Abstracte achtergrond
ontsteking in de mondholte optreedt als gevolg van ontregeling tussen microbiële biofilms en de gastheer respons. Begrijpen hoe verschillende mondhygiëne beïnvloeden inflammatoire eigenschappen is belangrijk voor de ontwikkeling van nieuwe producten. Daarom, het creëren van een robuuste gastheer-pathogeen biofilm platform in staat is het evalueren van nieuwe orale verbindingen in de gezondheidszorg is een aantrekkelijke optie. Daarom bedachten een multi-species biofilm co-cultuur model om de natuurlijk afgeleide polyfenol resveratrol (RSV) en de gouden standaard chloorhexidine (CHX) met betrekking tot anti-biofilm en anti-inflammatoire eigenschappen te evalueren.
Methods
Een in vitro
multi-species biofilm die S. mitis, F. nucleatum, P. gingivalis
en A. actinomycetemcomitans
werd opgericht om een ziekte-geassocieerde biofilm en de mondelinge epitheliale cel in OKF6-TERT2 vertegenwoordigen. Cytotoxiciteit studies werden uitgevoerd met behulp van RSV en CHX. Multi-species biofilms werden ofwel behandeld met moleculen, of alternatief epitheelcellen werden behandeld met deze bekende co-cultuur biofilm. Biofilm samenstelling werd geëvalueerd en ontstekingsreacties gekwantificeerd bij een transcriptie en eiwitgehalte.
Resultaten
CHX was giftig voor epitheelcellen en multi-species biofilms in concentraties die variëren 0,01-0,2%. RSV heeft geen invloed op meerdere soorten biofilm samenstelling, maar was giftig voor de epitheelcellen in concentraties hoger dan 0,01%. In co-cultuur, CHX-behandelde biofilms resulteerde in neerwaartse regulatie van de inflammatoire chemokine IL-8, zowel op mRNA en eiwit niveau. RSV-behandelde epitheelcellen in co-kweek werden neerwaarts gereguleerd in de afgifte van IL-8-eiwit, maar niet mRNA.
Conclusies
CHX bezit krachtige bactericide eigenschappen, die van invloed kunnen stroomafwaarts ontstekingsmediatoren. RSV lijkt geen bactericide eigenschappen tegen meerdere soorten biofilms hebben, maar het leek te epitheelcellen onderdrukken van het vrijgeven van ontstekingsmediatoren. Dit onderzoek toont het vermogen om de mechanismen waarmee verschillende mondhygiëne tandvleesontsteking kan beïnvloeden, waardoor het gebruik van een biofilm co-kweekmodel valideren begrijpen.
Sleutelwoorden
parodontitis Biofilm Epitheelcel Elektronische aanvullend materiaal
de online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-80) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is achtergrond
Parodontitis plaatsvindt van een ontregeling tussen de bacteriële. biofilm op de tandvleesrand en de immuunreactie resulteert in irreversibele vernietiging van zowel zachte als harde weefsels ondersteuning van de tanden, uiteindelijk leidend tot verlies van tanden. In de gezondheidszorg, aangeboren en adaptieve immuunsysteem moleculen bemiddelen het evenwicht tussen de host en de overwegend Gram-positieve heterogene bacteriële schorsingen in het speeksel en hechtende biofilm gemeenschappen op zachte en harde weefsel oppervlakken in de mondholte. In parodontitis de verschuiving in de microbiota van Gram positief naar negatief soorten Gram leidt tot een ontregelde gastheer reactie van zowel de lokale weefsels en immuuncellen die ontsteking veroorzaakt en zorgt voor een niche bij de wortel voor anaerobe soorten om te overleven, verder verergeren van de ziekte [1 Tal van prokaryote soorten].
