Abstracte achtergrond
De genetische diversiteit en cariogeniteit van C. albicans
van de tandplaque van kinderen zijn slecht begrepen. Deze studie had als doel om de genetische diversiteit en cariogeniteit van C. albicans te verkennen
van kinderen met vroege kinderjaren cariës en cariës-vrij kinderen.
Methods
Tandplak monsters van 238 kinderen met een vroege kinderjaren cariës en vanaf 125 cariës -gratis kinderen werden verzameld voor C. albicans
isolement. Een PCR methode op basis van 25S rDNA werd toegepast om C. albicans
genotypen te analyseren, en de stammen met verschillende genotypen werden getest op acidogenicity en aciduricity.
Resultaten
onder 129 C. albicans isolaten
, 79 (61,2%) was voor genotype A. De verdeling frequentie van genotypes A en C of genotypes B en C vertoonden geen significant verschil tussen met vroege kinderjaren cariës en cariësvrije kinderen (p
= 0,178 en 0,148), terwijl genotypen A en B vertoonden significant verschillende distributies (p
= 0,010). Geen significante verschillen in aciduricity gevonden tussen de drie genotypen, maar de acidogenicity van genotypen B en C aanzienlijk van die van genotype A bij pH 4,0.
Conclusies
genotypische verdeling van C. albicans gepaard
met de cariës ervaring van de kinderen, en het genotype kan worden gerelateerd aan de acidogenicity bij pH 4,0.
Sleutelwoorden
Candida albicans
cariogeniteit vroege kinderjaren cariës genotype Rongmin Qiu en Wenqing Li eveneens bijgedragen aan dit werk.
Achtergrond
vroege kinderjaren cariës (ECC) wordt gedefinieerd als de aanwezigheid van 1 of meer vervallen tanden (noncavitated of holten voorzien laesies), ontbrekende tanden (door cariës) of gevulde tandoppervlakken in elke primaire tand in een kind 71 maanden of jonger [1]. Vanwege de hoge prevalentie in de lagere school kinderen, ECC is een probleem voor de volksgezondheid van grote zorg. Omdat cariës veroorzaakt door micro-organismen in tandplak, kennis over de relatie tussen de micro-organismen in tandplak en ECC kinderen is belangrijk voor ECC voorkomen.
C. albicans
wordt vaak aangetroffen bij kinderen met cariës, terwijl deze gist is meestal afwezig in cariës-vrij kinderen [2, 3]. Deze bevindingen bieden indirect bewijs voor de associatie van C. albicans hotels met cariës. In onze eerdere studie, de frequentie van C. albicans
geïsoleerd in tandplaque van kinderen met ECC werd bevestigd hoger dan in cariësvrije (CF) kinderen (44,1 vs. 19,2%, χ
2 = 22,213, p & lt;.
0.001), waaruit bleek dat C. albicans
is gerelateerd aan ECC [4]
Sommige rapporten de genotypische verdeling van C. albicans hebben geanalyseerd
in de tandheelkundige biofilm van de lagere school kinderen met verschillende cariës statussen en vond dat een bepaald genotype was dominant in de tandheelkundige biofilm van kinderen met ernstige vroege kinderjaren cariës (S-ECC) [5, 6]. De correlaties tussen verschillende C. albicans
genotypes en cariogeniteit van deze gist onopgehelderd.
Onderzoekers hebben gevonden dat de virulentiefactoren van C. albicans,
zoals invasiviteit en geneesmiddelenresistentie, gekoppeld aan het genotype [7-9] en dat acidogenicity en aciduricity zijn belangrijk C. albicans
virulentie factoren voor cariës. In onze eerdere studie, de C. albicans
stammen afkomstig van de tandplaque ECC kinderen bleken aciduric dan CF kinderen, wat inhoudt dat de aciduricity klinische C. albicans-stammen
wordt geassocieerd met een tandheelkundige status van kind. Daarentegen werden geen verschillen gevonden wat betreft acidogenicity tussen de twee groepen [10]. Hoe dan ook, de relaties van acidogenicity en aciduricity met genotype blijft onduidelijk.
In deze studie hebben we de hypothese dat de genotypische verdeling van C. albicans
van ECC en CF kinderen verschilt en dat verschillende C. albicans
genotypen vertonen variabele acidogenicity en aciduricity. Om deze hypothese te testen, C. albicans
van de tandplaque van ECC en CF kinderen werd gedetecteerd door 25S rDNA-gebaseerde PCR, en de acidogenicity en aciduricity van verschillende C. albicans
genotypes werden geëvalueerd.
Methods
onderwerpen
in totaal 363 kinderen 3-5 jaar (gemiddelde ± SD, 3.2 ± 1.9) werden willekeurig gerekruteerd uit vier kleuterscholen in Guangzhou, China, van februari-april 2009 (200 jongens en 163 meisjes ). De kinderen waren gezond en hadden geen geschiedenis van het gebruik van antibiotica gedurende ten minste 1 maand voor de studie, en geen van hun permanente tanden nog had uitgebroken. De kinderen werden toegewezen aan twee groepen volgens hun cariës status: het ECC (n
= 238) of CF (n
= 125). De diagnostische criteria voor ECC gebruikt in deze studie werden door Drury et al voorgesteld. [1]. De ouders van de kinderen waren volledig schriftelijk in kennis gesteld en schriftelijk toestemming voor deelname werd verkregen van de ouders die besloten om de deelname aan het onderzoek.
