Abstracte achtergrond
Menselijke papillomavirussen (HPV) zijn oncogene en vooral geassocieerd met baarmoederhalskanker. Recent bewijs heeft aangetoond HPV-infectie in andere weefsels, waaronder orale epitheel en slijmvliezen. Hoewel een recente pilot-onderzoek leverde nieuwe informatie over orale HPV-status bij gezonde volwassenen uit Nevada, werd geen informatie verkregen over orale HPV prevalentie onder kinderen of tieners, daarom is het doel van deze studie is om meer gedetailleerde informatie over orale prevalentie van hoog- bieden risico HPV bij kinderen en tieners in Nevada
Methods Inloggen Deze retrospectieve studie benut eerder verzamelde speeksel monsters, verkregen uit pediatrische tandheelkundige kliniek patiënten (m 2 jaar - 11). en de plaatselijke school district tieners (12-17 jaar) voor hoge -Risico HPV-screening (n = 118) met behulp van qPCR voor het kwantificeren en bevestiging van de analytische sensitiviteit en specificiteit.
Results
Een klein deel van speekselmonsters werden gevonden met een hoog risico HPV16 haven (n = 2) en HPV18 ( n = 1), die een 2,5% van het totaal. Alle drie werden verkregen van teenage mannetjes en twee van deze drie monsters waren afkomstig van White deelnemers.
Conclusies
Hoewel dit retrospectieve studie niet correlaties met gedrags- of sociaal-economische gegevens kon verstrekken, dit project met succes gescreend meer dan honderd speekselmonsters voor hoog-risico HPV, dat zowel HPV16 en HPV18 stammen waren aanwezig in een klein deel. Met steeds meer bewijs van mondelinge HPV-infectie bij kinderen, deze studie geeft belangrijke informatie van grote waarde aan andere tandheelkundige, medische, mondelinge en volksgezondheid professionals die op zoek naar een goed begrip van de mondgezondheid en risico van de ziekte bij pediatrische populaties te bevorderen.
Trefwoorden
Human papillomavirus Speeksel Oral screening Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-12-43). bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is
achtergrond
de menselijke papillomavirussen (HPV) omvatten een nauw verwante familie van DNA-virussen die in staat zijn te integreren in het menselijk genoom tot transformatie van geïnfecteerde epitheel [1-4] afschrikken. Veel van het epidemiologisch bewijs voor HPV-driven carcinogenese, evenals de biologische mechanismen zijn ontleend aan studies van cervicale kanker [5-7] die hoog-risico HPV geïsoleerd uit zowel adeno- en plaveiselcelcarcinomen [6-9] . Hoewel de hoog-risico HPV drijft de transformatie en maligniteit proces van bijna alle baarmoederhalskanker wordt HPV-infectie nu bekend is epitheliale transformatie in borst-, long-, penis, anaal en ook orale weefsels [10-20] moduleren. Ondernemingen De primaire risicofactoren voor orale carcinogenese zijn tabak en alcoholgebruik, maar nieuwe lijnen van bewijs suggereren nu HPV kan ook een onafhankelijke risicofactor [17-23] zijn. De hogere prevalentie van hoog-risico HPV-stammen in de pre-kanker en kankercellen oropharyngeal tumoren suggereert dat HPV voorkeur kunnen infecteren ontwikkelen of bestaande vormen van kanker, waardoor carcinogene progressie moduleren en uiteindelijk het beïnvloeden van de gezondheidssituatie [24-26]. In feite, heeft enig bewijs suggereerde dat hoog-risico HPV-infectie kan worden geassocieerd met een verbeterde reactie op behandeling en hogere overlevingskansen [27-29], terwijl conflicterende rapporten significant aangetoond afgenomen overleving van patiënten [30-32] of geen waarneembare hebben waargenomen en statistisch significante effecten [33].
Ondanks de tegenstrijdige aard van deze resultaten is het duidelijk dat HPV betrokken kan zijn bij het moduleren tumor respons en carcinogene progressie, dus veel van deze studies hebben waardevolle epidemiologische informatie over welke risicovolle ontvangen HPV-stammen worden meestal betrokken bij deze gevallen [34-36]. Deze studies hebben aangetoond HPV16, HPV18 en in mindere mate, goed voor de overgrote meerderheid (71-94,7%) hoog risico HPV orale gedetecteerd [17, 18, 21-23, 34-36]. Bovendien nieuwe bewijs suggereert nu dat deze specifieke hoog-risico HPV stammen (HPV16 en HPV18), mondelinge carcinogenese kunnen instellen bij de kleinere fractie van mondelinge kankerpatiënten die geen alcohol consumeren of gebruik van tabak [37, 38].