zijn geïdentificeerd in de mondholte bestaande binnen complexe biofilm ecosystemen hetzij als supra- of subgingivale plaque. Velen zijn onbeschaafd en naamloos, maar spelen allemaal belangrijke structurele en functionele rol [2]. Microarray en next generation sequencing studies van de mondelinge microbiota heeft de indeling van een aantal soorten bacteriën toegestaan in complexen op basis van associaties met gezondheid en ziekte [3, 4]. Deze zijn toegestaan studies aan soorten, zoals de ziekte-geassocieerde bacteriën Porphyromonas gingivalis
te onderzoeken, en begrijpen hun rol in tegen de gastheer reactie [5]. Echter, orale Biofilms zijn en binnen deze polymicrobiële biofilm structuren talloze intieme interactie plaatsvinden, waardoor het moeilijk om de precieze triggers bakenen voor de pathogene resultaten in verband met immune ontregeling. Daarom is het creëren van een vereenvoudigd model met een aantal van deze belangrijke ziekteverwekkers is een aantrekkelijke propositie voor gastheer-pathogeen interacties en test actieve stoffen voor de behandeling potentieel evalueren
Behandeling van parodontitis is moeilijk.; tandartsen voeren debridement op de tanden, de toediening van antimicrobiële mondwater om biofilms en in geavanceerde parodontitis, chirurgie richten. Maar successen behandeling zijn variabel en individueel en suggereren biofilm samenstelling kan het resultaat van de behandeling [6] beïnvloeden. Antimicrobiële mondwater momenteel werkzaam bij orale ziekten te beheren omvatten een scala van verbindingen met chloorhexidine (CHX) wordt beschouwd als de 'gouden standaard' vanwege zijn bacteriedodende en bacteriostatische eigenschappen [7]. Bovendien, polyfenolen, die van nature voorkomen in planten zoals druiven focus voor orale therapieën zijn geworden vanwege hun anti-inflammatoire en anti-bacteriële eigenschappen [8]. Resveratrol (RSV) is een natuurlijk afgeleide polyfenol, waarvan is aangetoond dat het krachtige anti-inflammatoire eigenschappen in verschillende kankercellen en recent parodontitis bij ratten [9, 10].
Zowel CHX en RSV wenselijke eigenschappen voor periodontitis preventie, waarbij antimicrobiële of anti-inflammatoire en antimicrobiële respectievelijk. Het doel van deze studie was daarom maken en valideren multispeciesbasis biofilm model voor gebruik in co-kweek met gastheer epitheelcellen teneinde de actieve CHX en RSV om testen te valideren of het modelsysteem gebruikt kan worden als een gevoelige methode van afbakening van hun fundamentele werkingsmechanismen. Hier melden wij dat orale epitheelcellen produceren een reproduceerbare pro-inflammatoire respons op onze multi-species biofilm aan beide genen en eiwitten niveau. Bovendien is de behandeling van een van beide epitheelcellen of multi-species biofilms met actieve resulteerde in een wijziging van een ontsteking in de co-cultuur model.
Methoden
Groei en standaardisatie van bacteriën
Porphyromonas gingivalis
ATCC 33.277, Fusobacterium nucleatum
ATCC 10.953, actinobacillus actinomycetemcomitans
ATCC 43718 en Streptococcus mitis
ATCC 12261 werden gebruikt in de loop van deze studies. P. gingivalis
ATCC 33.277 en F. nucleatum
ATCC 10596 werden gekweekt bij 37 ° C in anaërobe Schaedler bouillon (Oxoid, Cambridge, UK) gedurende 2 dagen en 1 dag, respectievelijk in een anaerobe kamer (85% N
2, 10% CO 2 en 5% H 2, [Don Whitley Wetenschappelijke Limited, Shipley, UK]). A. actinomycetemcomitans
ATCC 43.718 en Streptococcus mitis
ATCC 12261 werden gekweekt bij 37 ° C in tryptische soja bouillon (Sigma, Poole, UK) aangevuld met 0,8% w /v glucose (BDH, Poole, UK) en 0,6 % w /v gistextract (Oxoid, Cambridge, UK) gedurende 1 dag in 5% CO 2. De bacteriën werden gewassen met PBS dan gestandaardiseerd tot een OD 550 van 0,2, met uitzondering van S. mitis
, dat werd gestandaardiseerd tot een OD 550 van 0,5, in een colorimeter ongeveer 1 x 10 vinden < sup> 8 kve /ml van elk bacteriesoorten op hun gespecificeerde dag van gebruik.
actieve verbindingen
Chloorhexidine (CHX [Sigma]) en resveratrol (RSV [Sigma]) werden in deze studie gebruikt. CHX oplossing werd bereid bij 0,01, 0,05 en 0,2% v /v in keratinocyt serum vrij medium (KSFM) en gebruikt voor latere antimicrobiële testen. RSV poeder werd opgelost in DDH 2O vóór preparaat KSFM bij 0,01, 0,05 en 0,5% v /v en gebruikt voor verdere studies celstimulatie.
