Abstracte achtergrond
Cariës is de meest voorkomende bacteriële ziekte die de mensheid. Cariës methoden voor risicobeoordeling, de identificatie van biomarkers en de ontwikkeling van vaccins strategieën worden benadrukt om de incidentie van de grotendeels vermijdbare ziekte te bestrijden. Patroonherkenning receptoren zoals toll like receptoren (TLR) zijn geïmpliceerd als modulatoren van gastheer-microbiële interacties. Oplosbare TLR-2 en de coreceptor, CD14 geïdentificeerd in speeksel kan de celwand componenten van cariogene bacteriën binden en moduleren het ziekteproces. Het doel van deze studie is om het potentieel van speeksel sTLR-2 en sCD14 als biomarkers van cariës activiteit en indirecte maatregelen van de cariogene bacteriële last te bepalen.
Methods
gestimuleerde hele speeksel werd verzameld van twintig cariës gratis en twintig cariës actieve kinderen in de leeftijd van 5 en 13 jaar. De concentratie van sCD14 en sTLR-2 samen met die van de cytokine IL-8 gerapporteerd cariës te vermeerderen werd bepaald door enzymgekoppelde immunosorbent assay.
Resultaten
Terwijl het niveau van sCD14 en die van IL 8 dubbelzinnig was tussen de twee groepen, de sTLR-2-concentratie in cariës werkzame speeksel was significant hoger dan in cariës vrije speeksel.
Conclusies
sTLR-2 in speeksel kunnen dienen als potentiële biomarker voor cariës activiteit.
Trefwoorden
Speeksel Oplosbare toll-like receptor 2 cariës Biomarker Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-108) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar voor geautoriseerde gebruikers. achtergrond
Tandcariës is een multifactoriële infectieziekte veroorzaakt door complexe interacties tussen het zuur-producerende bacteriën, fermenteerbare koolhydraten en gastheerfactoren. Ondanks dat grotendeels te voorkomen, blijft de meest voorkomende chronische ziekte wereldwijd [1]. Recente systematische analyses suggereren dat de incidentie van cariës vertoont een stijgende trend bij kinderen 2-4 jaar in de Verenigde Staten jaar [2]. Er zijn aanwijzingen voor een verhoogde prevalentie bij volwassenen in de lagere sociaal-economische status in Europese landen. In ontwikkelingslanden de prevalentie neemt toe bij zowel kinderen als volwassenen [3].
Vroege opsporing van wit-spot laesies, arresteren demineralisatie en het bevorderen remineralisatie zijn enkele van de preventieve klinische methoden die momenteel worden gebruikt in cariës beheer [4]. Daarnaast veel nadruk gelegd op de ontwikkeling van efficiënte cariës risicobeoordelingsstrategieën om de waarschijnlijkheid van een ontwikkeling van nieuwe carieuze laesie te bepalen en /of om de status van de cariësproces bepalen individuele tandoppervlakken [4, 5]. De ziekte van de gemineraliseerde weefsels van tanden, pathogenese van cariës omvat gedemineraliseerd glazuur door zuur producerende bacteriën en vernietiging van de organische stof leidt tot cavitatie [1, 4].
Speeksel wordt erkend als een rijke bron van gastheerfactoren kunnen moduleren van de cariësproces [6, 7]. Technologische ontwikkelingen hebben respectievelijk geholpen in de karakterisering van speeksel proteomics en peptidomics met de identificatie van 1444 eiwitten en peptiden 11893 [8]. Deze eiwitten /peptiden tot verschillende functionele klassen zoals die betrokken zijn in reactie op stimuli /stress, antioxidant functies, katalytische functies en enzym regelgevers [8, 9]. Verschillende speeksel componenten zijn beoordeeld voor een associatie met cariës. Terwijl sommige vertonen zwakke vereniging, anderen waren dubbelzinnig tussen normale en cariës actieve speeksel [9-12]. Beoordeling van speeksel glycoproteïnen specifieke oligosacchariden gebleken dat hogere niveaus van geselecteerde oligosaccharide bacteriële kolonisatie op het oppervlak van de tanden vergemakkelijken correleren met cariës bij jonge volwassenen [13]. Speeksel niveaus van antimicrobiële middelen zoals alfa defensines, statherin en cystatine S zijn gesuggereerd als mogelijke risicofactoren voor cariës ontwikkeling [10, 14].
