Abstracte achtergrond
De toenemende belangstelling voor probiotische lactobacillen in de gezondheid onderhoud heeft de kwestie van de mogelijke risico's verhoogd. Een mogelijke bijwerking kan een verhoogd acidogenicity in de tandplaque zijn. Het doel van deze studie was om het effect van probiotische lactobacillen op plaque melkzuur (LA) productie in vitro Kopen en in vivo onderzoeken
.
Werkwijzen
In het eerste deel (A), suspensies van twee stammen lactobacilli (L. reuteri DSM 17938
, L. plantarum 299v
) werden toegevoegd aan suspensies van supragingivale tandplaque verzameld van gezonde jonge volwassenen (n = 25). LA productie na de gisting met ofwel xylitol of fructose werd geanalyseerd. In het tweede deel (B), patiënten (n = 18) waren gegeven zuigtabletten met probiotische lactobacilli (L. reuteri
DSM 17938 en ATCC PTA 5289) of placebo gedurende twee weken in een dubbelblinde, gerandomiseerde cross-over studie . De concentratie van LA in subgingivale plaque monsters werd bepaald bij aanvang en na 2 weken. Speeksel tellingen van mutans streptococcen (MS) en lactobacillen werden geschat met stoel-side methodes.
Resultaten
Plaquette schorsingen met L. reuteri
DSM 17938 produceerde significant minder LA vergelijking met L. plantarum
299v of controles (p & lt; 0,05). Fructose gaf hogere LA concentraties dan xylitol. In deel B, waren er geen significante verschillen in LA productie tussen baseline en follow-up in een van de groepen en geen verschillen tussen test- en placebo werden getoond. Het speeksel MS tellingen werden niet significant veranderd tijdens de interventie maar de lactobacillen tellingen aanzienlijk toegenomen in de testgroep (p & lt; 0,05).
Conclusie
Melkzuur productie in suspensies van plaque en probiotische lactobacillen was stam-afhankelijk en de Deze studie levert geen bewijs voor een toename van de plaque de zuurgraad door het aanbod van geselecteerde probiotische lactobacillen wanneer uitgedaagd door fructose of xylitol. De studie protocol werd goedgekeurd door de Deense Nationale Commissie voor Biomedical Research Ethics (protocol geen H-2-2010-112).
Trial registratie & NCT01700712
Electronic aanvullend materiaal
de online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-12-44) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is achtergrond
probiotische bacteriën al lange tijd gebruikt voor het verbeteren van gastro-intestinale gezondheid [1]. en er zijn steeds meer aanwijzingen dat de lactobacilli-afgeleide probiotische bacteriën kunnen ook nuttig zijn invloed op de mondgezondheid te hebben. Verschillende studies hebben aangetoond een daling van de orale mutans streptococcen tellingen na korte termijn de consumptie van L. reuteri
[2-5] en L. rhamnosus
[6] en een paar een effect op cariës preventie en bestrijding hebben aangetoond [7-9]. Echter minder aandacht besteed aan het potentiële risico van probiotische gebruik. Lactobacilli worden beschouwd als een deel van de bewoner orale microflora maar verhoogde tellingen gemeld na probiotische regimes [10]. Lactobacilli zijn zeer acidogene en aciduric maar vooral in de diepe carieuze [11] en derhalve niet beschouwd als zijnde betrokken bij de initiatie van cariës laesie. Het vermogen van probiotische lactobacilli suikers fermenteren aangetoond afhankelijk van het type suiker zijn en variëren tussen de verschillende stammen in vitro
[12]. Bijvoorbeeld, stammen van L. plantarum
geproduceerd zuren in een snel tempo, terwijl L. reuteri langzaam zwakke reacties met glucose, lactose, sucrose, maltose