Ontwikkeling van multi-species biofilms
Bacteriën werden gestandaardiseerd (1 x 10 7 cfu /ml) in kunstmatig speeksel (AS), die de volgende bestanddelen bevatte, zoals eerder beschreven [11]. Dit omvatte varken maag mucinen (0,25% w /v), natriumchloride (0,35 w /v), kaliumchloride (0,02 w /v) calciumchloride dihydraat (0,02 w /v) gistextract (0,2 w /v), lab Lemco poeder (0,1 w /v), proteosepepton (0,5 w /v) in DDH 2O (Sigma, Poole, UK). Ureum werd toegevoegd om zelfstandig tot een eindconcentratie van 0,05% (v /v). Om te starten multispecies biofilm ontwikkeling van de pionier soort S. mitis
biofilm werden voor het eerst gevormd gedurende 24 uur in 5% CO 2 op 13 mm diameter Thermanox ™ dekglaasjes binnen 24 putjes (Corning, NY, USA). Het supernatant werd vervolgens verwijderd en F. nucleatum
toegevoegd, die anaëroob gedurende nog 24 uur werd geïncubeerd bij 37 ° C. Het supernatant werd verwijderd en P. gingivalis Kopen en A. actinomycetemcomitans
toegevoegd aan de dubbele soorten biofilm, anaeroob nog eens 4 dagen geïncubeerd bij 37 ° C, ter vervanging van de dagelijkse een gemengde vier soorten biofilm produceren (Figuur 1A). Figuur 1 Ontwikkeling van multi-species biofilm co-cultuur model. A. Multi-species biofilm cultuur protocol. Thermanox ™ dekglaasjes werden geplaatst in platen met 24 putjes voor biofilm cultuur. Bacteriën werden gekweekt op geschikte agarplaten en gekweekt in bouillon gedurende 1-2 dagen. Kweken werden vervolgens drie keer gewassen in PBS en herleid tot 1 x 109 CFU /ml, toegevoegd aan kunstspeeksel een 1 × 108 CFU /ml eindvolume en toegevoegd aan de biofilm op de betreffende dagen en gekweekt onder aërobe en anaërobe omstandigheden. Na 7 dagen kweken kunstmatige speeksel wordt verwijderd uit volwassen biofilms die vervolgens met PBS gewassen en bewaard bij -80 ° C. B. Opknoping mand co-cultuur model. Multi-species biofilms werden gekweekt op Thermanox ™ dekglaasjes en eerder beschreven. Epitheelcellen (OKF6-TERT2) werden geënt in platen met 24 putjes bij 1 x 105 cellen /ml in celkweekmedium. Biofilms werden omgekeerd bevestigd aan Millipore celkweek inserts gebruik van Vaseline en geplaatst over putjes die cellen. Cellen en biofilms werden samen gekweekt gedurende 4 en 24 uur.
Kwantitatieve analyse van biofilm samenstelling
real-time kwantitatieve PCR (qPCR) werd vervolgens uitgevoerd om de definitieve en relatieve samenstelling van de biofilms opsommen. Kort gezegd werden bacteriële biofilms verwijderd door sonicatie in een sonisch bad op 35 kHz gedurende 10 min, zoals eerder beschreven [12]. Voor qPCR werd de biofilm ultrasone trillingen gebruikt voor DNA extractie met de MasterPure Gram positieve DNA Purificiation Kit (Epicentre®, Cambridge, UK), volgens instructies van de fabrikant, met dien verstande dat de sonicaat werd gedurende 4 uur tot cellysis te garanderen. Het geëxtraheerde DNA onderging kwaliteitscontroles met behulp van de NanoDrop spectrofotometer (Fischer Scientific, Loughborough). In het kort werd 1 pl gewonnen DNA om een mastermix die 12,5 ul SYBR® groener ™, 9,5 ul UV-behandeld RNase-free water en 1 pi van 10 uM vooruit /achteruit primers voor elke bacteriesoorten toegevoegd. De primers die werden eerder gepubliceerd, zoals vermeld in Tabel 1. Drie onafhankelijke replicaten van elke parameter werden geanalyseerd in drievoud met behulp MxProP kwantitatieve PCR machine en MxProP 3000 software (Stratagene, Amsterdam, Nederland). Monsters werden gekwantificeerd met de kolonievormende equivalent (CFE) op basis van een vooraf vastgestelde standaardcurve van bacteriële kolonievormende eenheden variërend berekenen van 1 x 10 3-10 8 cfu /ml. De R 2 waarden voor deze standaard curves varieerde 0,956-0,994. Smeltcurve analyse werd uitgevoerd voor alle primer bevat een enkele piek, die indicatief primer specificiteit te garanderen. Biofilm architectuur werd vervolgens geanalyseerd door scanning elektronenmicroscopie (SEM). Voor deze biofilm monsters in PBS waren gewassen, gefixeerd in 2% paraformaldehyde, 2% gluteraldehyde, 0,15% w /v Alcian Blue in 0,15 M natriumcacodylaat (pH 7,4) [13]. De vaste en gedroogde monsters werd sputter-bekleed met goud en bekeken onder een JEOL JSM-6400 scanning elektronenmicroscoop [14] .table 1 Primers gebruikt in deze studie qPCR
