Abstracte achtergrond
Gingival epitheelcellen zijn de belangrijkste bevolking van het tandvlees, handelend als de front-line verdediging tegen micro-inbraak en het reguleren van de homeostase van het parodontale weefsel in gezondheid en ziekte via NLR familie pyrin domein-bevattende-3 (NLRP3) inflammasoom, die pathogeen en gevaar in verband moleculaire patronen (PAMPs en gedempt) erkent . Het doel van deze studie was te bepalen of de activering van NLRP3 inflammasoom afhankelijk van infectie met het pathogeen parodontale Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
) of stimulatie met P. gingivalis
lipopolysaccharide (LPS) en /of extracellulaire adenosine trifosfaat (ATP).
Methods
Een orale epitheliale cellijn werd behandeld met P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS en ATP. Het gen en eiwit expressie van NLRP3 inflammasoom componenten werden gekwantificeerd door real-time RT-PCR en immunoblots. Productie van IL-1β en IL-18 werd gemeten met ELISA.
Resultaten
Er was geen toename NLRP3 inflammasoom genexpressie naar P. gingivalis infectie
tenzij vooraf gestimuleerd door ATP. Duidelijke toename van NLRP3 inflammasoom genexpressie waargenomen na P. gingivalis
LPS stimulatie, zelfs pre-gestimuleerd door ATP in 2 uur.
Conclusies
De resultaten geven aan dat de activatie van NLRP3 inflammasoom niet afhankelijk P .
gingivalis infectie, tenzij gestimuleerd door P. gingivalis
LPS en /of extracellulair ATP, wat suggereert verschillende signaalroutes zijn betrokken bij de immuunrespons van de gastheer.
Sleutelwoorden
extracellulaire adenosine trifosfaat (ATP) NLRP3 inflammasoom Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
) P. gingivalis
LPS Achtergrond
chronische periodontitis, een van de meest voorkomende en voorkomende ziekten bij mensen wereldwijd [1], wordt gedefinieerd als een chronische infectie driven ontstekingsziekte van het parodontium resulteert in de vernietiging van gingivale weefsel absorptie van alveolaire bot en uiteindelijk verlies van tanden [2]. Wanneer infectie optreedt, zal het aangeboren immuunsysteem de eerste verdedigingslinie tegen pathogenen en activeert het adaptieve immuunsysteem voor een duurzame bescherming tegen deze invallen [3]. Ondernemingen De intracellulaire multi-eiwitcomplexen, bekend als "NLR inflammasomen" spelen een centrale rol in de aangeboren immuniteit. Onder inflammasomen de pyrin domein-bevattende-3 (NLRP3) inflammasoom is de meest bestudeerde [4]. Gingival epitheliale cellen brengen een functioneel NLRP3 inflammasoom die kan worden geactiveerd door pathogeen of-gevaar in verband moleculaire patronen (PAMPs of gedempt) [4]. NLRP3 is gemonteerd met de adapter eiwit ASC (apoptose-geassocieerde speck-achtig proteïne) in een multi-eiwitcomplex dat caspase-1 activering en daaropvolgende rijping van de pro-inflammatoire cytokinen interleukine (IL) -1β en /of IL-18 regelt in de gastheer respons op parodontale infectie [4]. Gingivale epitheelcellen kunnen detecteren en PAMPs of DAMPs [5] nemen via stimulatie van receptoren (PRRS) pathogeen erkenning [1, 3], gevolgd door afgifte van pro-inflammatoire cytokines IL-1β en IL-18 [6]. De fundamentele werk van Bostanci et al. [7] Eerst aangegeven NLR inflammasomen zijn betrokken bij parodontitis, die antwoorden op P. gingivalis infectie
zowel klinisch als in vitro studies
.