gegenereerd en melibiose zowel onder aërobe en anaërobe omstandigheden [12]. Echter, de klinische relevantie van deze bevindingen dun onderzocht. Onlangs, Marttinen en medewerkers [13] gemeld dat de inname van tabletten die ofwel L. rhamnosus GG
of L. reuteri
leek niet het melkzuur niveaus in de tandplaque beïnvloeden. Onder toevoeging van probiotische bacteriën vele in de handel verkrijgbare producten en hun toenemende consumptie, studies over de veiligheid van lactobacillen bedoeld voor oraal gebruik zijn belangrijk. Ons doel was dan ook om het effect van probiotische lactobacilli op melkzuurproductie in subgingivale plaque in vitro onderzoeken
en in vivo
. De nulhypothese was dat de acidogenicity niet zou verschillen van placebo of controles
Methods
Het onderzoek werd uitgevoerd in twee delen.; een laboratorium studie en een dubbelblinde, gerandomiseerde cross-over studie. Voor de klinische bestanddeel een vermogenberekening (α = 0.05 en β = 0,20) op basis van proef resultaten gaven aan dat 18 proefpersonen respectievelijk nodig waren in de test en de placebogroep. De probiotische stammen die in beide delen zijn commercieel verkrijgbaar en worden gebruikt in vruchtendranken en tabletten. De studie protocol werd goedgekeurd door de Deense Nationale Commissie voor Biomedical Research Ethics (protocol geen H-2-2010-112). Klinische trial nummer NCT01700712.
Deel A
Vijfentwintig gezonde jonge volwassenen van beide seksen (gemiddelde leeftijd 27 jaar) met compromisloze mondgezondheid (gemiddelde DMFT (rotte, Gemist, Filled Teeth) = 4) werden geïncludeerd na geïnformeerd toestemming. Geen van de proefpersonen waren gewone consumenten van probiotische producten. Zij werden geïnstrueerd om geen tandenpoetsen gedurende 24 uur voordat hun bezoek. Supragingivale tandplaque werd verzameld van alle tanden met een stompe explorer, samengevoegd en overgebracht naar een plastic buis. De verse monsters werd gesuspendeerd en gehomogeniseerd in PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) (pH = 7,2) en ingesteld op een optische dichtheid van OD = 0,2 bij 340 nm. Vijfhonderd ul van de plaque suspensies werden daarna gemengd met 500 pi even dichte suspensies van beide L. reuteri
DSM 17938 (Biogaia, Stockholm, Zweden) of L. plantarum
299v (Probi AB, Lund, Zweden) in PBS. De lactobacilli stammen werden in Man Rogosa Sharpe (MRS) bouillon (Oxoid Ldt., Basingstoke, Hampshire, UK) onder anaërobe incubator 24 uur gekweekt bij 37 ° C en vervolgens in PBS tweemaal gewassen. Eén ml van de suspensie plaque zonder toevoeging van probiotische bacteriën diende als controle. Ook één ml suspensies van lactobacilli met dezelfde optische dichtheid als de andere monsters werden gebruikt als controles. Baseline spectrofotometrische (Genesys 10 uv scannen, Thermo Scientific, MA, USA) waarden werden geregistreerd en de suspensies werden vervolgens gedurende 1 uur bij 37 ° C zonder schudden. De OD-aflezingen werden herhaald en de zuurproductie werd geïnitieerd door toevoeging van 25 pi fructose (10%) en xylitol (10%) aan elk monster. Na 30 minuten verdere incubatie, werd de fermentatie gestopt door centrifugatie gedurende 2 min (10.000 rpm) en het supernatant werd voor verdere analyse onttrokken. De concentratie van de L- en D- isomeren van melkzuur (LA) werd enzymatisch bepaald en uitgedrukt als pg /ml met behulp van een commerciële kit (EnzyPlus, Biocontrol) volgens de instructies van de fabrikant. Alle assays werden in duplo en de gemiddelde som van de L- en D-isomeren werden berekend.
