Abstracte achtergrond
Tandplak gevormd op tandoppervlakken is een complex ecosysteem, bestaande uit diverse orale bacteriën en speeksel componenten. Ophoping van tandplaque is een risicofactor voor tandcariës en parodontale ziekten. L-arginine is beschreven dat het risico van tandcariës afnemen verheffen plaque pH door de activiteit van arginine deiminase in orale bacteriën. Hier evalueerden we het potentieel van L-arginine vaste orale biofilms te verwijderen.
Methods
Biofilms werden gevormd middels speeksel vermengd met Brain Heart Infusion-bouillon aangevuld met 1% sucrose in multi-well platen of kunststof schijven. Na wassen van de biofilms met zoutoplossing, citraatbuffer (10 mM, pH3.5) of L-arginine (0,5 M, pH3.5), werden de bewaarde biofilms geanalyseerd door kristalviolet kleuring, scanning elektronenmicroscopie en Illumina gebaseerde 16S rDNA sequencing.
Resultaten
Wassen met zure L-arginine vrijstaande orale biofilms efficiënter dan een zoutoplossing en een aanzienlijk verlaagde biofilm massa vastgehouden in multi-well platen of kunststof schijven. Illumina-gebaseerde microbiota analyse toonde aan dat citraat (pH3.5) bij voorkeur uitgewassen Streptococcus
van volwassen orale biofilm, terwijl zure L-arginine, bereid met 10 mM citraatbuffer (pH3.5) niet-specifiek verwijderd microbiële componenten van de orale biofilm.
Conclusies
Zure L-arginine, bereid met citraatbuffer (pH3.5) effectief gedestabiliseerd en verwijderd volwassen orale biofilms. De zure L-arginine oplossing hier beschreven kan worden gebruikt als een additief dat de werkzaamheid van mond verbetert spoelingen gebruikt in mondhygiëne.
Keyword
L-arginine Biofilm mondspoeling Oral microbiome Speeksel Electronic aanvullend materiaal
online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /s12903-016-0194-z). bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is achtergrond
Er is een groeiend aantal aanwijzingen dat de achteruitgang van de mondhygiëne wordt geassocieerd met parodontitis [1] en een verhoogd risico op hart- en vaatziekten [2, 3], metabool syndroom [4, 5], en premature geboorte [6]. Mondhygiëne zorg wordt ook erkend als een kritische maatregel die de risico's voor de gezondheidszorg-geassocieerde pneumonie (HCAP) vermindert. Orale biofilms kunnen optreden als reservoir voor pneumonie verwante bacteriën, zoals voorgesteld door de gelijkenis tussen orale microbiota HCAP klinische monsters [7-9]. Veel klinische proeven die de werkzaamheid van mondhygiëne onderzocht op profylaxe HCAP, waaronder longontsteking door mechanische ventilatie, gerapporteerd. Deze studies gevonden: (i) mechanische en chemische mondhygiëne maatregelen verlaagde het tarief van respiratoire pathogeen kolonisatie in mondelinge microbiota [10, 11]; (Ii) mondhygiëne voorzichtig met beide chloorhexidine mondspoeling of gel werd geassocieerd met een vermindering van 40% in ventilator-geassocieerde pneumonie bij ernstig zieke volwassenen [12]; en (iii) mechanische orale reiniging significante vermindering van het risico op fatale longontsteking [13].
Oral holtes bevatten diverse microbiota die getallen bijna 700 soorten [14]. Dit ecosysteem omvat biofilm-vormende bacteriën zoals Streptococcus mutans
, Fusobacterium nucleatum
, Porphyromonas gingivalis
en actinobacillus actinomycetemcomitans
. Hoewel de microbiota varieert tussen individuen, binnen een bepaalde persoon de mondelinge microbiome relatief stabiel is [15]. Echter kunnen de orale microbiële preparaat snel veranderen onder matige omstandigheden die kunnen optreden tijdens ziekenhuisopname [16]. Daarom mondhygiëne kritiek zieke patiënten is vooral belangrijk om kolonisatie van multiresistente bacteriën of overgroei van respiratoire pathogenen te voorkomen. Onvoldoende mondhygiëne kan resulteren in de vorming van rijpe tandaanslag op tandoppervlakken of orale epitheelcellen, en deze plaque kan tegen reiniging worden door spoelen met water of met handmatige tandenborstels, die de noodzaak van effectieve strategieën die orale biofilm onderdrukken belicht vorming. Verschillende proeven op het vermogen van kruidenextracten [17], ontsmettingsmiddelen [18, 19], inhibitoren van polysaccharideproductie [20, 21], en zeldzame suikers [22] om de vorming van orale biofilms zijn uitgevoerd verminderen
Recently testen. , alkali-genererende middelen zoals L-arginine en ureum werden voorspeld aan de groei van acidogene of aciduric bacteriën remmen door de pH van de orale omgeving [23]. Metabolisme van L-arginine en ureum arginine deiminase en urease, respectievelijk, produceert ammoniak. Veel orale bacteriën bezitten een arginine deiminase, dat L-arginine metaboliseert tot ornithine en ammoniak dat de pH van de orale biofilms verhoogt produceren. Klinische studies waarin L-arginine-bevattende tandpasta's en mondspoelingen toonde een beschermend effect tegen de ontwikkeling van cariës bij jongeren [24, 25]. Bovendien, L-arginine en fluoride synergistisch onderdrukt S. mutans
groei en biofilmvorming [26].