Based van de bevindingen van orale HPV in niet-tabak en non-alcohol geassocieerde orale kankers, hebben andere recente pogingen meer specifiek gericht op orale HPV prevalentie en transmissie binnen gezonde populaties, wat ook bevestigd dat HPV16 en HPV18 waren de meest gedetecteerde orale high evalueren -Risico HPV stammen [39-41] bij gezonde volwassenen.
Daartoe een recente pilot-studie ter evaluatie van mondelinge HPV bij gezonde volwassenen werd uitgevoerd in Nevada [42], een toestand onlangs gedocumenteerd met de stijgende prijzen van orofaryngeale kankers, in schril contrast met de dalende prijzen waargenomen in de buurlanden en de Verenigde Staten meer in het algemeen [43, 44]. Deze studie toonde de aanwezigheid van hoog-risico-stam HPV16, maar niet HPV18, onder vrouwen en minderheden, de enige populatie subgroepen aangetoond dat de stijgende orpharyngeal van kanker hebben - ondanks de algemene dalende tarieven waargenomen binnen de algemene bevolking [45-47]. Deze studie gebruik gemaakt van een speeksel-based screening procedure, een deel van een groeiende trend naar minder invasieve methoden, zoals orale lavage- en speeksel gebaseerde screenings, tot orale HPV status onder gezonde volwassen patiënten [48-51] te analyseren.
Hoewel prevalentie varieerde sterk, hebben deze studies gesuggereerd dat mondelinge HPV-infectie kan zijn toegenomen, niet alleen bij volwassenen, maar meer in het bijzonder bij jongere volwassenen, tieners en kinderen [52-54] .Om Daartoe hebben sommige studies orale HPV in onderzoek kinderen en adolescenten, maar veel van deze voornamelijk gericht op kinderen met onderliggende medische aandoeningen, zoals co-infectie met humaan immunodeficiëntievirus (HIV) [55-57]. De meeste andere onderzoek heeft echter meer specifiek gericht op het ophelderen van de rol van verticale transmissie HPV bij pasgeborenen, het aantonen van de mogelijkheid om hoog-risico HPV verwerven tijdens de bevalling en het geboorteproces, hoewel deze infecties meestal op te lossen [58-63].
echter nieuw bewijs in opkomst dat aangetoond hoog risico mondelinge HPV-infectie in normale, gezonde kinderen, met de hoogste percentages waargenomen bij kinderen jonger dan 7 jaar (7,9% -8,7%), en de dalende prijzen waargenomen bij gezonde jongeren (13- 20 jaar oud; 5,1% -5,2%) en gezonde volwassenen (3,5%) [64, 65]. Deze waarnemingen kan erop wijzen dat mondelinge HPV-infectie kan voorkomen door nauw persoonlijk contact met familieleden of door contact met fomites en andere vectoren in de kinderopvang, kleuterschool of in het primair onderwijs instellingen, met de meeste kinderen immunologisch bevoegd is om deze infecties [66] op te lossen. Echter, sommige infecties blijven bestaan en hun bijdrage aan de ontwikkeling van orale kanker en andere aandoeningen, blijft onduidelijk
Hoewel een pilot-onderzoek dat onlangs werd uitgevoerd om mondelinge HPV-status te evalueren, dit betrof slechts gezonde volwassen patiënten -. Zonder informatie verkregen over orale HPV prevalentie onder kinderen of tieners. Op basis van de vorige bewijzen waaruit blijkt een zekere mate van mondelinge HPV-infectie bij gezonde kinderen en adolescenten, in combinatie met het ontbreken van gegevens over deze populatie meer in het bijzonder, het doel van de huidige studie is om meer gedetailleerde informatie over de prevalentie van hoog-risico HPV-stammen bieden HPV16 en HPV18 in de mondholte van kinderen en tieners in Nevada.