Gene
Forward 5'-3 '
Reverse 5'-3'
Reference
cytokine
IL-8
CAGAGACAGCAGAGCACACAA
TTAGCACTCCTTGGCAAAAC
[15]
GAPDH
CAAGGCTGAGAACGGGAAG
GGTGGTGAAGACGCCAGT
[15]
Bacteriesoorten
S. mitis
GATACATAGCCGACCTGAG
CCATTGCCGAAGATTCC
[16]
F. nucleatum
GGATTTATTGGGCGTAAAGC
GGCATTCCTACAAATATCTACGAA
[17]
P. gingivalis
GCGCTCAACGTTCAGCC
CACGAATTCGCCTGC
[18]
A. actinomycetemcomitans
GAACCTTACCTACTCTTGACATCCGAA
TGCAGCACCTGTCTCAAAGC
[19]
Ontwikkeling van een epitheliale biofilm co-cultuur model
OKF6-TERT2 cellen (soort geschenk van de Rheinwald laboratorium, Brigham en Woman's Hospital , Boston) zijn een geïmmortaliseerde humane orale keratinocyten cellijn [20] werd gedurende deze onderzoeken gebruikt. OKF6 cellen werden gekweekt in keratinocyt serum-vrij medium (KSFM) zoals eerder beschreven [21]. Bij 90% confluentie werden de cellen getrypsiniseerd, in Hanks gebalanceerde zoutoplossing gewassen vervolgens opnieuw gezaaid tot ongeveer 1 × 10 5 cellen /mL en gezaaid op een Thermanox ™ dekglaasje binnen een 24 goed celkweek plaat (Corning, NY, VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). De epitheelcellen werden gewassen en vervolgens onderworpen aan provocatie met omgekeerde biofilms, bevestigd met Vaseline om opknoping celkweek inserts (Millipore, MA, USA) zoals geïllustreerd in figuur 1B. De biofilms op Thermanox ™ schijfjes werden uit de epitheliale cellen op de bodem van de put door een kleine ruimte & lt, 0,5 mm, vertegenwoordiger van een spleet tandvlees. Multispecies biofilms werden in het co-cultuurmodel van 4 en 24 uur en de levensvatbaarheid van de epitheelcellen ± actieve behandelingen (CHX en RSV) geëvalueerd onder toepassing van een metabolische bepaling van 10% v /v alamarBlue® volgens de instructies van de fabrikant ( Life Technologies, Paisley, UK). Na 4 uur incubatie werd de absorptie afgelezen bij 570 nm en de referentie-golflengte bij 600 nm, en de procentuele verlaging van biofilm levensvatbaarheid berekend volgens de formule van de fabrikant.
Beoordelen ontstekingsreactie tijdens biofilm gelijktijdig kweken
supernatanten en cellysaten werden verzameld uit OKF6 /TERT2 cellen gestimuleerd met verschillende multispecies biofilms, die werden gebruikt voor eiwit en transcriptionele analyse, respectievelijk, de regulering van pro-inflammatoire mediatoren beoordelen. Initial genexpressie analyse werd met behulp van een speciaal ontworpen RT uitgevoerd 2 Profiler PCR Array (Qiagen, Crawley, UK). RT 2 Profiler arrays zijn een SYBR® groener ™ op basis van real-time PCR die het mogelijk maken voor de detectie van meerdere genen van belang, tegelijk. In het kort werd RNA geëxtraheerd uit cellysaten (Qiagen, Crawley, UK) en 55 ng /ul cDNA gesynthetiseerd met behulp van de RT 2 First Strand cDNA synthese kit (Qiagen, Crawley, UK), volgens instructies van de fabrikant. Kort, 24 ui van een mastermix met SYBR ™ Greener, cDNA gesynthetiseerd met behulp van de RT 2 First Strand kit (Qiagen) en RNase-vrij water werd toegevoegd aan elk putje van de RT 2 Profiler plaat, die reeds bevatte de voorwaartse en achterwaartse primers voor genen (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF, CB 2., CSF3, IL-8, CXCL1, CXCL3, CXCL5, CCL1 en GAPDH), gebaseerd op experimentele gingivitis model [22]. Twee herhalingen van elke conditie werden gebruikt in de RT 2 Profiler, die op twee verschillende gelegenheden werd uitgevoerd.