L-arginine is een basisch aminozuur dat een guanidine groep bevat. Zoals guanidine hydrochloride, kunnen L-arginine eiwit oplosbaarheid verhogen en onderdrukken eiwitaggregatie [27]. Hoewel het precieze mechanisme voor L-arginine gemedieerde remming van eiwit-eiwit interacties onduidelijk blijft, kan L-arginine de oppervlaktespanningen van eiwitten te veranderen door interactie met eiwitten of het water rondom hen zonder strakke bevestiging waargenomen met andere middelen zoals guanidine hydrochloride [28]. Omdat deze milde interactie behoudt proteïnefuncties is L-arginine gebruikt voor solubilisatie van exogeen tot expressie gebrachte eiwitten of antilichamen voor farmaceutisch gebruik. Bovendien, werd L-arginine meldde onlangs de infectiviteit envelop virussen verminderen zoals herpes simplex virus en influenzavirus waarschijnlijk door een gecompromitteerde functie van eiwitten in de omhulling [29].
Orale biofilm is een complex ecosysteem dat samengesteld uit diverse bacteriën, onoplosbaar glucan en speeksel glycoproteïnen. Het verwijderen van deze solide biologische plaque van tandoppervlakken met eenvoudige water spoelen of zelfs met mechanische borstelen kan moeilijk zijn. Overblijvende plaque dient ook als basis voor verdere vorming van biofilm. Omdat L-arginine wordt verwacht dat orale biofilm te remmen en ook destabiliseren complexe aggregaten in tandplaque, kan opname van het aminozuur in een mondspoeling orale biofilm loskomen. In deze studie hebben we onderzocht de mogelijkheden van L-arginine als een reinigingsmiddel om reeds gevestigde orale biofilms te verwijderen.
Methods
Killing test voor Streptococcus mutans
glycerol voorraden van S. mutans
GS5 werden uitgestreken op Brain Heart Infusion (BHI) agar platen die vervolgens anaëroob geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 48 uur. Anaërobe kweek werd uitgevoerd met een AnaeroPack systeem (Mitsubishi Gas Co., Ltd.). Verschillende S. mutans
GS5 kolonies werden geënt in BHI-bouillon en gedurende 48 uur bij 37 ° C gekweekt. De kweken werden gecentrifugeerd bij 15.000 rpm gedurende 5 minuten en opnieuw gesuspendeerd in zoutoplossing. Bacteriële suspensies (0,1 ml) werden toegevoegd aan 0,9 ml zoutoplossing, 10 mM citraat (pH3.5) of 0,5 M L-arginine in 10 mM citraat (pH3.5). Na incubatie gedurende 5 minuten bij 37 ° C, werden seriële 10-voudige verdunningen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) bereid en 0,1 ml van de geschikte verdunning werd uitgestreken op BHI-agarplaten. Na 72 uur anaërobe incubatie bij 37 ° C werd het aantal kolonies geteld en vergeleken met het aantal bij de behandeling met zoutoplossing.
Biofilmremmers assay Belgique Om het remmende effect op S. mutans
GS5 biofilm beoordelen vorming, 0,1 ml zoutoplossing, 10 mM citraat (pH3.5) of 0,5 M L-arginine pH3.5-7.0 (aangepast met 10 mM citraat buffer) werden gemengd met een gelijk volume van de bacteriesuspensie (1% v /v van 48 h kweek) in 2 x BHI met 2% sucrose. De mengsels werden op 96-well platen toegevoegd en anaëroob geïncubeerd bij 37 ° C. Na 24 uur kweek werden de gevormd op de bodems en biofilms gekwantificeerd door kristalviolet kleuring zoals hieronder beschreven.