Deel B
Dertig subjecten werden gescreend op de aanwezigheid van speeksel mutans streptokokken en achttien aanmerking kwamen voor de klinische studie (14 vrouwelijk, 4 man; gemiddelde leeftijd = 26 jaar; DMFT = 2). De criteria voor opname waren i)
matige tot hoge tellingen van speeksel mutans streptococcen (& gt; 10
4 CFU) zoals geschat met de Dentocult SM stoel-side test, ii)
geen zichtbare geopend cariës laesies of parodontale ziekte, en iii)
zijnde niet-rokers. Bovendien geen van de proefpersonen consumeerden probiotische producten of waren antibiotica in de afgelopen twee maanden. Na toewijzing groep en een run-in periode van 3 dagen (fase 1) met professionele gebitsreiniging, werden de deelnemers geïnstrueerd om drie tabletten per dag in te nemen ( 's morgens,' s middags en 's avonds) die ofwel twee stammen van de probiotische bacterie L. reuteri
(DSM 17938 en ATCC PTA 5289; 1x10 8 CFU van elke stam) of placebo gedurende 2 weken (fase 2). Zowel tabletten werden door BioGaia AB (Zweden). Gestimuleerde speekselmonsters werden verzameld na 3 minuten van het kauwen paraffine tandvlees. Gepoolde supragingivale plaque monsters werden verzameld bij aanvang en na de interventie. Aantallen mutans streptococcen en lactobacillen
in het speeksel werd bepaald met behulp van een testkit (Dentocult SM Strip mutans en Dentocult LB respectievelijk Orion Diagnostica, Finland) volgens de richtlijnen van de fabrikant. Worden de monsters verzameld tussen 10 en 11:00 voor de lunch en ongeveer 3-4 uur na het nuttigen van de laatste tablet. Na 3 weken uitwasperiode (fase 3), werd de 2-weken interventie herhaald met de tweede tablet (fase 4). Nogmaals, baseline en follow-up werden verzameld. De tabletten werden geleverd en gecodeerde A of B door de fabrikant en de test en placebo producten waren identiek smaak, samenstelling en uiterlijk. De code werd niet onthuld tot na de analyses en de statistische berekeningen. Tijdens alle fasen, werden de proefpersonen gevraagd om hun normale mondhygiëne routines te behouden, waaronder tanden poetsen met fluoride tandpasta. Ze werden echter stevig verzocht om de inname van elke etenswaren, aangevuld met probiotische bacteriën te voorkomen.
Laboratorium assays
Alle analyses en bacteriële tellingen zonder kennis van de toewijzing groep werden gemaakt. De speeksel monsters werden respectievelijk geïncubeerd in 2 en 4 dagen bij 37 ° C voor de aanwezigheid van mutans streptococcen en lactobacillen hotels met behulp van selectieve chair-vergelijkingstests (Dentocult SM en LB, respectievelijk Orion Diagnostica, Helsinki, Finland) volgens de instructies van de fabrikant. De kolonievormende eenheden werden geteld in een stereomicroscoop (12-25 x vergroting) door één onderzoeker en punten in categorie zoals beschreven in Tabellen 1 en 2. De concentratie van LA in de plaquemonsters werd in duplo bepaald zoals boven beschreven met de verse plaque samples.Table 1 speekselklieren lactobacillen score
lactobacilli score
0 (0 CFU /ml)
1 (103 CFU /ml ) kopen van 2 (104 CFU /ml)
3 (& gt; 105 CFU /ml)
p
Test BL
9
4
1
4
& lt; 0.05
Test FU
0
4
10
4
Placebo BL
7
5
4 kopen van 2
NS
Placebo FU
5
6
4
3
monsters verzameld van patiënten (n = 18) alvorens (BL) en na (FU) een 2 weken durende interventieperiode met L. reuteri golfreizen of placebo. NS = niet significant
Tabel 2 mutans streptococcen score
Streptococcus mutans scoren
0 (& lt; 103 CFU /ml).