Toll like receptoren (TLR) zijn kiemlijn gecodeerde receptoren die geconserveerde microbiële patronen meestal te herkennen gedeeld door grote groepen micro-organismen. Nog 13 zoogdieren TLRs en veel van hun liganden zijn bekend [15]. Werking hetzij alleen of samen met specifieke co-receptoren in het herkennen microbiële patronen TLRs fungeren als poortwachters continu bemonsteren van het milieu en reacties uitlokken voorkoming /controle infectie [15, 16]. TLR-2 en TLR-4 is aangetoond dat het peptidoglycan van grampositieve en lipopolysaccharide van gramnegatieve bacteriën respectievelijk alleen of in combinatie met de gemeenschappelijke co-receptor CD14 [17, 18] herkennen. Odontoblasten gelokaliseerd op het dentino-pulpa oppervlak gezonde tanden is aangetoond dat expressie TLR-2 en TLR-4. Afhankelijk van de aard van de respons odontoblastic cariës progressie ofwel onderdrukt de vorming van dentine reactionaire of versnelde leidt tot ontsteking [19, 20] pulpa. Microbiële invasie van dentine is aangetoond dat TLR-4 in odontoblasten opwaarts reguleren en bemiddelen TGF-β uitscheiding vergemakkelijken collageensynthese. Bovendien TLR-4 signalering in odontoblasten ook upregulate matrix metalloproteinase-2 bevorderen van klieving van dentine sialophosphoprotein (DSPP) tandheelkundige sialoproteïne (DSP), die een kiemvormingsplaats voor kristalvorming hydroxyapeptite vormt in het nieuw gevormde collageen [19]. Stimulatie van odontoblast achtige cellen met celwand componenten van Gram-positieve bacteriën opgewekt cytokine en chemokine afscheidingen in een TLR-2 afhankelijke wijze [20]. Verhoogde niveaus van cytokinen IL-6, TNF-α en IL-8 waargenomen bij cariës werkzame speeksel [21].
Hoewel hoofdzakelijk membraangebonden onlangs oplosbare vormen van bepaalde TLRs zijn geïdentificeerd in lichaamsvloeistoffen. Er is gesuggereerd dat de oplosbare TLRs functioneren om ziekteverwekkers [22-25] sekwestreren. Onlangs hebben wij en anderen de aanwezigheid van oplosbare sCD14 en sTLR-2 in speeksel [24, 26] beschreven. TLR-2 is aangetoond dat het peptidoglycan herkennen en lipotechoic zuur met Streptococcus mutans
, de meest voorkomende cariogene bacteriën [27]. Aanzienlijk bewijs suggereert een sterke correlatie tussen de verhoogde aanwezigheid van cariogene bacteriën in de biofilm plaque en verhoogde hoeveelheden van dezelfde bacteriën in speeksel [6, 10]. Vandaar dat we de hypothese dat het niveau van sTLR-2 en sCD14 in het speeksel van cariës werkzame personen een indirecte maat van het aantal bacteriën en fungeren verkregen als een biomarker van cariës activiteit. Onze gegevens suggereren dat de sTLR-2 is hoger in de gestimuleerde hele speeksel (UWS) van kinderen met actieve cariës laesies.
Studiepopulatie Methods
In deze prospectieve niet-gerandomiseerde klinische studie veertig kinderen tussen 6 en 12 jaar rapporteren aan de pediatrische klinieken van de Indiana University School of Dentistry werden aangeworven na het verkrijgen van toestemming van de patiënten en voogd. De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Indiana University Purdue University in Indianapolis. De monsters werden verzameld alleen uit kinderen met geen bekende orale of systemische ziekte verschillend van cariës en geen gewonnen tanden. Mondelinge tentamens van de kinderen werden uitgevoerd en cariës activiteit geregistreerd. Twintig kinderen (13 jongens en 7 meisjes) waren cariës gratis en twintig kinderen (12 jongens en 8 meisjes) waren cariës actief tentoonstellen 4-8 cariës die restauratie.
Sample inzameling en verwerking Leer Alle kinderen kregen de opdracht om te voorkomen eten en drinken gedurende tenminste 2 uur vóór speeksel verzameling beschreven [24, 28]. Na het spoelen van de mond kort met water werd niet gestimuleerd speeksel (UWS) verzameld van elk kind door de passieve kwijlen methode gedurende vijf minuten in de pre-gekoelde buizen. De monsters werden onmiddellijk op ijs getransporteerd naar het laboratorium voor verwerking. Elk monster werd gedurende 10 minuten helder gemaakt door centrifugeren bij 4000xg bij 4 ° C en bewaard in drie porties bij -80 ° C in CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Duitsland) tot verdere analyse.