Verzameling van menselijke speeksel- monsters
na schriftelijke toestemming werd verkregen van negen gezonde vrijwilligers (21-27 jaar oud , man), werden zij gevraagd om speeksel uitgescheiden tijdens het kauwen wax kauwgom gedurende 5 minuten te verzamelen. Uitsluitingscriteria waren jonger dan 20 jaar of een behandeling met antibiotica hebben ontvangen in de afgelopen 4 weken.
Cleansing effect van L-arginine op mondelinge biofilm gevormd op plastic schijfjes
menselijke orale biofilms werden gevormd op 13,5-mm steriele plastic schijfjes (Sensi-Disc, Sumitomo Bakelite, Co., Ltd., Tokio), gevestigd in 24-well cultuur gerechten. De schijfjes werden geïncubeerd in 0,5 ml BHI met 1% sucrose en 20% menselijk speeksel verzameld van drie gezonde vrijwilligers (# 1- # 3). Na 72 uur anaërobe kweek werden de schijfjes verwijderd en eenmaal met zoutoplossing gewassen. De biofilms op de schijven werden verder gewassen met 0,5 ml 10 mM citraat (pH3.5), 0,5 M elk van L-arginine, L-alanine, L-glycine of L-lysine (alle ingesteld op pH 3,5 met 10 mM citraat) door gedurende 30 minuten bij 37 ° C. De schijven werden daarna opnieuw gewassen met 0,5 ml PBS (pH 7,4), gekleurd met 0,5 ml 0,01% kristal violet gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. De schijven werden vervolgens viermaal gewassen met 1,0 ml zoutoplossing en lucht gedroogd. Na het nemen van foto werd de resterende kleurstof geëlueerd met 0,5 ml 33% azijnzuur door gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De absorptie van de eluaten bij 550 nm werd vervolgens gemeten.
Reiniging assay op humaan speeksel biofilm behulp microputjes
menselijke speeksel verzameld uit vier gezonde vrijwilligers (# 4 # 7) werden op BHI met 1% saccharose bij 20 toegevoegd % (v /v). Gemodificeerde humane orale biofilms werden ook bereid door 48 h S. mutans
GS5 kweken (1% eindvolume) om cariogene biofilm simuleren. Elk mengsel (0,1 ml) werd vervolgens toegevoegd aan 96-putjesplaten en anaëroob geïncubeerd bij 37 ° C. Na 72 uur werden de kweken verwijderd en de biofilm gevormd op de onderzijde van de platen werd eenmaal met 0,2 ml zoutoplossing gewassen. Elk putje werd daarna met 0,1 ml zoutoplossing (controle), 10 mM citraat (pH3.5, oplosmiddel voor L-arginine in deze studie) of 0,5 M L-arginine (pH3.5) gewassen door gedurende 30 minuten bij 37 ° C. De testreagentia werden gedecanteerd en elke well werd driemaal gewassen met 0,2 ml zoutoplossing. De resterende biofilm werd gekleurd met 0,1 ml 0,01% kristal violet gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na kleuring werden de putjes vier keer gewassen met 0,2 ml zoutoplossing en de resterende kleurstof werd geëlueerd met 0,2 ml 33% azijnzuur door gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De absorptie van de eluaten bij 550 nm werd vervolgens gemeten. Zes putjes werden gebruikt voor elk monster in een enkele assay. Testen werden driemaal onafhankelijk van elkaar herhaald.