Interleukine-1β (IL-1β), een pro-inflammatoire cytokine behoren de IL-1 familie is kritisch in de afweer tegen microbiële infecties [5] en regelt aangeboren immuun- en ontstekingsreacties. IL-18 is een proinflammatoire cytokine die behoren tot de IL-1 familie [6] en is onlangs beschreven als een belangrijk element in het systeem dat inflammasoom caspase-1 activeert en leidt tot de activering van het ontstekingsproces. Recent bewijs heeft aangetoond dat de maturatie en secretie van IL-1β en IL-18 wordt gereguleerd door de NLRP3 inflammasoom complex dat de NLRP3 scaffold bevat, caspase-1 en apoptotische vlek eiwit dat een C-eindstandig caspase recruitment domein (ASC) [8 ]. Overmaat IL-1β en IL-18 bijdraagt tot een toenemend aantal menselijke ontstekingsreacties [9]. Hoewel IL-1β en IL-18 tot dezelfde cytokinefamilie, hun genexpressie en secretie differentieel gereguleerd in menselijke monocytische cellen in reactie op P. gingivalis
[10]. Daarom kan cytokines van de IL-1 familie deelnemen via
verschillende trajecten in de complexe pathogenese van parodontitis [10].
P. gingivalis
, een gram-negatieve anaërobe bacterie [11], is bevestigd een overheersende periodontale pathogenen [12] en produceert een aantal potentiële virulentiefactoren voor de gastheer afweersysteem [13] verstoren en induceert een ontstekingsreactie in parodontale ziekten [14]. Het effect van P. gingivalis
van activering van de NLRP3 inflammasoom blijft controversieel. Lipopolysaccharide (LPS), als de belangrijkste celwand component van P. gingivalis
[15], wordt beschouwd als een belangrijke virulentiefactor opwekken van de ontstekingsreactie in de periodontale ziekte [16]. Het lijkt unaniem zijn overeengekomen dat LPS behandeling van mononucleaire fagocyten, [17] macrofagen [18] en mondelinge epitheelcellen [19] aanzienlijk induceert de expressie van NLRP3 en procaspase-1 op zowel het mRNA en eiwit niveaus. Studies hebben aangetoond dat functionele polymorfisme in LPS-receptoren beïnvloedt het ontstekingsproces en de klinische gevolgen van parodontitis [20]. De hierboven beschreven bevindingen suggereren dat hele P. gingivalis Kopen en P. gingivalis
LPS kunnen verschillende effecten op de activatie van NLRP3 inflammasoom systeem.
Extracellulaire ATP (adenosine trifosfaat), een van de eerste activatoren beschreven induceren NLRP3 inflammasoom vorming wordt toegeschreven aan de groep van endogene DAMPs vrijgegeven door stervende of beschadigde cellen [21, 22]. Haar aanwezigheid is te verwaarlozen in gezonde weefsels, maar kan oplopen tot hoge micromolaire niveaus volgende weefselschade op plaatsen van ontsteking [23]. Studies hebben aangetoond ATP geïnduceerde caspase-1 activering en daaropvolgende IL-1β afgifte [24, 25]. Bovendien Özlem et al. aangetoond dat IL-1β niet werd afgescheiden tenzij LPS-behandelde en geïnfecteerde gingivale epitheelcellen (GSC) werden vervolgens gestimuleerd met ATP en ATP had geen bijkomend effect op NLRP3 of ASC expressie in P. gingivalis
geïnfecteerd GSC [26] . Deze resultaten wijzen op de noodzaak om de rol van ATP in NLRP3 inflammasoom activering verder te evalueren.
Derhalve de activering van de NLRP3 inflammasoom complex in een gekweekte orale epitheelcellen model van P. gingivalis infectie
of P. gingivalis
LPS of ATP stimulatie werd getest. Dit verschaft een beter begrip van het mechanisme achter parodontitis.
Methods
Oral epitheelcelkweek
epitheliale cellijn (H413) afgeleid van een humane orale plaveiselcelcarcinoom [27], wordt gelaagd epitheelcel morfologie cultuur. H413 gekloneerde cellijnen werden bepaald met een maximum verdunningsmethode zoals eerder [28] beschreven. De gekloneerde cellen werden gekweekt in Eagle's Minimum Essential Medium (JMEM, Joklik modificatie, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), penicilline /streptomycine (100 IE /ml, Sigma) en 10% foetaal kalfsserum (FCS, CSL Limited , Victoria, Australië) bij 37 ° C in 5% CO
2 [29]. Culturen werden geoogst met drievoudige express (vervanger voor trypsine, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) in PBS en sub-gekweekt om de 3 dagen.