Resultaten
het aandeel van vrouwelijke en mannelijke exemplaren uit de studie steekproef was niet statistisch significant verschillend van de algemene verhoudingen binnen de lokale gemeenschap van Clark County, Nevada ( Tafel 1). Meer specifiek, het percentage vrouwen en mannen in het monster was ongeveer gelijk (51,7% en 48,3%, respectievelijk), die niet significant verschillend van de lokale bevolking (p = 0,7051
) was. Het percentage minderheid (niet-wit) monsters was veel groter in de steekproef (70,3%) dan in de lokale bevolking (39,1%), die statistisch significant (p
& lt; 0,0001) was. Hoewel de gegevens van de lokale bevolking waren niet beschikbaar voor de leeftijd-specifieke vergelijkingen, werd de studie steekproef meer bestaat uit jongere kinderen (leeftijd 2-11: 59,3%) dan bij adolescenten en tieners (12-17: 40,7%) Tabel 1 Demografische analyse. van de deelnemers aan de studie
CCSD (n = 48)
UNLV-SDM (n = 70)
Totale steekproef (n = 118)
Clark County bevolking
Statistische analyse
Geslacht
Female
n = 30 (62,5%)
n = 31 (44,3%)
n = 61 (51,7%)
n = 969.781 (49,7%)
χ2 = 0,17849 df = 1
Man
n = 18 (37,5%)
n = 39 (55,7%)
n = 57 (48,3% )
n = 981.488 (50,3%)
p = 0,7051
Race
Wit
n = 12 (25%)
n = 23 (32,9%)
n = 35 (29,7%)
n = 1.188.323 (60,9% )
χ2 = 28,3634 df = 1
Non-White
n = 36 (75%)
n = 47 (67,1%)
n = 83 ( 70,3%)
n = 762.946 (39,1%)
p
& lt; 0,0001
Age
2-11
n = 0 (0%)
n = 70 (100 %)
n = 70 (59,3%)
N /A
12-17
n = 48 (100 %)
n = 0 (0%)
n = 48 (40,7%)
N /A
Gedetailleerde analyse van speekselmonsters onthulde enige variatie tussen cellen telt, DNA-concentratie en DNA zuiverheid tussen monsters (Figuur 1). Celtellingen varieerde tussen een 0,8-2,3 x 10
6 cell /ml, die verder werden onderverdeeld in lage (0,8-1,4 x 10 6) en hoge (1,6-2,3 x 10 6) celtellingen . DNA werd succesvol geïsoleerd uit alle speekselmonsters, de gemiddelde DNA-concentratie voor monsters waargenomen bij 842,7 ng /ul. Monsters van elk cohort (CCSD, UNLV) met een mobiele tellingen in de lage categorie bleken gemiddeld lagere concentraties van DNA dan monsters van dezelfde cohort met celtellingen in de hoge categorie hebben. Absorptiemetingen en A260 /A280 verhouding analyse bevestigde de zuiverheid van DNA isolaten, die ongeveer gelijk tussen cohorten, en tussen monsters in de lage en hoge cellen categories was. Figuur 1 speekselmonster analyse: celgetal, DNA isolatie en zuiverheid. A) Na centrifugeren en cel resuspensie in een zoutoplossing, mobiele nummer voor elke werd bepaald die drie vierden van de UNLV monsters steekproef werden waargenomen lagere cel tellingen hebben (0,8-1,4 x 106 cellen /ml), terwijl slechts een derde van de CCSD monster werden geschat * lagere celtellingen hebben. B) DNA-concentraties bleken hoger uit de high-celgetal monsters (CCSD zijn binnen elk cohort: 859,4 en 707,1 ng /ul, respectievelijk UNLV: 886,3 en 910,2 ng /ul, respectievelijk). DNA zuiverheid gemiddeld tussen 1,71 en 1,82. C) Gelijke concentraties van geëxtraheerde DNA (1 ui) werd gescreend onder gebruikmaking van GAPDH, waarbij geen aanzienlijke variatie in bandintensiteit tussen cohorten van monsters van hoge en lage celtelling categorieën geopenbaard.