Scanning elektronenmicroscopie
menselijke orale biofilms werden gevormd op 13,5-mm steriele plastic schijfjes met behulp van de monsters van # 4 tot # 7. De schijfjes werden geïncubeerd in 0,5 ml BHI met 1% sucrose en 20% humaan speeksel. Na 72 uur anaërobe kweek werden de schijfjes verwijderd en eenmaal met zoutoplossing gewassen. De biofilms op de schijven werden verder met 0,5 ml zoutoplossing, 10 mM citraat (pH3.5) of 0,5 M L-arginine (pH3.5) gewassen door gedurende 30 minuten bij 37 ° C. De schijven werden daarna opnieuw gewassen met 0,5 ml PBS (pH 7,4), en de biofilms op de schijven werden gefixeerd met 2% glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaatbuffer (pH 7,2). Na fixatie werden de biofilms ontwaterd in een ethanolreeks en een Hitachi PCP-2 kritisch punt drooginrichting gedroogd. De schijven werden bekleed met platina /palladium in een Hitachi E-102 sputter coater en onderzocht met een JEOL JCM-6000 scanning elektronenmicroscoop. De biofilm gebied na het wassen met elke test reagens behouden werd gemeten met behulp van de kleur auto-selectie-instrument in Photoshop CS6. De pixel waarde verhoudingen van de biofilm gebied om de totale observatie gebied werden berekend uit vijf willekeurig gekozen velden op 100x vergroting.
Microbiële samenstelling analyse van 16S rDNA sequencing
de speekselklieren microbiome van de zes gezonde vrijwilligers (# 4- # 9 ) werd gekenmerkt door Illumina Miseq 16S rDNA sequentie analyse van DNA geëxtraheerd uit 3 ml speeksel. Om de microbiële groepen die gevoelig citraat of L-arginine spoelen waren identificeren, werden humaan speeksel afgeleide biofilms gevormd op 13,5-mm kunststof schijven gewassen met de testreagentia hierboven beschreven. De test reagentia werden vervolgens gewonnen, en de bacteriën uit de wassingen werden verzameld door centrifugeren (uitgewassen fractie). De schijfjes werden driemaal gewassen met 0,5 ml zoutoplossing, in stukken gesneden met een steriele schaar, en vervolgens overgebracht in 0,5 ml zoutoplossing sonicatie met een Bioruptor (Cosmobio, 3 x 1 min aan 1 min interval uitvoerinstellingen H). De vrijstaande biofilms werden verzameld door centrifugeren (aanhoudende fractie). DNA uit beide fracties werd gezuiverd en de microbiële samenstelling bepaald met 16S rDNA sequentie analyse.
DNA extractie werd uitgevoerd volgens de door Morita et al methode. [30]. Sequencing bibliotheken werden bereid door het amplificeren van het gebied V3-V4 van de 16S rDNA middels de door Klindworth et al primers. [31]. Na de eerste amplificatie, werd een tweede PCR uitgevoerd om Illumina adapters en barcodes die toegestaan multiplexing hechten. Amplificaties werden uitgevoerd in 25 pi reacties met 2,5 pi verdund sjabloon, 12,5 ui 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix en 2,5 pi van elke primer. Thermale cycli bestaande uit een initiële denaturatiestap (3 min bij 95 ° C), gevolgd door 25 cycli van denaturatie (30 s bij 95 ° C), annealing (30 s bij 55 ° C) en 30 s bij 72 ° C. De laatste verlenging stap bestond uit 5 minuten bij 72 ° C. Amplicons werden gezuiverd middels AMPure XP korrels (Beckman Coulter). Sequentiebepaling werd uitgevoerd met de Illumina MiSeq platform (MiSeq Reagent Kit ver. 3, 600 cycli) volgens de specificaties van de fabrikant voor het genereren gepaarde-end bed van 300 basen in elke richting. Een totaal van 10.381.210 2 x 300 basenparen leest met gemiddeld 432.550 leest per monster werd verkregen. Primersequenties werden geknipt, en de gepaarde-end leest samengevoegd met behulp van Fastq-join [32] met de standaard parameters en verwerkt met de QIIME 1.8.0 pijplijn [33]. Na een hersenschim controle door Usearch, 20.000 Illumina leest per monster (gemiddelde kwaliteit score boven de 20) werden willekeurig geselecteerd voor verdere analyse. Met de UCLUST [34] algoritme is ingebouwd in de QIIME pijpleiding, werden sequenties geclusterd & gt; 97% identiteit ten opzichte van de Greengenes referentie-database, het produceren van 635 operationele taxonomische eenheden (OTU). Met behulp van de QIIME pijplijn, werden ongewogen UniFrac afstanden geproduceerd en gebruikt om beta diversiteit te onderzoeken door het uitzetten van PCA coördinaten
Nucleotide seqeunce
Sequence data zijn gedeponeerd in DDBJ database (toegangsnummer: DRA004109, PRJDB4298, SAMD00042426-SAMD00042441).. Statistische gegevens
Statistische analyse van de gegevens werd uitgevoerd met StatFlex ver. 6,0 (Artech Co., Ltd., Tokyo) middels variantieanalyse (ANOVA) met de middelen van alle groepen vergelijken en gevolgd door Tukey's test de middelen van elk van de twee groepen te vergelijken. De gegevens werden beschouwd als significant verschillend te zijn als de 2-de steel p
waarde werd minder dan 0,05.
