoegd en in een vierkant petrischaal. Drie mm putjes werden geponst en 4 pl controle peptide of HOK eiwitextract bevattende 4 ug eiwit per putje toegevoegd. Platen werden gedurende 3 uur bij 37 ° C om het monster te worden opgenomen in de agarose en vervolgens tien ml nutriënt overlay agarose (1% agarose met 200% Todd Hewitt bouillon) werd toegevoegd en de platen geïncubeerd bij 37 ° C overnacht. Platen werden gefixeerd met 10 ml 5% azijnzuur /25% methanol oplossing werd gedigitaliseerde afbeeldingen verkregen met een CCD camera (Alpha Innotech, San Leandro, CA), en de cirkel van clearing gemeten met NIH ImageJ 1,38 u software http: //RSB. info. nih. gov /ij /. De metingen werden gedaan in een geblindeerde wijze. Drievoud HOK eiwitextracten werden getest in duplo. Resultaten werden geanalyseerd door vergelijking van de oppervlakte van het gebied van clearing minus het gebied van de bron voor elk monster.
Statistische analyse
verschillen in mRNA expressie en antimicrobiële werking door radiale diffusie assay tussen de drie -44 SNP genotype groepen waren geanalyseerd one-way variantie-analyse (ANOVA). Nader onderzoek werd uitgevoerd op afzonderlijke groepen door de Dunnett T3 methode [51], die gaat niet uit van gelijke varianties. Voor alle vergelijkingen p ≤ 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
De -44 SNP invloed op de voorspelde structuur van de DEFB1
5 'UTR Ondernemingen De DEFB1
5' UTR bevat de -44 SNP-plaats (rs1800972) en twee extra SNPs (-20, -52 en rs11362, rs1799946). Om te zien of deze SNPs hebben een effect op de mRNA secundaire structuur de voorspelde vouwpatroon en Gibbs vrije energie werd berekend door MFOLD [44] voor hBD1 mRNA gemeenschappelijke sequentievarianten of haplotypes (figuur 1). De vermoedelijke secundaire structuur voor de DEFB1
5 'UTR die de twee meest voorkomende haplotypen, GCA (-52, -44, -20) (figuur 1) en ACG (niet getoond), tonen de -44 site op blootgestelde lussen , maar deze site is begraven in de natuur voorkomende GGG haplotype waarvan de -44 G allel (figuur 1) heeft. De site is ook een blootgestelde lus in het GCG haplotype (niet getoond), die is ontworpen als een directe controle van de GGG haplotype sequentie, maar werd niet waargenomen in de populaties in ons laboratorium geanalyseerd. Deze vermeende structurele kenmerken leidde ons naar de DEFB1 testen
5 'UTR voor effecten op reporter eiwit expressie in een model-systeem Figuur 1 Vermoedelijke secundaire structuur voor de 5' UTR van DEFB1 mRNA. Twee van de vier haplotypen (-52, -44, -20 SNP-plaatsen) van de CAT constructen berekende en getrokken door de MFOLD Quikfold programma. De locaties van de SNP sites zijn verpakt en de -44 SNP sites worden weergegeven in rode dozen. Merk op dat de -44 SNP-plaats in de GGG haplotype in een gehybridiseerde stamstructuur. In contrast, zoals weergegeven door de GCA getoonde constructie, de -44 SNP-plaats is in een lus of niet-gehybridiseerd configuratie in de andere drie haplotypen. Vertaald mogelijke structuren werden verkregen in drie afzonderlijke studies. Secundaire structuren met de laagste Ag (G = Gibbs vrije energie) beoordeeld. De Ag waarden zijn: GCA = -13,5, GCG = -12,8, ACG = -10,5, GGG = -13,9 Ondernemingen De -44 SNP G-allel resulteert in verhoogde reporter eiwit expressie in vitro
Het effect van de DEFB1.