Bacteriële celkweek
Porphyromonas gingivalis
(ATCC 33277) werd anaëroob gekweekt gedurende 24 uur bij 37 ° C in een trypticasesoja bouillon aangevuld met haemine (5 mg /ml, Sigma) en menadion (1 mg /ml, Sigma). Op de dag van celtherapie, werden bacteriën gecentrifugeerd bij 5000 opm en 4 ° C gedurende 15 minuten, tweemaal gewassen en opnieuw gesuspendeerd in koude PBS, pH 7,3.
Celbehandeling
H413 Confluente celkweken (5 × 10 6 cellen in T-25 cm 2 flessen) werden driemaal gewassen met PBS en geïnfecteerd met P. gingivalis
bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 100 bacteriële cellen per één epitheelcel [30 ] gedurende 2 en 4 uur [31, 32], of gestimuleerd met 1-gg /ml ultrazuiver lipopolysaccharide (LPS) van P. gingivalis
(Invivogen, San Diego, CA, USA) in de celgroei media 2 en 4 h. Geïnfecteerde en niet-gestimuleerde cellen dienden als controles.
Experimenten werden ook uitgevoerd na pre-incubatie van de cellen met 5 mM adenosine trifosfaat (ATP) (Invivogen) gedurende 3 uur voor infectie uitgevoerd met P. gingivalis
of stimulatie met P. gingivalis
LPS gedurende 2 en 4 uur. Cellen gepreïncubeerd met 5 mM ATP gedurende 3 uur werden als controles voor deze groepen.
RNA-isolatie en kwantitatieve real-time RT-PCR
Na behandeling werden de cellen in 1 ml TRIzol reagens (Invitrogen) geoogst en RNA geëxtraheerd volgens de Trizol protocol. Voor reverse transcriptie werden de First-Strand cDNA gesynthetiseerd met oligo (dT) 12-18 (Invitrogen), 10 mM dNTP (Promega, Madison, WI, USA), 5 x eerste stand buffer, RNaseOUT ™ Recombinant RNase Inhibitor (Invitrogen) en SuperScript ™ III reverse transcriptase (Invitrogen) volgens het protocol van de fabrikant.
Primers voor genen die coderen inflammasoom componenten (NLRP3, ASC en caspase-1) en de cytokinen IL-1β en IL-18 (Tabel 1) werden ontworpen met behulp van Oligo Explorer software (1.1.0) en gesynthetiseerd door Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA, USA). Real-time RT-PCR werden uitgevoerd met SYBR Green gebaseerde testen met de Stratagene-MxPro Mx3005P System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). PCR reacties werden uitgevoerd met 2 pl verdunde cDNA monsters, 200 nM van elke respectieve voorwaartse en omgekeerde primer in een 20 pl eindreactiemengsel Platinum SYBR Green Supermix qPCR-UDG (Invitrogen). cDNA monsters geïsoleerd uit niet-gemanipuleerde H413 kloon-1 cellen werden gekwantificeerd door PicoGreen kit (Invitrogen) en vervolgens gebruikt voor de standaard curves (2-2000 pg) op basis van de expressie van het huishoudelijk gen dat codeert voor β-actine. De PCR-reacties voor elk gen werden in drievoud door activering bij 95 ° C gedurende 2 minuten met 40 PCR cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 15 s, annealing en extensie uitgevoerd in 96-well platen en geïnitieerd, gevolgd bij 60 ° C gedurende 30 s. De resultaten werden geanalyseerd met behulp van MxPro 4.10 software.Table 1 Primers gebruikt voor real-time RT-PCR
Genen
Oligo
Primers5'-3 '
Verwachte amplicon size
UniGene nummers
NLRP3
F-primer
GCTGGACCTGAGTGACAAC
151 bp
Hs.159483
R-primer
GCTGAGTACCGAGGACAAAG
ASC
F-primer
AGGCCTGCACTTTATAGACC
174 bp
Hs.499094
R-primer
GCTGGTGTGAAACTGAAGAG
caspase-1
F-primer
GAAAAGCCATGGCCGACAAG
205 bp
Hs.2490
R-primer
GCCCCTTTCGGAATAACGGA
IL-1β
F-primer
GGCCCTAAACAGATGAAGTG
90 bp
Hs.126256
R-primer
GTAGTGGTGGTCGGAGATTC
IL-18
F-primer
GCATCAACTTTGTGGCAAT
161 bp
Hs.83077
R-primer
CCGATTTCCTTGGTCAAT
β-actin
F-primer
ACTCTTCCAGCCTTCCTTC
216 bp
Hs.520640
R-primer
GGAGCAATGATCTTGATCTTC
Immunoassay-ELISA om het niveau van IL-1β en IL kwantificeren -18