1 (103 & lt; 104 CFU /ml) kopen van 2 (104 & lt; 105 CFU /ml)
3 (≥105 CFU /ml)
p
Test BL kopen van 2
4
8
4
NS
Test FU
1
7
6
4
Placebo BL
2
5
6
5
NS
Placebo FU
1
verhuur 4
9
4
monsters verzameld van patiënten (n = 18) vóór (BL) en na (FU) een 2 weken durende interventieperiode met L. reuteri golfreizen of placebo. NS = niet significant.
Statistische methoden
gegevens werden verwerkt met de IBM SPSS-software (versie 19.0, Chicago Ill, USA). In deel A, verschillen in uitkomst tussen probiotische stammen versus controle werd geanalyseerd met Wilcoxon sign rank test. In deel B, werd zuurproductie vergeleken vóór en na de ingreep binnen groepen en tussen de groepen voor en na de interventie van Wilcoxon rank test ondertekend. Verschillen in lactobacillen en mutans streptococcen werden geanalyseerd met behulp van Chi-kwadraat-test. Een p-waarde & lt; 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Betrouwbaarheid van de bacteriële scoring werd geanalyseerd op een aselecte steekproef (20%) van de tests en de intra examinator correlatie toonde een ICC-waarde van 0,97.
Resultaten
deel A
Al plaque monsters van de 25 proefpersonen detecteerbare niveaus van melkzuur en de niveaus van fructose geïnitieerd waren significant hoger dan die van xylitol (figuur 1). Er werden echter aanzienlijke inter-individuele variaties genoteerd. Na de gisting met fructose, de plaquette suspensies gemengd met L. reuteri
DSM 17938 produceerde significant minder LA in vergelijking met zowel de controlemonsters en de monsters met L. plantarum
299v (p & lt; 0,05). Er waren geen statistisch significante verschillen tussen de controlemonsters en de monsters met L. plantarum 299v
. De controle-suspensies die slechts één van de twee lactobacilli in beide gevallen werd de zuurproductie van dezelfde grootte als de plaque controle (L. reuteri
DSM 17938: gemiddelde 6.0 (4.8) en L. plantarum
299v: gemiddelde 9.3 (5.9 )). Na zuurproductie ingeleid xylitol, een statistisch significant (p & lt; 0,035) verschil tussen het controlemonster en de monsters met L. reuteri DSM 17938
werd verkregen. Echter geen significante verschillen tussen de controlemonsters en de monsters met L. plantarum 299v
of tussen de twee monsters met toegevoegde probiotische lactobacilli werden waargenomen. De monsters waarin xylitol om pure suspensies van een van de lactobacillen zowel werd toegevoegd toonde iets lagere waarden dan de plaquette schorsing, maar verschilde niet significant (L. reuteri
DSM 17938: gemiddelde 0.5 (3.4) en L. plantarum
299v: betekenen 3,4 (3,5)). Figuur 1 Gemiddelde melkzuurproductie in plaque suspensies en onder toevoeging van L. plantarum 299v en L. reuteri DSM 17938 na fermentatie van fructose (a) en xylitol (b). De controles zijn plaquette schorsingen zonder probiotische bacteriën. De getoonde waarden zijn ug /ml na 30 min fermentatie. ns = niet significant.