-44 G allel op genexpressie werd geëvalueerd in COS-7 cellen met behulp van constructen met verschillende haplotypen van de DEFB1
5 'UTR gefuseerd aan het CAT reportergen (Figuur 2A). Twee verschillende assays vertoonden grotere CAT expressie voor de pGEM-GGG construct die het -44 G allel. CAT-enzymactiviteit was 1,7 maal (p & lt; 0,01) hoger met pGEM-GGG CAT dan die waargenomen met pGEM-GCA en pGEM-GCG. Het was ook hoger (1,5 maal, p = 0,01) dan de pGEM-ACG construct (Figuur 2B). Evenzo CAT eiwitexpressie zoals gemeten door ELISA toonde dat pGEM-GGG hadden de hoogste expressie in COS-7-cellen in vergelijking met pGEM-GCA (2,8-voudig groter, p = 0,001), pGEM-GCG (1,6-voudig groter, p = 0,036) en pGEM-ACG (1,5 maal hoger, p = 0,047) (figuur 2C). Dus door beide assays, CAT-eiwitexpressie sterk verhoogd in cellen die de G -44 allel in de context van de waargenomen natuurlijke 5 'UTR haplotype, GGG, vergeleken met de twee meest voorkomende haplotypen met -44 C allel, ACG en GCA. Reporter eiwitexpressie in cellen getransfecteerd met de GGG haplotype was ook significant hoger dan de GCG construct, direct 5 'UTR controle aantoont dat de -44 G allel alleen invloed reportergenexpressie. Figuur 2 Effect van 5 'UTR reporter haplotype op eiwitexpressie. A. Schematische voorstelling van reportergen constructen; details van de constructie die in Methoden en Aanvullende bestandsinformatie 1. Pijlen geven SNP sites in hBD1 5 'UTR. Gebogen pijlen geven translatierichting. Licht grijze balken vertegenwoordigen 5 'UTR. Construct namen worden gegeven aan de linkerkant, de SNP haplotypen bestaan ​​uit het laatste deel van de naam. B. en C. CAT-expressie in COS-7-cellen die tijdelijk getransfecteerd met constructen die hBD1 (of CMV) 5 'UTR. CAT-expressie is genormaliseerd aan P-galactosidase. (B) CAT-activiteit gemeten door radioactieve enzymactiviteitsanalyse. Schijn-getransfecteerde (geen DNA toegevoegd) CAT waarden werden afgetrokken en CAT-activiteit werd genormaliseerd tot ß-galactosidase-activiteit verkregen door ELISA enzymactiviteitsanalyse. (C) De hoeveelheid CAT-eiwit werd gemeten door een antilichaam-gebaseerde ELISA en genormaliseerd aan P-galactosidase eiwit. Zwarte balken in B en C vertegenwoordigen constructen die hBD1 5 'UTR met de -44 G-allel. Opgegeven waarden zijn gemiddelden en standaard fouten van 3 of meer experimenten. Statistisch significante verschillen zijn aangegeven met sterretjes vergeleken met pGEM-GGG. *, P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0.001.
Genotypering van primaire humane keratinocyten en de associatie van de -44 SNP met hBD1 mRNA expressie
Om het effect van de DEFB1
-44 SNP in de context van het gehele gen te onderzoeken, humane keratinocyten (HOK) 20-4 onafhankelijke donors werden op de DEFB1
exon 1 sequentie. Zestien cellijnen waren homozygoot bij -44 site voor de algemene allel, C; zes waren heterozygoot op deze site; en twee waren homozygoot voor de -44 G allel (figuur 3). De allelfrequentie waargenomen voor de -44 G allel (0,21) grotendeels overeenkomt met die eerder beschreven [30, 31]. Frequentie van de GG genotype in de populatie wordt voorspeld 4% te zijn gebaseerd op Hardy Weinberg evenwicht, dus waren we het geluk om de GG genotype te identificeren in twee donoren. Alle Hoks met één of meer kopieën van het -44 G allel hadden een genotype overeenstemming met de GGG haplotype voor de -52, -44, -20 SNPs overeenkomstig onze eerdere rapport [31]. Figuur 3 genotypen bij DEFB1 5 'UTR SNP sites uit 24 keratinocyten donoren. Die monsters die werden gebruikt voor verdere studies zijn aangegeven met *.