een standaard sandwich enzym-gebonden immuno-sorbent assay (ELISA) werd gebruikt voor het meten van cytokineproductie IL-1β en IL-18. In het kort, supernatanten van de test (behandeld met P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS, ATP + P. gingivalis golfreizen of ATP + P. gingivalis
LPS) en controle celculturen werden verzameld op elk uur ( 1, 2, 3, 4, 5, 6 h), dan onmiddellijk deeltjes verwijderd door centrifugeren en geanalyseerd of porties verdeeld en bewaard bij -20 ° C. Humaan IL-1β en IL-18 specifieke monoklonale en polyklonale antilichamen (1 pg /ml) werden vooraf bekleed op high binding 96-well platen (Corning Incorporated, USA) in carbonaatbuffer (pH 9,0) bij 4 ° C overnacht. Na verwijdering van de bekledingsoplossing en het wassen van de plaat drie keer met 200 pl PBS /putje, de plaat bij 4 ° C geblokkeerd met 3% runderserumalbumine (BSA, Sigma) gedurende de nacht. De testmonsters werden toegevoegd aan triplo putjes gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door wassen met 0,05% Tween 20 /PBS (TPBS) driemaal; vervolgens geïncubeerd met secundair antilichaam (geit-anti-muis /konijn-IgG (DAKO, Glostrup, Denemarken) geconjugeerd met alkalische fosfatase (AP)) verdund 1: 1500 in TPBS gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens gewassen met TPBS buffer 3 keer. Gebonden conjugaten werden gedetecteerd door pNPP (p-nitrofenyl-fosfaat) en de absorptie bij 405 nm in een microplaat reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) na 15-30 min incubatie bij kamertemperatuur. Reacties werden gestopt door toevoegen van een gelijk volume van 1,00 M NaOH. De humane IL-1β en IL-18 concentratie van de monsters werden geïnterpreteerd vanuit een standaardcurve.
Immunoblots voor NLRP3, ASC en caspase-1 eiwitten Belgique Om inflammasoom eiwitexpressie, 2- en 4-uur culturen van meten de verschillende omstandigheden (behandeld met P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS, ATP 3 h + P. gingivalis golfreizen of ATP 3 h + P. gingivalis
LPS) werden in SDS monster buffer geëxtraheerd en gescheiden door PAGE behulp gradiënt 5-12% mini-gel, overgebracht naar nitrocellulose membranen (Bio-Rad) en overnacht geblokkeerd met 3% BSA (Sigma) in 0,1 M Tris gebufferde zoutoplossing pH 7,4 (TBS). Geblotte antigenen werden geïncubeerd met konijn polyklonaal anti-humane antilichamen CIAS1 /NALP3, TMS1 /ASC, Caspase-1 (1 ug /ml, Abcam, Cambridge, UK) en β-actine (0,1 ug /ml, Gentex, Zeeland, MI , USA) als ladingscontrole in 0,05% Tween20 /TBS gedurende 4 uur, driemaal gewassen en vervolgens geïncubeerd met alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd secundair antilichaam (geit anti-konijn IgG, DAKO) verdund 1: 1500 in Tween 20 /TBS gedurende 2 h. Gebonden antilichaam werd zichtbaar gemaakt met AP substraat (Bio-Rad) na de ontwikkeling van reactiviteit voor eiwitten uit controle-antilichaam.
Statistische analyse Alle gegevens werden geanalyseerd met gepaarde t-test
(gemiddelde ± SD, tweezijdig , 95% CI bereik) uit ten minste drie opeenvolgende experimenten voor real-time RT-PCR en ELISA. Voor western blot kwantificeren, werd de densitometrische analyse uitgevoerd op het grijsniveau intensiteit van doelbandbreedtes opzichte van β-actine groepen afgeleid van gescande films controleren, verwerkt door Gene Tool beeldanalysesoftware (GeneToos, versie 4.02, Syngene, Cambridge, UK) [33]. P Restaurant & lt; 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
inflammasoom (NLRP3, ASC en caspase-1) expressie in reactie op P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS en ATP plus P. gingivalis
/P. gingivalis
LPS
In alle experimenten, waren er geen significante verschillen in genexpressie tussen niet gestimuleerde controle groepen en controlegroepen voorbehandeld met ATP.