Monsters van geëxtraheerde DNA werden vervolgens gescreend op de aanwezigheid van HPV16 en HPV18 met PCR (Figuur 2). Deze screening leverde drie HPV-positieve monsters (n = 3/118), die 2,5% van de totale gescreende. Twee van deze monsters (S5, S38) koesterde HPV16 DNA en één werd gevonden naar de haven HPV18 DNA (S7). Verwerking van DNA-monsters met behulp van qPCR ontvangen kwantitatieve beoordelingen, en metingen van gevoeligheid en specificiteit. Analyse van het aantal kopieën per genoom voor de huishoud-gen (β-actine) voor de HPV-positieve (bereik: 25 - 40 kopieën /genoom) en HPV-negatieve monsters (4-93 kopieën /genoom) onthulde waarden die ruim boven het waren cutoff waarde (& gt; 0,1 kopieën /genoom). De resultaten van qPCR analyse bleek kopie-aantallen van HPV-positieve monsters (bereik: 150-880 kopieën /genoom), die aanzienlijk hoger waren dan HPV-negatieve monsters (bereik: 0,00148-0,0000016 kopieën /genoom), die kunnen worden onderscheiden met behulp van de cutoff waarde (& gt; 0.001 kopieën /genoom). Deze analyse toonde geen valse positieven of valse negatieven, waaruit voldoende gevoeligheid en specificiteit het percentage echte HPV-positieve monsters (3/118 of 2,5%, 3/3 of 100%) kennen en waar HPV-negatieve monsters (115/118 of 97,5%, 115/115 of 100%). Figuur 2 speekselmonster screening: de analyse van qPCR HPV resultaten. A) drie monsters bleken HPV DNA haven: HPV16-positieve monsters (S5, S38); Eén monster was HPV-positief (S7). B) qPCR analyse bleek HPV-positieve monsters hadden waarden ruim boven de vastgestelde grenswaarde (& gt; 0.001 kopieën /genoom). C) De drie HPV-positieve monsters werden mannelijke, ofwel 2,5% van de totale (n = 118). Twee van de drie HPV-positieve monsters waren afkomstig van White deelnemers. Alle drie de HPV-positieve monsters waren afkomstig uit de CCSD cohort (leeftijd: 12-17); Beide HPV16-positieve monsters werden verkregen uit 14-jarige deelnemers, terwijl de HPV18-positief monster werd verkregen van een 15-jarige.
Hoewel de relatief klein deel van de HPV-positieve monsters niet zorgen voor meer brede gevolgtrekkingen, een beschrijvende analyse van de demografische informatie over deze monsters bleek dat alle drie zijn afgeleid van mannen (n = 3/57 of 5,3%) en er werden afkomstig zijn van koeien. De twee HPV16-positieve monsters werden verzameld van White deelnemers 14 (n = 2/35 of 5,7%) jaar, terwijl de HPV18-positief monster werd verzameld uit een niet-White deelnemer leeftijd 15 (n = 1/83 of 1,2%) . Alle drie HPV-positieve monsters werden uit de CCSD (tiener) cohort (n = 3/48 of 6,25%), terwijl geen waargenomen in de UNLV-SDM (pediatrische) cohort (n = 70).
Discussie
het belangrijkste doel van deze studie was om normale gezonde kinderen en tieners te screenen in Nevada op de aanwezigheid van hoog-risico mondelinge HPV. Deze retrospectieve analyse gebruikt bestaande speekselmonsters verzameld van pediatrische tandheelkundige patiënten en plaatselijke school district tieners, om nieuwe gegevens uit deze voorheen ongeteste jeugdige bevolking waardoor de steeds groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal met betrekking tot orale HPV-prevalentie bij kinderen als aanvulling te verkrijgen. Belangrijker nog, hebben deze gegevens een mondelinge prevalentie van hoog-risico HPV vlekken van ongeveer 2,5% voorgesteld.