Ethiek toestemming en machtigingen
menselijke speeksel werden verzameld uit negen gezonde vrijwilligers na schriftelijke toestemming werd verkregen. Ethische goedkeuring werd verkregen uit de Research Ethics Committee van de Faculteit der Geneeskunde, Kagawa University (referentienummer, 27-074).
Toestemming om te publiceren
De auteurs verkregen toestemming van alle deelnemers aan de analyse van gegevens in het kader van publiceren koppelbaar anonimiseren.
Resultaten
remmende effect van L-arginine op S. mutans
GS5 biofilmvorming
biofilm assays werden uitgevoerd om het effect van L-arginine op S. mutans
GS5 biofilm bepalen formatie onder pH-omstandigheden, variërend van zuur tot neutraal (pH3.5-7.0). Enerzijds, S. mutans
GS5 kweek werd toegevoegd aan 2 x BHI met 2% saccharose bij 2% (v /v). De bacteriële suspensie (0,1 ml) werd vervolgens gemengd met een zoutoplossing, 10 mM citraat (pH3.5) of 0,5 M elk van L-arginine oplossing bijgesteld de pH (3,5-7,0) en aangebracht op de microputjes. Na 24 uur anaërobe teelt, werd S. mutans
biofilm gekwantificeerd door kristalviolet kleuring. Zoals getoond in Fig. 1, L-arginine oplossing (eindconcentratie 0,25 M) die zijn aangepast om pH3.5 remde S. mutans
biofilm na 24 uur kweken in vergelijking met saline of buffercontrole (5 mM citraat, pH3.5) . Het effect van L-arginine is pH-afhankelijk, waarbij alleen L-arginine oplossingen aangepast aan pH3.5 remde significant biofilmvorming. Verder is deze remming was waarschijnlijk te wijten aan een bactericide effect, omdat 10 mM citraatbuffer (pH3.5) en L-arginine aangepast aan pH3.5 verminderde S. mutans
GS5 aantal slechts 0,61 ± 0,30 en 0,49 ± 0,22 log
10 CFU /ml gedurende 5 minuten contact, respectievelijk, en de optische dichtheid van de S. mutans
kweek na 24 uur incubatie was niet verschillend tussen de monsters met en zonder 0,25 M L-arginine oplossing (pH3.5). Deze resultaten suggereren dat zure L-arginine gedestabiliseerd biofilmstructuur en /of verminderde onoplosbaar glucan productie van S. mutans
. Gebaseerd op deze resultaten, werden zure L-arginine oplossingen aangepast aan pH3.5 gebruikt vervolgens geanalyseerd. Fig. 1 pH-afhankelijke remming van S. mutans
GS5 biofilmvorming door L-arginine. Verdund S. mutans
GS5 culturen en reagentia werden gemengd 1: 1. Nadat de mengsels werden anaëroob gekweekt bij 37 ° C gedurende 24 uur werden S. mutans
biofilms die onderaan de microputjes had gevormd gekwantificeerd door kristalviolet kleuring. Zoutoplossing (S), 10 mM citraat pH3.5 (CA3.5) of 0,5 M L-arginine-oplossing ingesteld met 10 mM citraatbuffer bij een pH tussen 3,5 en 7,0 (aangeduid als LA3.5-LA7.0) werden als testreagentia. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking. * Significant verschillend van zoutoplossing (p
& lt; 0,05) ** Significant verschillend van 10 mM citraat (pH3.5) (p
& lt; 0,05)
Reinigende werking van L-aminozuuroplossing op orale biofilm
speeksel-afgeleide biofilm werd bereid op plastic schijfjes met de speekselmonsters van gezonde volwassenen (# 1, # 2 en # 3). Nadat de biofilm werd gewassen met 10 mM citraat (pH3.5), 0,5 M elk van L-arginine, L-glycine, L-lysine of L-alanine oplossingen, waarbij de pH werd aangepast tot 3,5. Zoals getoond in Fig. 2a, het kristalviolet vlekken op de schijfjes gewassen met L-arginine minder dan gewassen met citraatbuffer of drie andere L-aminozuren getest. Het kristalviolet kleurstof geëlueerd met azijnzuur en de absorptie bij 550 nm van de elutie werd gemeten als het tegenhoudorgaan biofilms op de schijven te kwantificeren. Zoals getoond in Fig. 2b, L-arginine verminderde menselijke speeksel biofilm beter dan andere L-aminozuren hoewel significant verschil waargenomen. Fig. 2 Reinigende werking van L-arginine op