.
Abstracte achtergrond
Deze studie is bedoeld om de morfologische kenmerken observeren en identificeren van de functie kenmerken van junctional epitheel (JE) weefsels en cellen gekweekt JE
Methods
Paraffinecoupes van menselijke mol of premolaren op het tandvlees buccolinguale kant werden bereid uit 6 personen. HE kleuring en beeldanalyse werden uitgevoerd voor het meten en vergelijken van de morfologische verschil tussen JE, orale tandvlees epitheel (OGE) en sulculaire epitheel (SE). Immunohistochemie werd aangebracht op het expressiepatroon van cytokeratine 5/6, 7, 8/18, 10/13, 16, 17, 19 detecteren en 20 in JE, OGE en SE. Anderzijds, primaire humane JE en OGE cellen werden gekweekt in vitro. Cell identificeren werd bevestigd door histologie en immunohistochemie. In een co-cultuurmodel, werd TEM gebruikt om de vorming bevestiging tussen JE cellen en tandoppervlak observeren.
Resultaten
Human JE een uniek weefsel dat anders SE en OGE in morfologie was. Evenzo JE morfologie van cellen werd ook bepaald ten opzichte OGE cellen gekweekt in vitro. Daarnaast JE cellen had een langere incubatietijd dan OGE cellen. Verschillende expressie van verschillende CKs geïllustreerd JE was in een kenmerk van lage differentiatie en hoge regeneratie. Nadat co-gekweekt gedurende 14 d, meerdere cellagen, basaalmembraan-achtige en hemidesmosome structuren zijn verschenen op de kruising van JE celmembraan en tandoppervlak.
Conclusies
JE is een speciaal gelaagd epitheel met lage differentiatie en hoge regeneratievermogen in gingivale weefsel zowel in vivo als in vitro. In co-cultuur model, kunnen menselijke cellen JE basaal membraan-achtige en hemidesmosome-achtige structuren te vormen in ongeveer 2 weken.
Sleutelwoorden
Junctionele epitheel Oral tandvlees epitheel Cytokeratin Immunohistochemie Co-cultuur Electronic aanvullend materiaal
online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-30) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is achtergrond
tandvlees epitheel bestaat uit drie regio's:. orale tandvlees epitheel ( OGE), sulculaire epitheel (SE) en junctionele epitheel (JE). JE is een gespecialiseerde tandvlees epitheel van bij de kruising van parodontale zacht weefsel en hard weefsel, en verbonden aan de kroon of wortel als een kraag. JE cellen uniform van vorm (vlak of as) en evenwijdig aan het tandoppervlak, met grote intercellulaire ruimten door ontspannen celjuncties [1]. Als een speciale structuur op dento-tandvlees knooppunt JE is anders dan andere epitheliums (OGE, SE) in oorsprong, celmorfologie, proliferatie en differentiatie [2, 3]. Ondertussen is gerapporteerd dat JE essentieel is voor de integriteit van parodontale weefsels [4, 5] handhaven en is een belangrijk gebied voor de primaire optreden van periodontale ziekten en behandelingen [6]. Daarnaast werd een neutrofiel-defensins gevonden te lokaliseren in de junctional epitheel, die aanzienlijk epitheliale integriteit en werking (keratinocyten hechting, spreiding en proliferatie) heeft, en de effecten buiten hun antibacteriële activiteiten [7]. Het is echter nog onduidelijk en controversieel over JE bij de differentiatie, fagocytose, mechanisme van de bevestiging daarvan tandoppervlak, reparatie en reconstructie mechanisme na beschadiging [5, 8]. Ondernemingen De gebruikelijke werkwijzen voor histologische onderzoek JE in vivo zijn simplistisch in aanpak en in het bereik van de waarneming [9-12] beperkt. De laatste jaren hebben wetenschappers de JE bestudeerd middels in vitro celcultuur modellen en moleculaire cytologische technieken die dierlijke en /of menselijke cellen OGE, periodontale ligament epitheelcellen en orale epitheelcellen [13-16]. Hoewel deze cellen orale epitheelcellen, kunnen ze niet volledig model JE primaire cellen door verschillen in de bron, morfologie, structuur, differentiatie en stimuli die proliferatie induceren.