Zoals getoond in Fig. 1a, er neerwaartse regulatie van genexpressie NLRP3 naar P. gingivalis
infectie op 2 en 4 uur in vergelijking met de controlegroep. Daartegenover werd verhoogde genexpressie van NLRP3 in 2 uur met P. gingivalis
LPS stimulatie. Bovendien NLRP3 aanzienlijk opgereguleerd na pre-incubatie met ATP gedurende 3 uur daarna infectie met P. gingivalis Kopen en stimulatie met P. gingivalis
LPS gedurende 2 uur, maar werd down-gereguleerd 4 uur. Op het eiwitniveau (fig. 2), terwijl de cellen werden gedurende 2 en 4 uur met P. gingivalis Kopen en P. gingivalis
LPS stimulatie of voorbehandeling met ATP gedurende 3 uur, de ontwikkeling van de proteolyse van NLRP3 bands overeen met die van de genexpressie. Dit gaf aan dat de activering van NLRP3 afhankelijk P. gingivalis
LPS en /of ATP, maar niet P. gingivalis infectie
. Fig. 1 Gen uitingen van NLRP3, ASC en caspase-1. Significante veranderingen in genen die coderen inflammasoom NLRP3 (a), geassocieerde adapter eiwit (ASC) (b) en caspase-1 (c) met verschillende behandelingen van P. gingivalis infectie
, P. gingivalis
LPS stimuli, en ATP plus P. gingivalis golfreizen of P. gingivalis
LPS in H413 epitheelcellen. * P Restaurant & lt; 0,05, ** P Restaurant & lt; 0,01, gepaarde t-test
Fig. 2 Western blot die NLRP3 eiwitexpressie in H413 epitheelcellen behandeld met verschillende omstandigheden (P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS en ATP plus P. gingivalis golfreizen of P. gingivalis
LPS). De trends van de gemeten NLRP3 bands overeen met NLRP3 genexpressie. * P Restaurant & lt; 0,05, gepaarde t-test
in Fig.1b gedurende het tijdsverloop van P. gingivalis infectie
waren er significante dalingen ASC mRNA niveaus (2 en 4 uur) in vergelijking met de controlegroep, en aanzienlijke verhogingen van ASC mRNA niveaus werden waargenomen bij 2 uur stimulatie met P. gingivalis
LPS. ATP plus P. gingivalis
infectie was up-regulatie van ASC in 2 uur, gevolgd door neerwaartse regulatie van 4 uur in vergelijking met de ATP vooraf behandelingsgroep. ATP plus P. gingivalis
LPS stimulatie, was er een duidelijke vermindering van ASC in 4 uur, vergeleken met de ATP vooraf behandelingsgroep. Deze resultaten suggereren dat ASC mRNA veranderingen zijn van cruciaal belang in P. gingivalis
LPS en ATP-geïnduceerde NLRP3 inflammasoom activering. Op het eiwitniveau, soortgelijke veranderingen in ASC-eiwit werden gemeten (data niet getoond).
Bovendien, zoals blijkt uit Fig. 1c, toonden de gegevens dat er geen toename in caspase-1 genexpressie in zowel P. gingivalis
geïnfecteerde en P. gingivalis
LPS gestimuleerde groepen. Nadat de cellen werden vooraf geïncubeerd met ATP gedurende 3 uur, de caspase-1 niveau zowel P. gingivalis infectie
(2 h) en P. gingivalis
LPS stimulatie (2 en 4 uur) groepen was significant up- geregeld vergeleken met ATP voorbehandeling groep. Deze resultaten geven aan dat caspase-1 activering afhankelijk ATP stimulatie P. gingivalis
besmet of P. gingivalis
LPS behandelde cellen. Er waren geen veranderingen op caspase-1 eiwitniveau door immunoblots (gegevens niet getoond).