Recente studies van gezonde volwassenen hebben gelijkaardige prevalentiecijfers gevonden, variërend tussen de 3,1 en 5% [40, 41]. In feite is de recente pilot-studie van gezonde volwassenen in Nevada gemeld orale HPV in 2,6% van de 151 vrij van kanker patiënten [42]. De resultaten van deze studie waren gewijzigd, maar omdat twee van de drie HPV-positieve monsters van blanken werden verkregen en waren van mannen - dat voorafgaande studie van volwassen gevonden orale HPV bij vrouwen en alleen minderheid. Ander bewijs heeft gesuggereerd dat, hoewel monsters van vrouwen en mannen had soortgelijke tarieven van mondelinge HPV (56 en 44%, respectievelijk), de HPV-negatieve monsters uit deze studie waren overweldigend vrouwen (82%) - verstrekken van een aantal aanwijzingen voor een mogelijke mannelijke, genderspecifieke fenomeen vergelijkbaar met de huidige studie resultaten [67]. Hoewel er veel mogelijke verklaringen, zoals de voorbijgaande aard van de lokale bevolking, kunnen vele andere factoren, zoals stress, voeding, inkomen, armoede, sociaal-economische status, en orale blootstelling HPV invloed op verschillende raciale groepen en beide seksen op vergelijkbare wijze.
Deze studie vormt een belangrijk keerpunt in de volksgezondheid inspanningen om mondelinge HPV-detectie toe te lichten in een geografisch gebied dat bekend staat voor het hoger dan gemiddeld (en voorheen het verhogen van) de tarieven van orofaryngeale kanker [43, 44]. Echter, deze studie had een aantal beperkingen die moeten worden erkend. Ten eerste, de terugwerkende kracht van deze studie beperkte de gevolgtrekkingen die kunnen worden gemaakt, in tegenstelling tot andere recente prospectieve studies van orale HPV bij kinderen en adolescenten [64-68]. Bovendien zijn er geen gedetailleerde gedrags- of sociaal-economische gegevens beschikbaar waren, zoals het inkomen van de ouders of roken gedrag, vanwege de aard van deze retrospectieve pilot-studie. Het is te hopen dat toekomstige onderzoeken met betrekking tot orale HPV aanvullende inzichten met meer gedetailleerde behavioral informatie, alsmede gegevens met betrekking tot huisvesting, onderwijs, inkomen en andere sociaal-economische indicatoren [67-71] zal bieden.
Conclusies
dit project met succes gescreend speekselmonsters voor hoog-risico HPV, dat zowel HPV16 en HPV18 stammen waren aanwezig in een klein deel. Hoewel eerdere werk heeft zich toegespitst op de mondelinge HPV-overdracht van moeder op pasgeborene tijdens de geboorte en terwijl verpleging [58-63, 68], is er steeds meer aanwijzingen dat na de perinatale periode, mondelinge HPV transmissie door nauw persoonlijk contact, zoals gedeelde eten gebruiksvoorwerpen, speelgoed, zoenen en baden kan verantwoordelijk zijn voor mondelinge HPV transmissie (voornamelijk HPV16) bij kinderen en adolescenten [72-75]. Deze studie, daarom biedt kritische informatie van grote waarde aan andere tandheelkundige, medische, mondelinge en volksgezondheid professionals die op zoek naar een goed begrip van hoog-risico HPV prevalentie onder kinderen bevorderen, als onderdeel van een breder begrip van mondgezondheid en risico van de ziekte bij kinderen . populatie
Methods
steekproefomvang
Gezien de bekende prevalentie van hoog-risico HPV mondelinge in het vorige onderzoek dat gezonde volwassenen in deze geografische gebied afgeschermd, werd de juiste steekproefgrootte berekend aan de hand van de volgende formule: n = Z
2
P
(1 - P
) /d
2, waarbij n = steekproefgrootte, Z
= Z
statistiek voor een niveau van vertrouwen, P
= verwachte prevalentie, en d
= precisie [76, 77]. Met behulp van het 95% niveau van vertrouwen, werd het Z
waarde bepaald op 1,96; Met behulp van de vorige aandeel /prevalentie van hoog-risico HPV van 2,6%, werd de P
waarde in te stellen als P
= 0,026; De waarde voor d
moet worden berekend op basis van 0,5 (P
), wat resulteert in een waarde voor d
= 0,013. Met behulp van deze ingangen, werd de minimale steekproefomvang voor deze studie berekend dat n = 75.