Goedkeuring werd verkregen uit de Research Ethics Committee van Sun Yat-sen Universiteit voor de studie begon .
sample collectie
sample collectie werd uitgevoerd in de ochtend, en de kinderen werd gevraagd om niet te eten gedurende 2 uur vóór monstername. Gesteriliseerde tandheelkundige ontdekkingsreizigers werden gebruikt voor tandplak collectie. Voor de ECC kinderen, werd tandplaque verkregen cariës laesies in de voorste tanden en /of molaren en vervolgens samengevoegd. Voor het CF kinderen, werd samengevoegd tandplaque verkregen van het geluid labiale oppervlakken van de bovenste voortanden en het geluid buccale oppervlakken van de bovenste en onderste eerste melkmolaren. Alle monsters werden individueel in steriele buisjes die de hersenen het hart infusie-bouillon (HKM Co, Guangdong, China) gehouden en op ijs bewaard; de monsters werden naar het laboratorium binnen 2 uur na afname.
C. albicans
isolatie en identificatie Leer Alle monsters werden gedispergeerd door vortexen gedurende 30 s aan een gist dispergeren. Een 20-ml aliquot van elk monster werd geënt op een plaat met selectief medium (CHROMagar Candida, CAC, CHROMagar Co., Parijs, Frankrijk) en gekweekt gedurende 48 uur bij 37 ° C [11]. Voor het verkrijgen van zoveel mogelijk representatief genotypen van C. albicans
in één monster dat praktisch mogelijk is, hebben we gekozen voor 5 kolonievormende eenheden (CFU) per monster (ongeveer 30-300 CFU's per kind) uit elke CAC plaat met behulp van een eerder beschreven werkwijze [12] om de selectie vertekening te minimaliseren en om willekeur te maximaliseren. Alle kolonies in elk monster werden overgebracht naar Sabouraud dextrose bouillon (SDB) (HKM Co, Guangdong, China) met glycerol (30% v/v
) en bewaard bij -80 ° C.
De regels onderwerp recruitment, monstername en C. albicans
isolatie en identificatie werden beschreven in ons eerder gepubliceerde studie [4]. De isolaten van C. albicans
werden opgeslagen isolaten uit de vorige studie [4].
DNA extractie
een kookpunt werd gebruikt voor DNA-extractie. Bevroren suspensies van C. albicans
stammen werden gemengd, en een 200-gl portie van elk monster suspensie werd een Eppendorf buis toegevoegd en gedurende 8 minuten bij 12.000 rpm. Nadat het neerslag in vloeibare stikstof was gemalen liet men gedurende 5 minuten staan nadat de vloeibare stikstof verdampt; Deze procedure werd herhaald in drievoud. Het precipitaat werd gesuspendeerd in 30 pi DNA extractieoplossing, gekookt bij 100 ° C gedurende 10 minuten en gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 3 minuten. Het supernatant werd bewaard bij -20 ° C totdat de PCR amplificatie.
PCR amplificatie primers
de CA-INT L (5'-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAA-3 ') en CA-INT-R (5'-3-CCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT ') werden uitgevoerd als eerder beschreven [13]. De amplificatie mengsel (totaal volume 50 ui) bevatte 10 gl PCR buffer; 1 pi van elk dNTP, primers en Taq polymerase (Promega, Madison, WI, USA); 34 ul van DDH 2O; en 2 gl van het matrijs-DNA. De amplificatie waren als volgt: initiële denaturatie bij 93 ° C gedurende 5 min, 40 cycli van denaturatie bij 93 ° C gedurende 30 s, primer annealing bij 55 ° C gedurende 45 s en verlenging bij 72 ° C gedurende 45 s, met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 7 min. Voor identificatie werden de PCR-producten geladen op 2% agarosegels (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bij 100 V gedurende 30 minuten en vervolgens gekleurd met ethidium bromide oplossing. De C. albicans
sequenties werden ingedeeld in vijf genotypen volgens de band patroon: genotype A (450 bp), genotype B (840 bp), genotype C (450 en 840 bp), genotype D (1080 bp), en genotype E (1400 bp) [14, 15]. bereiding
Suspension
Twintig stammen van elk C. albicans
genotype werden onderzocht op de zuurproductie en zure tolerantie. Bevroren voorraden van de stammen werden geïnoculeerd in SDB en gegroeid bij 37 ° C onder schudden (150 rpm) onder aërobe omstandigheden. Nadat de gistcellen werden gekweekt gedurende 17-24 uur, werden ze geoogst in de late exponentiële groeifase [16] en tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, bevattende 0,05 mM Na 2HPO 4 /KH < sub> 2PO 4, pH 6,8). De cellen werden gesuspendeerd in PBS en ingesteld op een optische dichtheid (OD) van 1,0 bij 540 nm (gelijk aan 1 x 10 8 cellen /ml) voor de zuurproductie en zure tolerantietests. De OD-waarde werd gedetecteerd met een ultraviolet spectrofotometer (752S, Lengguang Tech. Co., Shanghai, China).