IL-1β expressie in reactie op P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS en ATP plus P. gingivalis
/P. gingivalis
LPS Evenzo
, veranderingen in IL-1β expressie door middel inflammasoom componenten activering te bepalen werd de genexpressie van IL-1β gemeten door real-time RT-PCR (Fig. 3a). Gedurende het tijdsverloop van P. gingivalis infectie
, een aanzienlijke toename van pro-IL-1β mRNA-niveau werd gemeten 2 uur vergeleken met de controlegroep, die vervolgens wordt verlaagd tot het controleniveau bij 4 uur. Verhoogde pro-IL-1β mRNA niveaus werden ook waargenomen na cellen voorbehandeld met ATP gedurende 3 h vervolgens geïnfecteerd met P. gingivalis
op 2 en 4 uur. Er waren geen wijzigingen met cellen gestimuleerd met P. gingivalis
LPS en ATP plus P. gingivalis
LPS. In celcultuur supernatanten (fig. 3b), was er een hoge concentratie van werkzaam IL-1β in 2 uur in de P. gingivalis infectie
groep, en 3 en 4 uur in de ATP plus P. gingivalis
infectie groep, dat overeenkomt met pro-IL-1β genexpressie (Fig. 3a). Er werd geen afscheiding van IL-1β gedetecteerd in de P. gingivalis
LPS stimulatie groep, maar een aanzienlijke toename vertraagde reactie op ATP plus P. gingivalis
LPS groep in 5 uur (fig. 3b). Deze resultaten gaven aan dat P. gingivalis infectie
een groter vermogen om IL-1β secretie dan P. gingivalis
LPS induceren. Fig. 3 een Veranderingen in pro-IL-1β mRNA in H413 cellen behandeld met P. gingivalis infectie
en ATP voorbehandeling. b ELISA gegevens waaruit blijkt rijpe IL-1β eiwit vrijgelaten uit H413 cellen na verschillende behandelingen. * P Restaurant & lt; 0,05, ** P Restaurant & lt; 0,01, gepaarde t-test
IL-18 expressie in reactie op in reactie op P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS en ATP plus P. gingivalis Twitter /P. gingivalis
LPS
genexpressie van IL-18 werd ook gemeten door real-time RT-PCR (Fig. 4a). Er was geen verandering in pro-IL-18 gemeten in de P. gingivalis infectie
groep maar daalden pro-IL-18 in de P. gingivalis
LPS stimuli groep op 2 uur. Bovendien, de voorbehandeling van cellen met ATP gedurende 3 uur induceerde de up-regulatie van pro-IL-18 op alle tijdstippen en aanzienlijk toegenomen IL-18 expressie in zowel de P. gingivalis infectie
en P. gingivalis
LPS stimuli groepen. In celcultuur supernatanten (fig. 4b), cellen gestimuleerd met P. gingivalis
LPS een significante toename van werkzaam IL-18 secretie waarbij een piek tussen 4 uur en 5 uur bereikt. Dit was niet duidelijk in de P. gingivalis
infectie groep. Deze hoge eiwitgehalte niet overeenkwam met de lage pro-IL-18 mRNA-niveau in de P. gingivalis
LPS-groep, eventueel als eiwitconcentratie wordt beïnvloed door verschillende parameters - voornamelijk synthese en splitsing [34]. Nadat de cellen waren voorbehandeld met ATP gedurende 3 uur, uitscheiding van rijp IL-18 in celkweekmedium werd gemeten in de ATP plus P. gingivalis infectie
groep, en toonde een aanzienlijke toename cytokineconcentratie. Echter, in de ATP-plus P. gingivalis
LPS-groep, werd een bifasische curve, die geen afspiegeling van het mRNA-niveau [34]. Deze resultaten geven aan dat P. gingivalis infectie
niet werkzaam IL-18 secretie veroorzaakten, terwijl P. gingivalis
LPS stimulatie of ATP tot een werkzaam IL-18 productie. Fig. 4 een Veranderingen in de pro-IL-18 mRNA-niveaus in H413 cellen met verschillende behandelingen van P. gingivalis
LPS stimuli en ATP plus P. gingivalis
infectie of P. gingivalis
LPS. b ELISA gegevens waaruit blijkt rijpe IL-18 eiwit vrijgelaten uit H413 cellen na verschillende behandelingen. * P Restaurant & lt; 0,05, ** P Restaurant & lt; 0,01, gepaarde t-test