deel B
Er waren geen grote verschillen in concentraties tussen de LA verzameld op beginstalen en follow-up in zowel de test of de placebogroep (Tabel 3). Nogmaals, de met fructose als substraat geleverde monsters weergegeven beduidend hoger niveau van geproduceerde melkzuur dan die met xylitol toegevoegd. Het speeksel lactobacilli scores in de testgroep significant verhoogd (p & lt; 0,05) vanaf de uitgangswaarde follow-up, maar geen verschillen werden gezien in de placebogroep (Tabel 1). Op baseline, negen deelnemers aan de testgroep gepresenteerde niet-detecteerbare niveaus van lactobacillen versus zes in de placebogroep. Na twee weken, alle proefpersonen in de testgroep getoond detecteerbare tellingen terwijl vijf patiënten in de placebogroep had nog levels voorbij detectie. In Tabel 2 worden de speekselklieren mutans scores gepresenteerd. Geen statistisch significante effecten werden waargenomen tijdens de experimentele periode in een van de groepen. Geen bijwerkingen na het gebruik van de probiotische zuigtabletten waren reported.Table 3 Mean melkzuur concentratie (SD) ug /ml in suspensies van samengevoegde supragingivale plaque van de gezondheid van jonge volwassenen (n = 18)
Group
BL
FU
Fructose
Xylitol
Fructose
Xylitol
Test
8.6 (5.4)
2,9 (2,0)
8.7 (4.7)
1,5 (3,5)
Placebo
9.5 (4.2)
3.2 (3.5)
10,8 (5,2)
2,9 (3,4)
Metingen gemaakt bij aanvang (BL) en follow-up (FU) na de twee weken interventieperiode met L. reuteri
(test) of placebo. Zuurproductie werd gestart met ofwel fructose of xylitol.
Discussie
De toegenomen belangstelling voor het gebruik van probiotische lactobacilli om mondelinge gezondheid te verbeteren heeft geleid tot bezorgdheid over de mogelijke bijwerkingen verhoogd. Een bijwerking van een cariological oogpunt zou een verhoogde productie van organische zuren in de tandplaque zijn. Daarom wilden we onderzoeken of toevoeging van probiotische lactobacilli om tandplaque zijn acidogenicity zou beïnvloeden. In het laboratorium deel, vonden we duidelijke verschillen tussen de productie van melkzuur in suspensies van samengevoegde plaque en L. reuteri
DSM 17938 aan de ene kant en plaque plus L. plantarum
299v of pure controles op de andere. Dit was in overeenstemming met de in vitro
studie van Hedberg et al. [12], die vond L. plantarum
299v meest vatbaar voor zuur te produceren tussen zes verschillende commerciële stammen getest te zijn. Omgekeerd Haukioja en medewerkers [14] vonden dat zowel L. reuteri DSM
(voorheen ATCC 55.730) en L. plantarum 299v
verlaagde de pH significant na fermentatie van glucose en sucrose. Volgens Hedberg et al. [12] De fermentatie van sucrose en glucose door L. reuteri
PTA 5289 resulteerde in een verlaging van de pH (pH 5,2-6,8), terwijl de fermentatie van fructose een lichte stijging van de pH (pH & gt; 6,8) veroorzaakt. Dit, samen met onze huidige resultaten, geeft aan dat de gekozen voor vergisting suiker heeft een sterke invloed op de LA productie van L. reuteri
. Aldus uit het eerste deel van deze studie, lijkt het duidelijk dat de acidogenicity van suspensies van tandplak en probiotische bacteriën stam-afhankelijk en sterk beïnvloed door het type suiker beschikbaar. Bovendien was het opmerkelijk dat de resultaten van deel A waren geheel in lijn met de bevindingen van de vorige in vitro
studies [12, 14]. Dit geeft aan dat het laboratorium werkwijzen voor het screenen probiotische kandidaten voor orale ziekten bruikbaar te maken tussen gewenste en ongewenste eigenschappen gericht zijn. Zoals zuurproductie in suspensie in het laboratorium kan niet bootsen de exacte omstandigheden van de complexe biofilm in situ
, een stap verder kan zijn om de pH van de plaque in vivo
bestuderen door een micro-pH meter.