de speekselklieren biofilm gevormd op kunststof schijven. een kristal violet kleuring van de biofilm vasthouden van de schijven na het wassen. De biofilm gevormd op de plastic schijf werd gedurende 30 min gewassen met 10 mM citraatbuffer (pH3.5, Cit), 0,5 M elk van L-arginine (Arg), L-glycine (Gly), L-lysine (Lys) of L-alanine (Ala), waarbij de pH werd bijgesteld tot 3,5 met 10 mM citraatbuffer. b Kwantificering van het speeksel vasthoudende biofilm op de schijven. Het kristalviolet werd geëlueerd van de in paneel A met azijnzuur en de absorptie bij 550 nm werd gemeten discs. Relatieve waarden aan citraat monster worden getoond
destabiliserend effect van zure L-arginine op de orale biofilms
Om de destabilisatie effect van zure L-arginine (pH3.5) op de menselijke orale biofilm verder te evalueren, werden de speekselmonsters verzameld van vier gezonde vrijwilligers (# 4, # 5, # 6 en # 7). Illumina-gebaseerde 16S rDNA sequentie analyse toonde aan dat deze monsters bevatte de microbiome consistent met verschillende eerdere verslagen over de menselijke speeksel [35, 36]: Streptococcus
(meest overheersende, 23,2-44,5% overvloed tarief in deze studie), Prevotella
, Neisseria
, Veillonella
, Rothia
, Fusobacterium
, Gemella
, Porphyromonas
, Haemophilus
, Granulicatella, Kopen en Actinomyces
werden vaak waargenomen zo overvloedig genera (zie Extra bestanden 1, 2 en 3 voor een gedetailleerd overzicht van overvloed tarieven). Ondernemingen De speekselmonsters werden toegevoegd aan microwells met BHI en 1% sucrose (/v 20% v) en biofilms werden gevormd na anaërobe incubatie gedurende 72 uur. Interessant is dat de biofilm kenmerken verschillen tussen monsters, waarbij het speeksel biofilms van twee individuen (# 5 en # 6) stevig aan de putjes (gedefinieerd als vaste biofilms), terwijl de andere twee (# 4 en # 7) waren gemakkelijk losgemaakt door wassen met zoutoplossing (gedefinieerd als breekbaar biofilms) (figuur 3a.). Wassen van de putjes met zure L-arginine los meer biofilms van # 5 en # 6 dan wel zoutoplossing (p
& lt; 0,05), terwijl 10 mM citraat (pH3.5) alleen vergelijkbaar met die van zoutoplossing was. Fig. 3 destabilisatie van orale biofilms door zure L-arginine. Reinigende effect van zout, 10 mM citraat (pH3.5) of L-arginine in 10 mM citraat (pH3.5) op gevestigde biofilms met speeksel alleen (a) of speeksel gemengd met S. mutans
GS5 (1 % v /v) (b) onderzocht. Het humane speeksel verkregen biofilms werden bereid microwell. Na wassen met de testreagentia werden de aanhoudende biofilms gekleurd met kristalviolet. De getallen geven de ID vrijwilligers. Zoutoplossing, 10 mM citraat (pH3.5) en zure L-arginine (pH3.5) worden aangegeven door blauwe, rode en groene kolommen, resp. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, en de statistische analyse werd uitgevoerd met ANOVA gevolgd door Tukey's test. De p
-waarden van minder dan 0,05 werden als significant Belgique Om de cariogene biofilm simuleren, werd S. mutans
GS5 tot 1% van de uiteindelijke wellvolume toegevoegd. De toevoeging van S. mutans
GS5 veranderde de biofilm structuur en verhoogde de gehechtheid aan de microwells, in het bijzonder in het speeksel monsters die kwetsbaar biofilms (Fig. 3 en Aanvullende bestandsinformatie 4) gevormd. Vergelijkbaar met de biofilm reiniging assay zonder S. mutans
GS5, zure L-arginine significant kap meer biofilm afgeleid van het speeksel van # 5 en # 6 (fig. 3a). Daarentegen werd biofilm die stam GS5 gevoelig voor wassen met 10 mM citraat (pH3.5) (Fig. 3b). Ondertussen, zure L-arginine (pH3.5) en 10 mM citraat (pH3.5) ook vaak biofilms gevormd door fragiele-biofilm vormen speekselmonsters (# 4 en # 6) en S. mutans
GS5 te verminderen, maar geen significante verschillen waargenomen.