menselijke proefpersonen zijn
Het protocol voor dit onderzoek getiteld "retrospectieve evaluatie Microbiële Aanwezigheid in Bestaande Speeksel Repository: Een PCR-gebaseerde moleculaire Survey van Oral microbiële populaties van bestaande speeksel samples "werd ingediend, gewijzigd en goedgekeurd door de UNLV Office of Research Integrity - Mensgebonden (OPRS # 1104-3801M) op 10 mei, werden 2011. de bestaande speekselmonsters verzameld tijdens de twee eerdere studies binnen de UNLV School of Dental Medicine (SDM) tijdens 2009-2010. Speekselmonsters verzameld uit een eerdere studie van tieners (14-15 jaar) waren afkomstig van een gemak steekproef van geselecteerde scholen binnen het Clark County, Nevada School District (CCSD; n = 48); oorspronkelijk verkregen ten behoeve van landmeetkundige niveaus van orale cariogene bacteriën. Speekselmonsters verzameld van jonge kinderen (2-11 jaar oud) werden verkregen uit een gemak monster in de UNLV-SDM pediatrische tandheelkundige kliniek (n = 70); oorspronkelijk verkregen ten behoeve van screening voor zware metalen (lood of Pb) belasting. Kortom, voor de originele speeksel monstercollecties bij CCSD en UNLV-SDM, ouders en onderwerpen werden ter plaatse aangeworven. Inclusie criteria: Informed Consent /Parent Toestemming nodig was en uitgevoerd ter plaatse, evenals een Assent te participeren in het onderzoek voor alle kinderen in de leeftijd van zeven, die in staat zijn te lezen waren. Uitsluitingscriteria: proefpersonen jonger dan zeven jaar, onderwerpen die weigerde om deel te nemen, en onderwerpen met de ouders die weigerde om deel te nemen. Elk monster werd een unieke, willekeurig gegenereerd nummer dat aan onderzoek vertekening te voorkomen, met als enige demografische informatie betreffende de speekselmonsters: geslacht, leeftijd en afkomst van de oorspronkelijke studie deelnemer. Het huidige project is een retrospectieve analyse van deze twee verzamelingen van speekselmonsters; de totale gecombineerde omvang steekproef voor dit onderzoek was n = 118.
Speeksel collectie protocol
Kortom, onderwerpen die ingestemd met deelname waren een kleine, steriele speeksel collectie container, 50 ml steriel polypropyleen buis (Fisher Scientific gegeven: Fair Lawn, New Jersey, USA). De deelnemers werd vervolgens gevraagd om op te kauwen een stukje paraffinewas gedurende één minuut en vervolgens spuwen, overeenkomstig de voorgaande proefstudie protocol [42]; monstervolumes gevarieerd van ongeveer 50 pl tot 2,5 ul. De monsters werden opgeslagen op ijs tot transport naar een biomedisch laboratorium voor analyse. Elk speeksel monster werd een unieke, willekeurig gegenereerde nummer onderzoek vooringenomenheid te voorkomen toegewezen. Demografische informatie over het monster werd gelijktijdig verzameld, die bestond uit leeftijd, geslacht en etniciteit alleen.
Celtelling en DNA isolatie Leer Alle monsters werden gedurende 10 minuten bij 2100 g (RCF) en het celpellet werd gewassen met 1X fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (HyClone: Logan, Utah, USA) en geresuspendeerd in 5 ml 1X PBS. Het aantal cellen werd bepaald met behulp van trypan Blue (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, USA) met behulp van een Zeiss Axiovert 40 omgekeerde microscoop (Carl Ziess, Inc: Thornwood, New York, USA) en een hemacytometer (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, USA). Te bepalen of er monsters geherbergd het HPV-virus, werd DNA geïsoleerd uit het speeksel monster met minimaal 3,5 x 10 5 cellen met de GenomicPrep DNA isolatie kit (Amersham Biosciences: Buckinghamshire, Verenigd Koninkrijk) met de procedure aanbevolen de fabrikant zoals eerder beschreven [12, 42, 78, 79]. DNA zuiverheid werd berekend op basis van metingen verhouding van de absorptie bij 260 en 280 nm (A260 /A280-verhouding tussen 1,7 en 2,0).
Polymerase kettingreactie (PCR)
DNA van elk monster werd daarna gebruikt om PCR uit te voeren met de Fisher exACTGene volledige PCR kit (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, USA) en een Mastercycler gradiënt thermocycler (Eppendorf: Hamburg, Duitsland) met de volgende primers voor HPV16 [12, 78], HPV18 [12, 78, 79], en glyceraldehyde- 3- fosfaat dehydrogenase (GAPDH) [80] (SeqWright: Houston, Texas, USA):.