Verdere controle werd uitgevoerd met IL-8 genexpressie geanalyseerd met SYBR® Green gebaseerde qPCR (Invitrogen) met behulp GAPDH als een housekeeping gen. Primersequenties en referentiebronnen zijn opgesomd in tabel 1. Alle primers werden getest tegen elke bacteriële species specificiteit te garanderen, wat het geval was (gegevens niet getoond). RNA werd gesynthetiseerd in cDNA vervolgens toegevoegd aan een mastermix die 12,5 ul SYBR® groener ™, 10,5 ui UV-behandeld RNase-vrij water en 0,5 pl vooruit /achteruit primers. Drie onafhankelijke herhalingen van elke parameter in duplo geanalyseerd middels MxProP kwantitatieve PCR machine en MxProP 3000 software (Stratagene, Amsterdam, Nederland) en genexpressie in dat van de housekeeping gen GAPDH volgens de 2 -ΔΔCT
methode [23 ]. IL-8 afgifte in celcultuur supernatanten werd bepaald door ELISA (Invitrogen, Paisley, UK), volgens instructies van de fabrikant. Resultaten werden berekend onder toepassing van een 4-parameter fit curve, kwantificeren colometrische veranderingen bij 630 nm (BMG-Labtech, Ortenberg, Duitsland).
Statistische analyse
Grafiek productie, distributie en de statistische analyses werden uitgevoerd onder toepassing van GraphPad Prism (version 4, La Jolla, CA, USA). Na beoordeling van de vraag of de gegevens gelijkvormig aan een normale verdeling van voor en na de data transformeert, One-way Variantie-analyse (ANOVA) en t
tests werden gebruikt om significante verschillen tussen onafhankelijke groepen gegevens die benaderd om een Gauss-verdeling te onderzoeken. Een Bonferroni-correctie werd aangebracht op de p-waarde rekenschap voor meerdere vergelijkingen van de gegevens. Niet-parametrische gegevens werden geanalyseerd met de Mann-Whitney U-test om verschillen tussen twee onafhankelijke monstergroepen beoordelen. Student t-tests werden gebruikt om statistische verschillen tussen de Δ
Ct-waarden van de twee onafhankelijke groepen geëvalueerd genexpressiestudies meten, maar gegevens kunnen worden weergegeven als percentage of voudige verandering in de figuren. Statistische significantie werd bereikt als P & lt; 0.05
.
Resultaten
Kwantitatieve analyse van een multi-species parodontale biofilm model
ultrageluid behandeld multi-species biofilms werden gekwantificeerd door qPCR (Figuur 2A). Er werd aangetoond dat kwantitatief dat S. mitis
was de dominante soorten in de mature biofilm (1,36 x 10 7 CFE /ml; 83,24%), gevolgd door
F. nucleatum
(2,28 × 10 6; 15,16%), P. gingivalis
(3,53 x 10 4; 1,01%) en A. actinomycetemcomitans
(1,13 x 10 5; 0,58%). De biofilm samenstelling werd vervolgens onderzocht met behulp van SEM-analyse. De biofilm werd aangetoond dat een dichte complex van verschillende morfotypen gedomineerd door F. nucleatum
(Figuur 2B en C) zijn. Figuur 2 Analyse van de multi-species biofilms in anaerobe en aerobe omstandigheden. Meerdere soorten biofilm werden gekweekt op Thermanox ™ dekglaasjes in platen met 24 putjes gedurende 6 dagen zoals eerder beschreven. Na rijping DNA werd geëxtraheerd met behulp Masterpure ™ Gram-positieve DNA-zuivering kit voor het kwantificeren van elke soort gebruik SYBR® Greener ™ gebaseerde qPCR (A). Biofilm morfologie werd geanalyseerd met SEM bij 2000x (b) en 5000x (c). Monsters werden verwerkt en bekeken op een JEOL JSM-6400 scanning elektronenmicroscoop en afbeeldingen geassembleerd met behulp van Photoshop-software. Biofilms kan worden gezien als complex (B) zijn. Bij hogere vergrotingen verschillende morfologieën kunnen worden geïdentificeerd met S. mitis Kopen en F. nucleatum
die de meerderheid van de biofilm (C). Volwassen biofilms werden ook gekweekt in celkweekmedium in 5% CO2 gedurende 4 en 24 uur voor DNA-extractie en kwantificering van elke soort middels middels SYBR ™ Greener gebaseerd qPCR (D). Alle monsters werden in drievoud getest bij drie verschillende gelegenheden. Gegevens zijn gemiddelden ± SD.