biofilmstructuur na wassen met zuur L-arginine Belgique om het menselijk speeksel (# 4 tot # 7) afgeleide biofilm verder vergelijken na wassen met zoutoplossing citraat (pH3.5), of zure L-arginine (pH3.5), scanning electron microscopy (SEM) uitgevoerd. Biofilm werd voorbereid op een plastic schijf met behulp van elk van de speekselmonsters en gewassen met de drie testoplossingen (zoutoplossing, 10 mM citraat pH3.5, of 0,5 M L-arginine pH3.5). De vasthoudende biofilm gebied na het wassen werd gekwantificeerd op vijf willekeurig gekozen SEM gebieden door Photoshop CS6. Zoals getoond in Fig. 4, biofilm massa werd gereduceerd tot de grootste mate van zure L-arginine (pH3.5). Voor monsters gewassen met zoutoplossing en 10 mM citraat (pH3.5), werden dik, mat-achtige objecten behouden na het wassen, terwijl zure L-arginine verwijderde de meeste van deze structuren (aanvullende bestandsinformatie 5). Fig. 4 kwantificering van de aanhoudende orale biofilm na het reinigen. Orale biofilms gevormd op plastic schijven door anaërobe kweken in BHI-bouillon bevattende sucrose (1%) en humaan speeksel (10%). Na 72 uur kweken bij 37 ° C werden de schijfjes gewassen met 1 ml PBS (pH 7,4). De schijven werden verder gewassen met 1 ml zoutoplossing, 10 mM citraat (pH3.5) of 0,5 M L-arginine (pH3.5) gedurende 30 minuten voor bevestiging met 2% glutaaraldehyde in 0,2 M cacodylaatbuffer voor scanning elektronenmicroscopie. Biofilm gebieden werden gemeten met een op kleur gebaseerde automatische selectie in Photoshop CS6 en de verhoudingen betrokken op het totale veld observatie werden berekend. Ten minste vijf willekeurig gekozen velden werden onderzocht. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, en de statistische analyse werd uitgevoerd met ANOVA gevolgd door Tukey's test. De p
-waarden van minder dan 0,05 werden als significant
Oral bacteriëngroepen ontvankelijk zijn voor spoelen met zure L-arginine
Illumina gebaseerde 16S rDNA sequentie-analyse werd uitgevoerd om de bacteriële groepen die gevoelig zijn voor identificeren spoelen met zure L-arginine. We testten speeksel biofilm uit monsters # 4 en # 5 solide en kwetsbare biofilms respectievelijk voorstellen. Speeksel biofilms werden opgesteld op plastic schijf en gewassen met een zoutoplossing, 10 mM citraat (pH3.5) of 0,5 M L-arginine (pH3.5) gedurende 30 min. De vrijstaande biofilms in de testoplossingen werden verzameld door centrifugeren (uitgewassen fractie). Het tegenhoudorgaan biofilms op de schijven werden losgemaakt door sonificatie en verzameld door centrifugatie (behoud fractie). De DNA's werden gezuiverd uit beide fracties. Zoals getoond in Fig. 5, Streptococcus Kopen en Lactobacillus
gedeelde 86,8-98,3% van de biofilm bevolking in zowel bewaard en uitgewassen fracties. Vaste biofilm (# 5) bevatte meer dan breekbare Lactobacillus
biofilm (# 4). Interessant is dat de Streptococcus
aandeel in de uitgewassen fractie met citraatbuffer (10 mM, pH3.5) was hoger dan bij mensen met een zoutoplossing of 0,5 M L-arginine (pH3.5). Anderzijds, Lactobacillus
neiging op de schijven te behouden na wassen met citraat (pH3.5). Deze resultaten gaven aan dat citraat (pH3.5) bij voorkeur uitgewassen Streptococcus
van beide soorten biofilm. Anderzijds, het microbiële profiel van de fracties was behandeld met zuur L-arginine was vergelijkbaar met die van zoutoplossing aangeeft die zuur L-arginine (pH3.5) aspecifiek los bacteriën biofilms gevormd op kunststof schijven. Fig. 5 Vergelijkende microbiota analyse van duurzame en uitgewassen fracties met zure L-arginine. Breekbaar (van # 4) en vast biofilms (# 5) gevormd op de kunststof schijven, die daarna met zoutoplossing (S), 10 mM citraatbuffer pH3.5 (CA), of zure L-arginine (LA) werden gewassen. De microbiële samenstelling van de nog op de schijven en de uitgewassen fractie fractie werden vergeleken door Illumina gebaseerde 16S rDNA sequentieanalyse