Veranderingen in de NLRP3 inflammasoom complex na stimulatie met P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS en ATP
Figuur 5 geeft een overzicht van de aangeboren immuunrespons tegen P. gingivalis
infectie, en P. gingivalis
LPS en ATP-stimulatie in deze cel model. Wanneer de cellen niet voorbehandeld met ATP (linker paneel), infectie met P. gingivalis
in dit model niet leiden tot de activering van de NLRP3 inflammasoom complex, waaronder NLRP3, ASC en caspase-1, tot P. gingivalis
LPS stimulatie, hoewel in een korte tijd 2 uur (behalve caspase-1). Met name heeft IL-1β productie niet afhankelijk activatie van de NLRP3 inflammasoom en is betrokken bij de vroege stadia van ontsteking. IL-18-productie vereist zowel NLRP3 en ASC activering na stimulatie met P. gingivalis
LPS. Wanneer de cellen voorbehandeld met ATP (rechter paneel), een snelle reactie van activatie van NLRP3 inflammasoom krijgt (2 h), met daarop volgende productie van de cytokinen IL-1 β en IL-18 in cellen met P. gingivalis infectie
. Echter, wanneer de cellen gestimuleerd met P. gingivalis
LPS, IL-1β produceren van caspase-1 activering en vertoonden een vertraagde toename in reactie op ATP behandeld (rechter paneel). De resultaten geven aan dat P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS en ATP hebben verschillende effecten op epitheelcellen de uiteindelijke inflammatoire respons. Fig. 5 Aangeboren immuunrespons op P. gingivalis
infectie of P. gingivalis
LPS en ATP-stimulatie in epitheelcellen. In het linker paneel, wanneer de cellen gestimuleerd met P. gingivalis
infectie of P. gingivalis
LPS zonder ATP voorbehandeling, de NLRP3 inflammasoom complex wordt geremd tot P. gingivalis
LPS stimulatie, met uitzondering van de caspase-1 . IL-1β productie niet afhankelijk NLRP3 inflammasoom echter IL-18 secretie voert NLRP3 en ASC activatie. In het rechter paneel, cellen voorbehandeld met ATP, die NLRP3 inflammasoom activeert, resulteert in de volgende release van de cytokines IL-1β en IL-18 in P. gingivalis
geïnfecteerde cellen. ATP kan ook bevorderen caspase-1 activering van P. gingivalis
LPS stimulatie. Secretie van IL-1β steeds in overeenstemming met caspase-1 activering na stimulering met P. gingivalis
LPS
Bespreking In deze studie, P. gingivalis infectie
down-reguleert NLRP3 inflammasoom componenten, waaronder NLRP3 , ASC en caspase-1 in epitheelcellen op alle tijdstippen, hetgeen aangeeft dat P. gingivalis
kan ofwel up-reguleren of neerwaarts reguleren van expressie NLRP3, afhankelijk van het celtype [35]. In dit model, kan P. gingivalis of the eindpunt temperen aangeboren immuunrespons door remming van de activering van NLRP3 inflammasoom en ontwijken gastheer surveillance, het aanbieden van een survival voordeel voor alle medewerkende habiting organismen van de biofilm [35]. Ondertussen, opwaarts gereguleerd genexpressie van IL-1β naar P. gingivalis infectie
, toont aan dat IL-1β een kritische cytokine in de afweer tegen P. gingivalis infectie
[5]. Bovendien IL-1β niet NLRP3 of caspase-1 afhankelijke [5, 36] en andere factoren kunnen invloed hebben op de IL-1β eiwitsecretie. Derhalve speculeren wij dat de afscheiding van IL-1β in de vroege stadia van P. gingivalis infectie
een belangrijke rol spelen bij de bestrijding van de binnendringende pathogeen kader van de aangeboren immuunrespons [37]. Dit is in overeenstemming met conclusie Dinarello dat IL-1β is een van de oudste cytokinen gedurende de eerste fasen van ontsteking worden uitgescheiden en participeert in bijna alle gebeurtenissen betrokken bij de activering en regulering van ontsteking [36]. Dit soort inflammasoom-onafhankelijke IL-1β activatie aanzienlijk bijdragen tot weefselontstekingen [38].