Twaalf van de HOK donor lijnen die de drie -44 genotypes, 5 CC, 5 CG en 2 GG, werden verder geëvalueerd voor mRNA en antimicrobiële activiteit. Gezien de kleine steekproef beschikbaar en een laag stroomverbruik om de verschillen tussen groepen te laten zien, werden de statistische tests niet te verwachten dat de definitieve resultaten. Niettemin omdat elke donor cellijn in drievoud geanalyseerd en enkele verschillen waren groot, konden we statistisch significante verschillen tussen de groepen tonen verscheidene variabelen. HBD1 mRNA expressie was significant hoger in die cellen met het GG genotype vergeleken met de homozygote algemene allel C in Hoks gekweekt in zowel 0,15 mM (p = 0,021) en 0,6 mM calciumchloride (p = 0,023) en de heterozygote CG genotype (p = 0,024; p = 0,003 in 0,15 mM en 0,6 mM calcium) (Figuur 4A). Ofschoon de steekproef GG genotype klein, cellen met dit genotype aanzienlijk grotere constitutieve hBD1 mRNA expressie. Daarentegen werden beta-actine mRNA niet gecorreleerd met genotype (niet getoond). Figuur 4 Vereniging van constitutieve antimicrobiële genexpressie met de DEFB1 -44 SNP genotype. cDNA werd gemaakt van primaire keratinocyten uit 12 donoren gekweekt in 0,15 mM Ca2 + (links) of 0,6 mM Ca2 + (rechts). QPCR amplificatie van cDNA voor hBD1 (A) en hBD3 (B) en het huishoud-gen RPO uitgevoerd. Alle gegevens werden genormaliseerd naar het huishoud-gen en vergeleken met een afzonderlijke referentie cDNA. De gepresenteerde gegevens zijn log2 getransformeerd en vertegenwoordigen 3 replica voor elke cellijn met dubbele QPCR reacties. De gemiddelde en std. dev. voor elke groep wordt getoond. *, P & lt; 0,05; ** P & lt; 0.01.
Gevolgen van de -44 SNP op de constitutieve niveau van hBD2 en hBD3
Het niveau van hBD2 en hBD3 mRNA waren vastbesloten om mogelijke effecten van de DEFB1 identificeren
-44 SNP op andere β defensine-genen in het chromosoom 8p defensin cluster. Omdat de kweken niet werden blootgesteld aan cytokinen en bacteriële producten, deze waarden de constitutieve niveau van de mRNA's. HBD2 mRNA expressie niet significant gecorreleerd met de DEFB1
-44 SNP in beide groeicondities (p = 0,570, p = 0,577) (niet getoond). Verrassend, vonden we een significante correlatie met de DEFB1
-44 SNP en expressie van hBD3 mRNA in zowel de groei omstandigheden (figuur 4B). De expressie van hBD3 vermeerderd met de -44 G-allel (CC & lt; CG & lt; GG). Hoks met het GG genotype gekweekt in 0,15 mM calcium had een gemiddeld niveau van mRNA hBD3 18-maal hoger dan die met het CC genotype (p = 0,011). In 0,6 mm calcium Hoks met de GG genotype had 16-voudig groter relatieve expressie van hBD3 dan die met het CC genotype (p = 0,002). In beide groeiomstandigheden was significant verschillend van de heterozygote genotype CG groep hBD3 mRNA expressie in de homozygote GG groep. Deze resultaten suggereren dat de -44 G-allel in DEFB1
wordt geassocieerd met een verhoogde hBD3 mRNA expressie.
We het effect van de DEFB1
-44 SNP op hBD3 peptide expressie geëvalueerd ook met ELISA (effectieve reagentia waren niet beschikbaar voor hBD1 en hBD2). Hoks met het GG genotype had een mediaan van hBD3 peptide twee maal groter dan het CC genotype (ANOVA p = 0,014), maar dit was niet statistisch significant meer onderzoek goed voor ongelijke varianties tussen de groepen vanwege de kleine steekproef (niet getoond).
antimicrobiële activiteit verhoogd Hoks de -44 G allel
radiale diffusie assay werd gebruikt om te testen voor de totale antimicrobiële activiteit van HOK-extracten door Staphylococcus epidermidis
UW3, een Gram positieve commensale skin organisme dat eerder is aangetoond gevoelig voor hBD1 (onze niet gepubliceerde resultaten) en hBD3 [52] is. Het gemiddelde oppervlak van clearing verhoogd na -44 G allel (CC & lt; CG & lt; GG) en extracten van cellen met het GG genotype vertoonden significant grotere zones van klaring dan die met het CC genotype (p = 0,04) (Figuur 5). Figuur 5 Vereniging van de DEFB1 -44 SNP genotype met verhoogde constitutieve antimicrobiële werking. Totale cellysaten bereid uit gekweekte keratinocyten (4 ug eiwit) werden toegevoegd aan gestolde agarose met S. epidermidis
. Het gebied van clearing in vierkante mm. minus het gebied van het putje werd berekend en de resultaten vergeleken met genotype. De gegevens stellen 3 herhalingen van elke cellijn en de test werd uitgevoerd in tweevoud. De gegevens zijn log-getransformeerd en het gemiddelde en std. dev. worden getoond.