Discussie
Arginine deiminase in orale bacteriën metaboliseert L-arginine dat op zijn beurt verhoogt de pH van de mondmilieu, die de vorming van cariës kan onderdrukken. Zo heeft L-arginine onderzocht als mogelijke aanvulling op mondhygiëne [37]. Bovendien zijn hoge concentraties van L-arginine (5,0-10,0%) gerapporteerd dat biofilmvorming cariogene S. mutans
[26] remmen. In deze studie hebben we de reinigende werking van L-arginine op orale biofilms de voordelen van deze basische aminozuur voor mondhygiëne tonen. L-arginine remming van S. mutans
biofilmvorming inderdaad pH-afhankelijke (fig. 1), omdat in het arsenaal van geteste pH (3,5-7,0), significante vermindering van biofilmvorming werden alleen waargenomen bij pH3.5 . Daarom testten wij relatief hoge concentraties (0,5 M) zure L-arginine (pH3.5) in deze studie, en toonde de doeltreffendheid van deze oplossing in het verwijderen reeds orale biofilms. Omdat L-arginine verbetert proteïneoplosbaarheid door het beïnvloeden van eiwit-eiwit interacties en dit effect treedt bij zure omstandigheden [38, 39], de reinigende werking op orale biofilms door zure L-arginine dat hier werd waargenomen wordt waarschijnlijk afgeleid uit een destabilisatie van bacteriële aggregatie.
Tijdens dit onderzoek Kolderman et al. meldde de destabiliserende effect van L-arginine biofilms gevormd door speeksel samengebracht uit zes gezonde vrijwilligers [40]. Deze studie gemeld dat neutrale pH L-arginine (0,1-0,5 M) effectief gedestabiliseerd orale biofilm. Hierin hebben we aangetoond dat zure pH L-arginine niet alleen gedestabiliseerd humane orale biofilm maar remde ook biofilmvorming door S. mutans
, hoewel het moeilijk om de resultaten van de twee studies vergelijken door verschillen in de biofilm testsysteem gebruikt: de Kolderman et al. studie gebruikt gefiltreerd celvrij speeksel als voedingsstof, terwijl we hier gebruikt BHI met 1% sucrose als het ondersteunende medium voor biofilmvorming. Sucrose is een cariogene suiker dat het volume en de soliditeit van orale biofilm verbetert. Het effect van sucrose op in vitro orale biofilmvorming werd duidelijk waargenomen in deze studie, waarbij saccharose toegevoegd blijkbaar veranderde de biofilm massa en samenstelling met een duidelijke toename van het aantal staafvormige bacteriën (aanvullende bestandsinformatie 4). Aangezien Streptococcus Kopen en Lactobacillus
waren de belangrijkste bestanddelen van de orale biofilms getest in deze studie (fig. 5) Deze staafvormige bacteriën waren waarschijnlijk lactobaclli. Dergelijke vaste-biofilms gevormd in rich media kan moeilijk te verwijderen door neutrale L-arginine, en zure omstandigheden kan destabilisatie van de aggregaten door L-arginine te vergemakkelijken. In feite, Ikeda et al. bleek dat het antivirale effect van 0,7 M L-arginine influenzavirus type A was het meest duidelijk wanneer de pH beneden pH 5,0 [41].
Wij selecteerden citraatbuffer om de pH van de L-arginine oplossing, omdat deze passen zuur chelerende activiteit. Het remmende effect van chelatoren op microbiële biofilm is algemeen bekend, zoals blijkt uit het veelvuldige gebruik van EDTA of citraat in catheterslot oplossingen. Co-aggregatie van S. mutans Kopen en Lactobacillus
is gemeld calciumafhankelijke zijn [42], terwijl links met strakke S. mutans
bacteriën Streptococcus
biofilms gemedieerd door glucan-bindende lectinen