Totale eiwitconcentratie
het totale eiwitgehalte van pre monsters werd gemeten met de Bradford methode omvat binding van Coomassie blue kleurstof om de eiwitten [24, 25]. De blauwe eiwit-dye vorm werd gedetecteerd bij 595 nm met behulp van spectrofotometer (Gensys5 spectrofotometer, Thermoelectronic corp, CA). De concentratie van het eiwit in elk monster werd bepaald tegen een standaardkromme ontwikkeld met bekende concentratie van runderserumalbumine
enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)
Ter bepaling sCD14 in speeksel een sandwich ELISA kit (R &. D Systems , Minneapolis, MN) werd gebruikt volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Anti-humaan TLR-2 polyklonaal antilichaam (kloon: IMGENEX Corporation, San Diego, CA) werd gebruikt voor detectie van TLR-2. Alle UWS monsters werden ontdaan van amylase en immunoglobulinen door serieel incubatie met anti-humaan amylase monoklonaal antilichaam (mAb) (1: 2500, catalogus # ab8944; Abcam, Cambridge, MA, USA) en proteïne G parels (Miltenyi Biotec Inc. Auburn, CA ) bij 4 ° C [24]. Het eiwitgehalte van het vooraf gereinigde monsters werd bepaald zoals hierboven en vooraf gereinigd UWS bij 1 ug /ml concentratie werd gebruikt voor het meten en sCD14 sTLR-2 niveaus [25]. Voorincubatie van de UWS met ofwel anti-TLR2 mAb (kloon: 1030A5.138, IMGENEX Corp, San Diego, CA, USA) (0,5 ug /ml) of met TLR-2 peptiden (1 ug /ml) werd uitgevoerd om de evaluatie specificiteit van binding. Gebonden CD14 en TLR-2 werd gedetecteerd met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-muis IgG gevolgd door TMB substraat (Pharmingen, San Diego, CA). De absorptie bij 450 nm werd afgelezen in een microplaat reader (model 680: Biorad Laboratories, CA). De concentratie van sTLR-2 of sCD14 in pg /ml speeksel eiwitten werd bepaald met een standaard curve van gezuiverd recombinant humaan CD14Fc en TLR-2 fc (R & D Systems) van bekende concentratie. IL-8-concentratie in de geklaarde speeksel monsters werden gemeten met BD OptEIA3 ™ ELISA-kit.
Statistische analyse
verschillen in de concentratie van IL-8, CD14 en TLR-2 tussen de cariës en cariës vrije actieve groepen werden bepaald door t-test Students '. p-waarde van minder dan 0,05 werd beschouwd als significant.
Resultaten en discussie
Ondanks de vooruitgang in het begin van detectiemethoden en efficiënte preventieve maatregelen cariës blijft een veel voorkomende chronische ziekte wereldwijd. Het toenemend voorkomen bij kinderen in ontwikkelde landen is een verontrustende gezondheidsprobleem [2, 3]. De demografische data van de studiepopulatie worden gegeven in Tabel 1. De totale eiwitconcentratie van menselijk speeksel is aangetoond dat grote variaties variërend van 0,4 mg /ml tot 7,1 mg /ml [29, 30] vertonen. In onze studie cohort gemeten de totale eiwitconcentratie 6,24 +/- 1,98 mg /ml in cariës vrije speeksel en 5,92 +/- 2,37 mg /ml in cariës actieve speeksel (Figuur 1A) .table 1 De demografische gegevens van de onderzochte populatie
Clinical data
Aantal aangeworven
Leeftijd (jaar)
Man
Vrouw
cariës
12
8
8,76 +/- 3,42
Gezonde controle
13
7
7,77 +/- 2,7
Figuur 1 Total eiwit-concentratie in speeksel: Verduidelijkt hele speeksel werd beoordeeld voor (A) totaal eiwitgehalte door spectrofotometrie en (B ) IL-8 concentratie door ELISA. Werd geen significant verschil waargenomen tussen de cariës gratis en de cariës actieve speeksel groepen. Belgique Om het toenemende aantal speeksel eiwitten worden toegevoegd aan de oplosbare vormen van receptoren patroonherkenning, de sTLR-2, sCD14 en sTLR-4 [25, 26 , 31]. De concentratie van sTLR-2 in parotis speeksel is gerapporteerd verscheidene vouwen hoger dan in speeksel [31] is. De bron van sTLR-2 kan zowel actieve secretie van de klier en /of berusten op extracellulaire splitsing van de membraan gebonden receptor. We vonden dat de concentratie van sTLR-2 in cariës werkzame speeksel (29,5 +/- 3 pg /ml) was significant hoger dan die cariës vrij speeksel (24,8 +/- 0,6 pg /ml) (Figuur 2B). Signalering via TLRs in gastheercellen induceert cytokine secretie [15]. Eerder Gornowicz et al., Hebben verhoogde niveaus van speeksel IL-8 cariës [21] beschreven. We zagen dat het speeksel IL-8 concentratie verschilde niet significant tussen cariës gratis en cariës actief speeksel (Figuur 1B). De variabele waarneming tussen de twee studies kunnen worden toegeschreven aan de verschillen in leeftijd en de aard van het monster (amylase en Ig verarmd versus niet-verarmd). De concentratie van sCD14 in speeksel dubbelzinnig was in beide groepen; variërend tussen 509 pg /ml en 1443 pg /ml in cariës vrije groep en tussen 609 pg /ml en 1829 pg /ml in cariës actieve fractie (Figuur 2A). Eerder Bergandi et al., Gerapporteerd volledige afwezigheid van sCD14 in het speeksel bij kinderen met 07:58 carieuze [28]. Het gebruik van pre-gereinigde speeksel en de methode die wordt gebruikt voor het meten van sCD14 (Western Blot versus sandwich ELISA) kunnen toeschrijven aan de waargenomen verschillen tussen het rapport Bergandi en onze studie. Figuur 2 sCD14 en sTLR-2-concentratie in speeksel: geklaarde speeksel werd ontdaan van de hoog molecuulgewicht overvloedige eiwitten, amylase en immunoglobulinen, zoals beschreven in de paragraaf werkwijzen om de gevoeligheid van het detecteren van minder overvloedig sCD14 en sTLR-2 verhogen. Het niveau van (A) en sCD14 (B) sTLR-2 werd bepaald door ELISA. * Staat voor p & lt; 0.05.