Interferon-γ-geïnduceerde niveaus van hBD1 en hBD3 mRNA gecorreleerd zijn met genotype
geïnduceerde niveaus van hBD1, hBD2 en hBD3 in Hoks werden geëvalueerd uit de twaalf donoren (5 CC, 5 CG, 2 GG) in de aanwezigheid van LPS en PAM3CSK4 liganden voor TLR4 en TLR2 respectievelijk, evenals IL1β, TNFa en IFNy. HBD1, hBD2 en hBD3 mRNA werden niet opgereguleerd door LPS of PAM3CSK4, zoals verwacht. TNFa en IL1β geïnduceerde hBD2 in sterk variabele hoeveelheden in andere cel donoren niet gecorreleerd met genotype, maar had weinig effect hBD1 en hBD3 mRNA (niet getoond). Daarentegen IFNy stimulatie resulteerde in significante opregulatie van beide hBD1 (p = 0,02) en hBD3 mRNA (p = 0,005) die is gecorreleerd met het genotype met de gemeenschappelijke -44 CC genotype gemiddeld 12-voudige en 100-voudige stijging ten opzichte van niet-geïnduceerde niveaus respectievelijk (Figuur 6). Figuur 6 Vereniging van de DEFB1 -44 SNP genotype met hBD1 en hBD3 mRNA expressie in Hoks geïnduceerd met IFNy. QPCR werd uitgevoerd zoals in Figuur 4. Log getransformeerde gemiddelde en std. dev. zijn getoond. Opmerking toegenomen hBD1 en hBD3 mRNA in het CC genotype. De gegevens stellen 2-3 replica van elke cellijn met dubbele PCR-tests.
Discussie
antimicrobiële peptiden een belangrijke rol spelen als onderdeel van het slijmvlies en de huid aangeboren immuniteit. Derhalve kan genetische variatie die resulteert in gewijzigde peptidenexpressie vatbaarheid voor infecties beïnvloeden. Hier laten we zien dat de DEFB1
-44 G allel is geassocieerd met verhoogde constitutieve expressie van zowel hBD1 en hBD3 mRNA, met verhoogde antimicrobiële activiteit in orale keratinocyten, en verhoogde reporter proteïne expressie in getransfecteerde cellen, wat suggereert dat het GG genotype resulteert in een verhoogde transcriptie van het DEFB1
gen of met verbeterde post-transcriptie gebeurtenissen. We hebben ook het eerste bewijs van een significante relatie tussen de -44 SNP in de DEFB1
gen met expressie van DEFB103
gen dat codeert voor hBD3 in de nabije gencluster te demonstreren. De antimicrobiële functionele test ondersteunt ook meer peptide expressie in keratinocyten extracten. Deze test is niet specifiek voor hBD1 maar het resultaat van verhoogde expressie van andere defensines, waaronder een verhoogd hBD3 peptide kan zijn. Resultaten van ons modelsysteem alsook de keratinocyt uitdrukking gegevens aan dat de DEFB1
SNP -44 G allel is geassocieerd met verhoogde constitutieve antimicrobieel peptide expressie en functie. Aldus is binnen het kader van de β-defensine genen, de -44 SNP geassocieerd is met een directe cis
effect op de expressie van hBD1 en een indirect effect op hBD3 expressie. Samen vormen deze bevindingen suggereren een mechanisme dat genetische studies die een verband tussen de DEFB1 aangetoond
5 'UTR -44 G SNP allel en bescherming tegen verschillende soorten infecties [34-36, 39] ondersteunt. Ondernemingen De benadering Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Previous:Mondgezondheid gerelateerd gedrag onder volwassen Tanzanianen: een nationale pathfinder survey
• Next:De gewijzigde tandheelkundige angstschaal: UK publiek bevolking normen in 2008 met verdere psychometrie en de gevolgen van age