Om het multi-species biofilms in co-kweek met epitheelcellen testen, onderzochten wij het effect van bewegen van de biofilm van anaërobe omstandigheden in AS tot 5% CO 2 in KSFM. Hiervoor evalueerden we de biofilm samenstelling zoals hierboven beschreven. Geen significante verschillen waargenomen in de samenstelling en hoeveelheid van de 4 soorten binnen de CO 2 biofilm op 4 en 24 uur (Figuur 2D). Er was geen significant verschil tussen 24 uur biofilms gevormd onder anaërobe omstandigheden en die vervolgens in CO 2 geplaatst gedurende nog eens 24 uur. Deze biofilms werden vervolgens gebruikt in een co-kweeksysteem om de biologische eigenschappen van twee verschillende biologisch actieve middelen onderzoeken.
Onderzoek naar de effecten van biologisch actieve middelen in een multi-species biofilm epitheelcel co-cultuurmodel
Eerste, optimaliseren de concentraties van RSV en CHX te testen in dit model ondernamen we cytotoxiciteit proeven zowel epitheelcellen en biofilms.Oral epitheliale cellen werden gedurende 30 min met drie concentratie van de antimicrobiële actieve CHX (0,01, 0,05, 0,2% v /v ) en anti-inflammatoire actieve RSV (0,01, 0,05, 0,5% w /v) vóór het wassen met PBS en gedurende 4 en 24 uur voor cellevensvatbaarheid werd bepaald met een gemeten AlamarBlue® assay. De gegevens toonden een significante afname (p & lt; 0,001) in cellevensvatbaarheid in vergelijking met de onbehandelde media regelt wanneer epitheliale cellen worden geïncubeerd met CHX bij concentraties zowel 4 en 24 uur (Figuur 3A). Wanneer epitheliale cellen werden samen gekweekt met RSV significante afname in cellevensvatbaarheid in vergelijking met de mediacontrole werden waargenomen onder toepassing van 0,05 en 0,5% w /v RSV concentraties aan beide 4 (p & lt; 0,001) en 24 h (p & lt; 0,01), met een ongeveer 50% afname in cellevensvatbaarheid op elk tijdspunt (Figuur 3B) .Next, uit deze gegevens de taken uit voor de rest van de studie concentraties 0,2% v /v CHX en 0,01% w /v RSV. Multi-species biofilms werden behandeld met de gekozen concentraties van actieve stoffen voor 30 min en biofilm levensvatbaarheid gemeten met een assay AlamarBlue® (Figuur 3C). Behandeling van het multispecifieke biofilm met RSV geen significante invloed op biofilm levensvatbaarheid in vergelijking met de onbehandelde controle biofilm. Echter, een CHX een significante vermindering (p & lt; 0,001) van 75% in bacteriën levensvatbaarheid vergeleken met de onbehandelde biofilm.To bepalen of behandeling met deze actieve species veranderde de samenstelling van de biofilm, werden ze gedurende 30 min vervolgens DNA onttrokken en kwantificering van elke soort uitgevoerd door qPCR (Figuur 3D). De gegevens tonen geen significante verandering in de samenstelling na een 30 minuten behandeling met CHX of RSV in vergelijking met de onbehandelde biofilm. Om verder te onderzoeken Daartoe SEM-analyse werd uitgevoerd om het effect van elk werkzaam op de architectuur van de biofilms nabehandeling (Figuur 3E-J) te onderzoeken. CHX bleek de biofilm destabiliseren, de complexiteit van de biofilm verlaagd, terwijl RSV bleek geen zichtbaar effect op de architectuur hebben. Figuur 3 Direct effect van actieve stoffen op de orale epitheelcellen en multi-species biofilms. De orale epitheliale cellijn OKF6-TERT2 werd gezaaid met 1 x 105 cellen /ml in 24 well platen voor toxiciteit. Cellen werden behandeld met concentraties CHX (0,01, 0,05, 0,2% v /v) (A) en RSV (0,01, 0,05, 0,5% w /v) (B) gedurende 30 minuten vóór het wassen met PBS. Levensvatbaarheid van de cellen werd vastgesteld met behulp van Alamarblue® assay met