Zuurproductie en zure tolerantie assays
Steriele SDB (met 100 mM glucose) werd gebruikt voor de zuurproductie en zuur tolerantie testen; de pH van het medium werd ingesteld op verschillende initiële pH-waarden van 7,0, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5 en 4,0 (pH S-25, Shanghai Precision & amp; Scientific Instrument Co., China) met steriele 2 mM HCl en 4 mM NaOH [17]. Kort samengevat, 50-ul aliquots van suspensies van elk van de verschillende genotypen bij een OD 540 van 1,0 werden afzonderlijk gedurende 48 uur bij 37 ° C toegevoegd aan 5 ml SDB, gekweekt en vervolgens gecentrifugeerd bij 4500 rpm gedurende 8 minuten bij 4 ° C. De pH van het uiteindelijke supernatant werd gedetecteerd met een standaard pH-meter zuurvorming bepalen. De ApH (gelijk aan de initiële pH waarde minus de uiteindelijke pH waarde) gebruikt om zuurproductie beoordelen. Belgique Om groei onder zure omstandigheden te evalueren, werd het precipitaat 3 keer gewassen in PBS en vervolgens verdund met 2 ml PBS. Vervolgens werd de troebelheid gemeten bij 540 nm (OD 540) met een spectrofotometer.
Deze experimenten werden uitgevoerd in drievoud. De gemiddelde ApH en OD 540 werden elk berekend op basis van drie identieke monsters. Een grotere ApH aangegeven waarde een groter vermogen om zuur te produceren, en een grotere OD 540 waarde aangegeven een betere groei en hogere aciduricity.
Statistische analyse
Data-analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, IL , VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). De relatie tussen de genetische diversiteit van C. albicans Kopen en verschillende cariës ervaringen werd geanalyseerd met chi-kwadraat test. Om type I fouten te voorkomen bij het vergelijken van meerdere groepen via chi-kwadraat testen, werd een kritische p
waarde-vereiste correctie toegepast, en de p-waarde
drempel werd ingesteld op 0,017 in drie-weg vergelijkingen. Verschillen in ApH en OD 540 waarden tussen de drie genotypen van C. albicans
werden geanalyseerd door ANOVA. Wanneer een significant verschil gevonden tussen de drie genotypen, werd de LSD-t
methode voor het verschil tussen twee groepen te analyseren, en het significantieniveau voor de statistische tests werd vastgesteld op 0,05.
Resultaten
C. albicans
genotypische verdeling
C. albicans
stammen werden geïsoleerd uit 129 patiënten (35,5% van de 363 kinderen): 105 kinderen met ECC en 24 CF kinderen. Elk kind van wie C. albicans
die gepresenteerd slechts één genotype, met genotype A, B en C de drie genotypen waargenomen. Genotypen D en E werden niet gedetecteerd. Onder de isolaten, 79 (61,2%) behoorden tot A genotype; 20 (15,5%), B genotype; en 30 (23,3%), tot genotype C. Genotype A de hoofdcomponent in beide groepen kinderen (56,2% in de ECC-groep, 83,3% van de CF-groep); de frequenties van genotype B waren 19,0% en 0, en de frequenties van genotype C waren 24,8 en 16,7%, respectievelijk. Ondernemingen De frequenties van verschillende genotypische verdelingen in de ECC en CF groepen waren significant verschillend (p = 0,042
). Genotypes A en B werden verspreid in een significant andere wijze in de twee groepen (p = 0,010
) genotype A gepresenteerd een hogere frequentie in de CF groep en genotype B gepresenteerd een hogere frequentie in de ECC groep. De verdeling frequentie van genotypes A en C of genotypes B en C vertoonden geen significant verschil tussen de twee groepen en de p
waarden waren 0,178 en 0,148, respectievelijk (Tabel 1 en Fig. 1) .table 1 Genotypische verdeling van C. albicans
van tandplaque van kinderen met verschillende cariës ervaringen, n
(%)
Group
Totaal aantal isolaten
Genotype A
Genotype Ba
Genotype Cb, c
p-
waarde
ECC
105
59 ( 56.2)
20 (19,0)
26 (24,8)
0,042
CF
24
20 (83,3)
0
4 (16,7)
totale
129
79 (61,2)
20 (15,5)
30 (23,3)
aComparison van de genotypische frequenties van A en B tussen ECC en CF groepen (p = 0,010
)
bComparison van de genotypische frequenties van A en C tussen ECC en CF groepen (p = 0,178
)
cComparison van de genotypische frequenties van B en C tussen ECC en CF groepen (p = 0,148
)
Fig. 1 genotypische verschillende subgroepen van C. albicans
zoals bepaald door PCR. Lanes 17
, 21
, 22
en 23
tonen genotype A (de PCR-amplificatie product is ongeveer 450 bp). Lanes 18 Kopen en 25