HPV16 forward primer, ATGTTTCAGGACCCACAGGA;
HPV16 reverse primer, CCTCACGTCGCAGTAACTGT
HPV18 forward primer, ATGGCGCGCTTTGAGGATCC;
HPV18 omgekeerde primer, GCATGCGGTATACTGTCTCT;
GAPDH voorwaartse primer, ATCTTCCAGGAGCGAGATCC;
GAPDH achterwaartse primer, ACCACTGACACGTTGGCAGT;
Eén ug matrijs-DNA werd gebruikt voor elke reactie. De initiële denaturatiestap liep gedurende drie minuten bij 94 ° C. Een totaal van 30 amplificatiecycli werden uitgevoerd, bestaande uit 30 seconden denaturatie bij 94 ° C, 60 seconden annealen bij 58 ° C en 30 seconden verlenging bij 72 ° C. Laatste verlenging werd gedurende vijf minuten bij 72 ° C. De PCR-reactieproducten werden gescheiden door gelelektroforese behulp Reliant 4% NuSieve® 3: 1 Plus Agarose gels (Lonza: Rockland, Maine, USA). Banden werden zichtbaar gemaakt door UV-belichting van ethidium-bromide gekleurde gelen en opgenomen met een Kodak Gel Logic 100 Imaging System en 1D beeldanalyse software (Eastman Kodak: Rochester, New York, USA)
kwantitatieve PCR (qPCR) DNA monsters werden vervolgens verwerkt met qPCR meer specifieke en gevoelige kwantificatie leveren. Primers en probes werden ontworpen met behulp van Roche Universal Probe library (UPL) testontwerp software om de regio overlappende E6 en E7 gensequentie van HPV16 (GenBank no. K02718) en het humane β-actine huishoud-gen (GenBank toegangsnr. M10277) amplificeren . Deze primers werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) en probes van Roche Applied Science (Indianapolis, Indiana, USA).
HPV16 E6 /E7 forward primer 5'-CAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAA-3 ', HPV16 E6 /E7 reverse primer 5'-CCAGCTGGACCATCTATTTCA-3 ', HPV16 E6 /E7 hydrolyse "Taqman" probe 5' - (fam) -AGGAGGAG- (donker quencher kleurstof) -3 '(UPL probe # 63) werd gebruikt om het 73 amplificeren basenparen (bp) gebied tussen de positie 535 nucelotide (nt) en 607 nt positie. HPV18 E7 voorwaartse primer 5'-GACTCAGAGGAAGGAAAACGATGAAA, HPV18 E7 reverse primer 5'-GTGACGTTGTGGTTCGGCT; HPV18 E7 probe 5'-TGGAGTTAATCATCAACATTTACCA werd gebruikt om de 25 bp te amplificeren tussen 715 en 739 nt positie. Humane β-actine forward primer 5'-GTGGGGTCCTGTGGTGTG-3 ', humaan β-actine 5'-GAAGGGGACAGGCAGTGA-3', humaan β-actine hydrolyse "Taqman" probe 5 '- (fam) -GGGAGCTG- (donker quencher kleurstof) - 3 '(UPL probe # 24) versterkt de 61 bp tussen 2642 en 2702 nt positie nt positie. Ondernemingen de real-time reactiemengsel werd bereid in een LightCycler® 480 multiwell plaat 96 uit 1x LightCycler® 480 Probes Master (Roche Applied Sciences: Indianapolis, Indiana, USA), 1 uM van elke respectievelijke primer set (vooruit en achteruit), 0,2 uM van de respectieve sonde, en 2 pl DNA-template; in een 20 pl uiteindelijk reactievolume. De sondes master mix bevatte reactie buffer, dNTP mix (met inbegrip van dUTP in plaats van dTTP), 3,2 mm MgCl 2, en Taq
DNA polymerase. De real-time PCR werd uitgevoerd op een LightCycler 480 systeem (Roche Applied Sciences: Indianapolis, Indiana, USA) met de volgende cyclusparameters: pre-incubatie gedurende initiële enzymactivering op 95 ° C gedurende 10 minuten, gevolgd door 45 cycli van 95 ° C gedurende 10 seconden (helling snelheid 4,4 ° C /seconde), 60 ° C gedurende 30 seconden (helling snelheid 2,2 ° C /seconde) en 72 ° C gedurende 1 seconde (helling snelheid 4,4 ° C /seconde). Na amplificatie fase wordt een koelstap uitgevoerd bij 40 ° C gedurende 30 