absorptie afgelezen bij 570 nm en 600 nm. Na deze concentratie gekozen voor de rest van de studie werden CHX 0,2% (v /v) en RSV 0,01% (w /v). Om de rol van actieve biofilm behandeling biofilms onderzoeken werden gekweekt op dekglaasjes in platen met 24 putjes gedurende 6 dagen zoals eerder beschreven. Mature biofilms werden behandeld met 0,2% v /v CHX en 0,01% w /v RSV gedurende 30 minuten vóór het wassen met PBS. Biofilm levensvatbaarheid werd gemeten met Alamarblue® afgelezen bij 570 nm en 600 nm (C). Bacterieel DNA werd geëxtraheerd en elke soort gekwantificeerd met behulp van SYBR® groener ™ gebaseerde qPCR (D). Biofilms werden ook geanalyseerd met SEM zowel 2000x (E, G, I) en 5000 x (F, H, J). Monsters werden verwerkt en bekeken op een JEOL JSM-6400 scanning elektronenmicroscoop en afbeeldingen geassembleerd met behulp van Photoshop-software. Onbehandelde biofilms (E, F) vergeleken met biofilms behandeld met 0,2% (v /v) CHX (G, H) en en 0,01% (w /v) RSV (I, J). Monsters werden geanalyseerd in drievoud driemaal en data zijn gemiddelden ± SD (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
Vervolgens hebben we de effecten van de onbehandelde multispecifieke biofilm geëvalueerd gestimuleerd OKF6 cellen om de biofilm geïnduceerde inflammatoire mediatoren waarborgen. Met de RT 2 Profiler vergeleken we biofilm gestimuleerde cellen aan controlecellen media na 4 uur de inflammatoire eigenschappen van het model (tabel 2) te bepalen. Significante verhogingen werden waargenomen voor alle genen op het RT 2 profiler geselecteerd op basis van hun expressie tijdens opgewekt experimentele gingivitis bij de mens, variërend van 4,39 fold change (CCL1) tot 249,8 fold change (IL-8), met een gemiddelde voudige verandering van 60 in vergelijking met de gestimuleerde controle media. Deze gegevens werden geverifieerd door onderzoeken IL-8 met behulp van specifieke primers bij een reverse transcriptase (RT) qPCR assay (figuur 4B). Een significante toename waargenomen van een 15,57 voudige verandering (p & lt; 0,001) na 4 uur en 312,88 veelvoudverandering (p & lt; 0,001) na 24 uur in vergelijking met de controle media (tabel 2). Tenslotte evalueerden we de cel supernatanten voor de vrijlating van IL-8 binnen dit systeem, waarin werd aangetoond dat na 4 uur (535 ng) en 24 uur (450 ng) dat IL-8 afgifte aanzienlijk werd verhoogd (p & lt; 0,001 ) vergeleken met de onbehandelde media controles (Figuur 4C). Op basis van deze collectieve gegevens, hebben we aangetoond dat de 4-soorten biofilm heeft reproduceerbare ontstekingseigenschappen in epitheliale co-kweek model.Table 2 Pro-ontstekingsreactie op onbehandelde biofilms
Gene Gids Gemiddelde verdubbeling
SD (±)
Betekenis
IL-1
10,820
8,918
p & lt ; 0.05
IL-1B
12,662
1.161
p & lt; 0.05
IL-6
31,876
2,366
p & lt; 0.001
TNF
48,821
24,623
p & lt; 0.001
CSF-2
59,200
28,294
p & lt; 0.001
CSF-3
43,331
37,126
P & lt; 0.001
IL-8
249,805
189,93
p & lt; 0.001
CXCL1
121,892
56,676
p & lt; 0.001
CXCL3
63,843
26,213
p & lt; 0.001
CXCL5
14.435
14.474
n/s
CCL1
4.397
4.629
n/s
Figuur 4 CHX en RSV immunomodulate epitheliale cel responsen op meerdere soorten biofilm co-cultuur in vitro. De orale epitheliale cellijn OKF6-TERT2 werd gezaaid met 1 x 105 cellen /ml in 24 well platen voor gelijktijdige kweek met meerdere soorten biofilms. Biofilm werden voorbehandeld met 0,2% (v /v) CHX of cellen werden behandeld met 0,01% (w /v) RSV gedurende 30 minuten vóór het wassen met PBS en daarna samen gekweekt met onbehandelde biofilms of cellen respectievelijk 4 en 24 uur. Onbehandelde controle co-kweek werden ook opgenomen. RNA werd geëxtraheerd