Op basis van haar sterke associatie met cariës incidentie meerdere studies onderzocht het speeksel niveaus van S.mutans
voor cariësrisico voorspelling met wisselende resultaten [1, 32]. Polymicrobiële de etiologie van tandcariës en de interactie tussen speekseleiwitten en S.mutans
kunnen bijdragen aan de variabiliteit [30, 33]. Vier types speeksel proteïne-microbe interacties waargenomen in vitro. Deze omvatten aggregatie, therapietrouw, remming /cel-doden, en voeding [33]. Er wordt verondersteld dat de waargenomen toename van sTLR-2 in cariës kunnen actieve speeksel een groot maatregel om de toegenomen Gram bestrijden vertegenwoordigen + ve cariogene bacteriën. Dit suggereert dat de speekselklieren sTLR-2-niveau een efficiënte biomarker voor cariës activiteit kan vertegenwoordigen. De grote variatie in de sTLR-2-concentratie in cariës werkzame speeksel kan worden veroorzaakt door de mate van cariës.
Conclusies
Tandcariës is een complexe ziekte, de klinische ernst afhankelijk is van de interactie tussen orale microben, beschikbaarheid fermenteerbare koolhydraten en gastheer factoren in het speeksel. Dit maakt identificatie van voorspellende risicofactoren voor het carieuze proces zeer moeilijk [5, 6]. In dit rapport zagen we dat twee oplosbare eiwitten, sCD14 en sTLR-2, die inwerken op de microbiële host-interface worden gewijzigd in cariës actieve speeksel met een latere neerkomt op een potentiële biomarker voor cariës activiteit. Toekomstig onderzoek zal de sTLR-2 niveaus correleren met de cariogene bacteriële tellingen in het speeksel
Afkortingen
UWS.
Gestimuleerde hele speeksel
TLR:
Toll like receptor.
verklaringen
Erkenning Ondernemingen de auteurs erkennen de steun van de Indiana CTSI om Alyssa Zhao verstrekt aan de zomer onderzoeksprogramma af te ronden.
Authors 'origineel ingediend -bestanden voor beelden
Hieronder staan de links naar originele ingediende dossiers van de auteurs voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12903_2014_443_MOESM2_ESM.tif Authors' 12903_2014_443_MOESM1_ESM.tif Auteurs originele bestand voor figuur 2 Concurrerende belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belang bijdragen
Auteurs 'verkopen AZ:. Alyssa is een high de school tweedejaars die de ELISA-experimenten in het kader van het beursprogramma zomer onderzoek, Project Seed, mede gesponsord door de American Chemical Society en de Indiana Clinical Vertalingen Sciences Institute uitgevoerd. Ze schreef ook de eerste versie van het hoofdstuk "achtergrond". CB: Corinne is een undergraduate onderzoek assistent die Alyssa geholpen bij het uitvoeren van de ELISA-experimenten, meer in data-analyse. Ze heeft actief deelgenomen aan monster verwerking. Zij nam ook in het manuscript schrijven. JC: Dr. Chin is de pediatrische tandarts en assisteerde bij de werving van onderzoekspopulatie en monstername. MS: is de senior onderzoeker toezicht op het project, waaronder het verkrijgen van goedkeuringen van ethische, experimenteel ontwerp en data-analyse en manuscript voorbereiding. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