seconden (helling van 2,2 ° C /seconde). Overname van het fluorescentiesignaal werd uitgevoerd middels Mono hydrolyseprobe instelling (465-510 nm) na de 72 ° C verlenging van elke cyclus. Alle monsters werden in drievoud uitgevoerd Ondernemingen De CaSki (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA). Cervicaal adenocarcinoom cellijn werd gebruikt om standaardcurves voor zowel het HPV16 ontwikkelen (600 exemplaren /genoom) en GAPDH (2 exemplaren /genoom) genen. De GH354 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) cervicaal adenocarcinoom cellijn werd gebruikt om de standaard curves voor HPV18 (200 exemplaren /genoom) te ontwikkelen. DNA geëxtraheerd uit CaSki en GH354 cellen werden serieel verdund tienvoudige te beginnen bij 50 ng tot 0,0005 ng [81] Kwantificering werd bereikt met behulp van Cycle Drempel (C T) gemeten met de tweede afgeleide maximum methode (LightCycler 480 Software versie 1.5.0.39; Roche Applied Sciences: Indianapolis, Indiana, USA). Speekselmonsters & gt; 0.001 copy /genoom werden beschouwd HPV-positief. Specificiteit werd uitgevoerd op qPCR assay tegen HPV18 en bleek 100% specifiek (gegevens niet getoond)
Statistische evaluatie
Sensitiviteit en specificiteit werden berekend als de verhouding van ware positieven en ware negatieven (afkapwaarde & GT;. 0,001 kopieën /genoom), respectievelijk. Na de overname van speekselmonsters en HPV screening resultaten werden demografische informatie van de monsters ten opzichte van de totale demografisch profiel van de bevolking met een chi-kwadraat (χ2) test om te bepalen of alle kenmerken (geslacht, ras, leeftijd) werd anders dan verwacht bij de proefpersonen in dit onderzoek geëvalueerde (n = 118). Een kans niveau van alfa (α) = 0,05 werd gebruikt om statistische significantie te bepalen
Afkortingen
HPV.
Human papillomavirus
DNA:
Desoxyribonucleïnezuur
US: Hotels Verenigde Staten
PCR:
Polymerase kettingreactie
OPRS:
Bureau voor de bescherming van de menselijke proefpersonen
CCSD:
Clark County Nevada - School District
< DFN> UNLV-SDM:
Universiteit van Nevada in Las Vegas - School of Dental Medicine
RCF:
Relatieve centrifugale kracht
PBS:
fosfaat-gebufferde zoutoplossing
GAPDH:
Glyceraldehyde-3- fosfaatdehydrogenase
qPCR:
kwantitatieve polymerase chain reaction
bp:
Basepaar
nt:
Nucleotide
dNTP:
deoxyribonucleotidetrifosfaat
dUTP: verhuur 2-deoxyuridine trifosfaat
dTTP:
deoxythymidine trifosfaat .
verklaringen
Dankwoord
de auteurs willen graag de UNLV School of Community Health Sciences en UNLV-SDM Departement Biomedische Wetenschappen, Bureau voor Onderzoek en Advanced Education Program in Pediatric tandheelkunde voor het verstrekken van de leveringen en reagentia voor deze eerste pilot-studie.
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan de links naar de auteurs oorspronkelijke ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12903_2012_246_MOESM2_ESM.pdf Authors' 12903_2012_246_MOESM1_ESM.pdf Auteurs originele bestand voor figuur 2 Concurrerende belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen. Bijdragen
Authors '
KK en CF bedacht, bewaakt, en coördineerde de experimentele opzet. KH, EE, JA en AH waren verantwoordelijk voor het werven van patiënten, informed consent, het verzamelen van monsters, en een aantal biomedische analyse. CF, EE, JA, en AH voerde de DNA extracties, PCR en qPCR analyse. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