uit de cellysaten van 4 uur werd cDNA gesynthetiseerd en ontstekingsbevorderende genexpressie gekwantificeerd op RT2 profiler plaat (A). Duplicaatmonsters van drie onafhankelijke experimenten werden gebruikt en gegevens zijn gemiddelde ± SD ten opzichte van media controle. De monsters werden ook geanalyseerd op IL-8 ten opzichte huishoudgen GAPDH op 4 en 24 uur middels middels SYBR ™ Greener gebaseerd qPCR (B). Supernatanten werden geanalyseerd op exogeen IL-8, gemeten met ELISA (C). De monsters werden getest in drievoud van drie onafhankelijke experimenten, data zijn gemiddelden ± SD (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
Vervolgens hebben we bepaald hoe CHX behandeling van de biofilm getroffen ontsteking. De co-kweek model werd gebruikt met biofilms behandeld met 0,2% CHX gedurende 30 min. Gelijktijdige kweek epitheliale cellysaten en supernatanten werden verwijderd te worden getest verhoogde gen- en eiwit ontstekingsfactoren. Een onbehandelde biofilm en epitheelcellen niet samen gekweekt met meerdere soorten biofilm werden als controles. Na 4 h co-stimulatie met CHX behandelde biofilms toonden we geen significant verschil in genexpressie met behulp van de RT 2 profiler, hoewel IL-8 en CXCL1 werden fors omlaag (figuur 4A). Verdere analyse van IL-8 met behulp qPCR opnieuw toonde geen significant verschil in expressie in 4 uur, terwijl bij 24 uur een significante daling van 5,65 maal de CHX waargenomen behandelde biofilm gestimuleerde cellen (p & gt; 0,001) (figuur 4B). IL-8-eiwitexpressie werd eveneens gemeten bij 4 uur en 24 door ELISA. Een significante reductie (p & lt; 0,001). IL-8-eiwit werd waargenomen na 4 uur (10 maal) en 24 uur (13-voudig) vergeleken met de onbehandelde controle (Figuur 4C)
slot evalueerden wij de effect van RSV behandelde epitheelcellen in de co-cultuur model. Epitheliale cellen werden gedurende 30 min met RSV, gewassen en co-geïncubeerd met onbehandelde biofilms op 4 en 24 uur. De RT 2 profiler toonde geen significante verschillen in genexpressie na 4 uur in vergelijking met onbehandelde biofilms (Figuur 4A). Verdere analyse van IL-8 bij 4 en 24 uur toonde ook geen significante verschillen in expressieniveau (figuur 4B). Echter, een significante afname in IL-8-eiwit niveaus 4 uur (25-voudig; p & lt; 0,001) en 24 uur (13-voudig; p & lt; 0,01) waargenomen in vergelijking met de onbehandelde biofilm co-kweekmodel (Figuur 4C ).
Discussie
met behulp van experimentele in vitro
biofilm modellen om interacties tussen biofilms te onderzoeken en gastheer epitheelcellen is van essentieel belang voor het begrip van de mechanismen van de ziekte pathologie en hoe actieven kan de host reactie beïnvloeden. Met deze maat multispecifieke biofilm model hebben wij aangetoond dat de epitheliale ontstekingsreactie op meerdere soorten biofilms kan worden gewijzigd van antimicrobiële en anti-inflammatoire verbindingen. Ondernemingen De gegevens tonen co-kweken van epitheelcellen en onbehandeld meervoudige -soorten biofilms produceren een aanzienlijke toename van zowel gen- en eiwitexpressie op 4 en 24 uur. IL-8-eiwit niveaus waren significant verhoogd zowel 4 en 24 uur in co-kweek van epitheelcellen en onbehandelde multispecifieke biofilms vergeleken met de cellen alleen controle. Bovendien verhogingen in genexpressie van verschillende pro-inflammatoire cytokines en chemokines zoals IL-6, IL-8, TNF, CSF-2, CXCL1 en CXCL3 in 4 uur, vergeleken met de controle cellen alleen waargenomen. Deze dynamische veranderingen in pro-inflammatoire mediatoren tonen dat er interactie tussen het complex biofilm en epitheelcellen.