In deze studie LPS wekt een opvallende immuunrespons tot up-regulatie van de genexpressie van NLRP3 en ASC, maar niet caspase -1, wat aangeeft dat P. gingivalis
LPS een belangrijke factor bij het opwekken van de ontstekingsreactie die leidt naar de zieke toestand [16] en wordt beschouwd als een belangrijke virulentie-factor in de pathogenese van parodontitis zou zijn. Echter, Jain en Darveau onderzoek toegelicht dat activatie van NLRP3 en ASC na pro-inflammatoire stimuli zoals LPS betrokken kunnen zijn bij de apoptose van gastheercellen, die steunt het idee van P. gingivalis
-geïnduceerde celdood [39], die zou dan vergemakkelijken periodonto-pathogenen binnen te vallen en te vernietigen epitheliale weefsels. Bovendien wordt caspase-1 gesynthetiseerd als een inactieve zymogeen. De activering wordt strak gereguleerd door inflammasoom en gekoppeld aan een snelle en lytische vorm van celdood genoemd pyroptosis [40]. Dit kan het mechanisme dat caspase-1 activering wordt geremd na P. gingivalis
LPS stimulatie tot geactiveerd met ATP stimuli in het huidige onderzoek uit te leggen.
ATP is een zeer efficiënte extracellulaire noodsignaal [41]. Als één van de eerste activatoren beschreven NLRP3 inflammasoom induceren, wordt toegeschreven aan de groep van endogene DAMPs, die uit stervende cellen [22]. In deze studie demonstreren we dat ATP activeert de NLRP3 inflammasoom vervolgens vrijgeven van cytokines IL-1 β en IL-18, hoewel het effect is zeer tijdelijk en de concentratie kan niet hoog genoeg zijn om het niveau van geactiveerde NLRP3 inflammasoom handhaven. Deze bevindingen ondersteunen dat extracellulair ATP als gevaar signaal, leidt tot assemblage van NLRP3 inflammasoom en uitscheiding van rijp cytokinen in P. gingivalis
geïnfecteerde cellen [26]. Bovendien een gemeenschappelijke noemer van extracellulair ATP activeren NLRP3 heeft de mogelijkheid om membraanporiën die schade aan membraanintegriteit induceren of verstoring van de intracellulaire ionenconcentratie [22] veroorzaken vormen.
Bovendien na stimulatie met ATP en P. gingivalis
LPS, vermindering van ASC genexpressie kan dienen als een mechanisme voor het afsluiten van ontsteking, waardoor sloven immuunresponsen [32] vermijden. Ook de epitheliale cellijn (H413) gebruikt in deze studie heeft de functie om de activiteit en secretie van IL-1β [42] beperken de cel tegen het weefsel vernietiging. Dit kan
onze bevinding te verklaren dat een uitgestelde toename van IL-1β reactie op ATP plus P. gingivalis
LPS stimulatie. Conclusies
De resultaten geven aan dat P. gingivalis
LPS stimulatie induceerde een grotere proinflammatoire reactie dan P. gingivalis infectie
en deze actie wordt intenser na voorbehandeling van ATP. Deze resultaten kunnen nieuwe inzichten verschaffen in targets voor therapeutische strategieën voor de behandeling van ontstekingsziekten zoals parodontitis
Afkortingen
ASC.
Apoptose-geassocieerde splinter-achtige eiwit
ATP:
adenosine trifosfaat
DAMPs:
Danger-geassocieerde moleculaire patronen
NLRP3:
Nod -achtige receptor (NLR) familie, de pyrin domein-bevattende 3
PAMPs:
pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen
P . gingivalis extra's:
Porphyromonas gingivalis
P. gingivalis
LPS.
Lipopolysaccharide van P. gingivalis
verklaringen
Dankwoord
Wij danken Professor Neil Hunter en dr Ping Ye voor hun technische en laboratorium ondersteunt. We danken ook dr Jinlong Gao en dr Xiaoyan Zhou voor het verstrekken van P. gingivalis
Open AccessThis artikel wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http:.. //Creativecommons org /licenties /door /4. 0 /), die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elk medium toestaat, mits u de juiste krediet aan de oorspronkelijke auteur (s) en de bron te geven, een link naar de Creative Commons licentie, en aangeven of wijzigingen zijn aangebracht. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