in de klinische deel van deze studie vonden we geen verschillen in zuurproductie voor en na de interventie met L. reuteri golfreizen of placebo wanneer de plaque monsters fructose werden fermenteren. Zo zou de nulhypothese niet verworpen. De resultaten waren in overeenstemming met Marttinen et al. [13], die niet aan de verschillen in de productie van melkzuur na de interventie met ofwel L. reuteri golfreizen of L. rhamnosus GG
demonstreren. Men zou kunnen stellen dat de verminderde acidogenity van de plaque monsters kan worden veroorzaakt door de antibacteriële werking van L. reuteri, maar als gevolg van de relatief korte periode van toediening zijn wij van mening dat dit niet het geval was. Omdat xylitol niet gedacht worden gefermenteerd door orale bacteriën [15] de lage concentraties van LA na toevoeging van xylitol werden verwacht. Er moet echter worden benadrukt dat de vrijwilligers in deze projecten had gezonde orale omstandigheden en waarschijnlijk niet volledig representatief voor patiënten met een ecologisch gestrest en onevenwichtig biofilm. In theorie, zou een dergelijke toestand kunnen verhogen de werkzaamheid van probiotische behandeling. Wij en andere onderzoeksgroepen hebben aangetoond dat lage pH-omstandigheden streptococcus mutans groeiremming door probiotische lactobacilli [16, 17] kunnen bevorderen en interfereren met de vorming biofilm [18]. Zo zou verder onderzoek bij bepaalde cariës-actieve patiënten interessant. De conclusie zo ver van de klinische deel was dat ondanks hun sterke acidogene vaardigheden, dagelijkse supplementen van probiotische lactobacilli leek niet aan de acidogenity van de tandplaque te verhogen wanneer ze worden blootgesteld aan fructose of xylitol.
Er waren geen verschillen in speeksel mutans streptococcen niveaus tussen de twee groepen en we geregistreerd geen wijzigingen na de interventie periode. Dit in tegenstelling tot een aantal eerdere studies [2-5], maar samen met anderen [9, 19, 20]. Verschillen in stammen en bacteriële concentraties dosis regimes en leeftijdsgroepen gebruikt in de eerdere trials belemmeren elke vergelijking tussen de proeven en daardoor harde conclusies. Algemeen wordt aangenomen dat probiotische supplementen effectiever Leeftijden dan bij volwassenen [21], die enigszins onze negatieve bevindingen kunnen verklaren zijn. De toename in lactobacilli tellingen in de testgroep was logisch en ondersteunden de resultaten van Marttinen en medewerkers [13] Hoewel we niet in staat om te analyseren of het gevolg van de specifieke stam getest. Het is echter onwaarschijnlijk dat een permanente verandering van de microbiële samenstelling optreedt [22, 23]. Caglar et al. [22] bestudeerden het aantal dragers van L. reuteri
ATCC 55.730 na 2 weken inname gedurende tabletten die die stam. Met behulp van selectieve media en analyses voor reuterine productie, werd de verwijderde bacteriën in alle proefpersonen onmiddellijk na de trainingsperiode maar werd geleidelijk afgeschaft binnen enkele weken. Het is echter nog steeds een open vraag of een kolonisatie van de orale biofilm per se
is een absolute vereiste voor probiotische actie.
Conclusie
De resultaten van deze studie suggereren dat de acidogenicity van de schorsing van tandplak en probiotische lactobacillen stam-afhankelijk en beïnvloed door het type van de suiker beschikbaar zijn. Bovendien is de huidige studie geeft geen aanwijzingen voor een toename van de plaque de zuurgraad door het aanbod van geselecteerde probiotische lactobacillen wanneer uitgedaagd door fructose of xylitol.
Verklaringen
Dankwoord
De auteurs willen graag bedanken Mads Møller, Jesper Olsen en Rasmus Ryhl voor het verzamelen van plaque samples en Ulla Larsen voor ervaren laboratorium hulp. De experimentele producten werden vriendelijk verschaft door BioGaia AB, Zweden.
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan de links naar de auteurs oorspronkelijke ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 Competing belangen
MKK een onderzoeksbeurs van Biogaia AB, Zweden hebben ontvangen voor klinische proeven op orale probiotica.
Authors' 12903_2011_237_MOESM1_ESM.jpeg auteurs bijdragen
MKK bijgedragen met het laboratorium werk, de acquisitie, analyse en interpretatie van de gegevens en het opstellen van het manuscript. ST bijgedragen met het ontwerp, de interpretatie van de gegevens en de herziening van het manuscript. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