Cytokeratines (CK's) zijn intermediaire filament eiwitten van cytoskelet familie en zijn de belangrijkste structurele eiwitten in epitheelcellen. Zoals bekend, de expressie van keratine is een van de definitieve kenmerken van epitheliale cellen en weerspiegelt de biologische eigenschappen van epitheelcellen, met inbegrip van hun oorsprong, voortschrijding, weefseltype en differentiatieniveau [17, 18]. Verschillende onderzoeken hebben de expressie en verdeling van verschillende CKs (CK-pan, 5/6, 7, 8/18, 10/13, 16, 17, 19, 20) in periodontale weefsels van mensen en dieren bestudeerd en de expressie van een aantal keratine in tandvlees epitheel werden bepaald [15, 19-21]. Bijvoorbeeld, de expressiepatronen van CK10 /13, 16, 19 in JE verschilden van die in OGE en SE; De bijzonder hoge expressie van CK19 in alle lagen van JE maakte werd een karakteristieke histologische marker voor JE in vivo [3, 22-24]. Echter, de uitingen van verschillende soorten cytokeratine in JE en het verschil met OGE en SE zijn niet systematisch gemeld.
In deze studie werden de morfologische kenmerken van JE weefsels onderzocht door histologische observatie, beeldanalyse en immunohistochemie. De expressie en verdeling van verschillende CKs werden bepaald JE weefsels en vergeleken met OGE en SE. Trouwens, primaire JE en OGE cellen werden gekweekt. De morfologische structuur en groeipatroon van primaire en JE OGE cellen waargenomen en de uitingen van specifieke keratines (CK-pan, 19, 10/13, 16) werden ook gedetecteerd door immunohistochemie. We vermoeden dat de unieke biologische eigenschappen (morfologie, regeneratief potentieel) van JE identificeren vivo en vitro. Verder werden gekweekte humane JE cellen direct gezaaid op menselijke wortel segmenten in een samengestelde kweek om het proces JE nieuwe attachment verkennen. Dit zou experimenteel bewijs vormen voor de verdere studie van hoe de nieuwe bevestiging vindt plaats na parodontale chirurgie en de vorming van peri-implantaat weefsel genezing in de kliniek.
Methods
morfologische kenmerken van de menselijke tandvlees epitheel weefsels
Menselijke tandvlees exemplaren werden geïsoleerd van onderkaak exemplaren van vier mannelijke en twee vrouwelijke patiënten met een mandibulaire ameloblastoom. Zij waren niet-rokers zonder andere ziekten. De leeftijd en monsternemingsplaats was lijst in tabel 1. Een ablatieve operatie uitgevoerd in het departement van orale pathologie aan de Negende People's Hospital Affiliated naar Shanghai Jiao Tong University tussen september en oktober van 2010 werd uitgevoerd Het onderzoek werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie , en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten. Mandibulaire kies of premolaren en haar tandvlees weefsels ver van de tumor site met normale tandvlees morfologie werden geselecteerd door klinische observatie. Bovendien, de monsters minder dan 3 mm diep gedetecteerd door parodontale sonderen werden verzameld en in 10% formaldehyde gefixeerd bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. De monsters werden in Plank-Rychło geplaatst ontkalken oplossing (70 g AlCl
3, 56 ml mierenzuur, 85 ml zoutzuur en gedestilleerd water toegevoegd aan 1 L) gedurende 2 weken na verticale werden gesneden tot de lange as van de tand langs de buccolinguale kant met behulp van een handzaag. Tenslotte bevat 5 mm dikke panelen van tanden en tandvlees weefsels in het midden van de tand werden verkregen uit elk monster. Daarna werden deze secties onderworpen aan dehydratatie en paraffine ingebedde ethanol. Drie paraffineblokken werden willekeurig gekozen uit elk specimen en serieel coupes 4 urn. De plakjes werden gekleurd met hematoxyline-eosine (HE) en waargenomen onder lichtmicroscoop. De breedte, dikte, het gebied van JE en de breedte van SE aan de buccale zijde werden gemeten door Axioplan image 2 analyse system.Table 1 Gemeten afmetingen in menselijke JE en SE
monster niet.
Leeftijd
Sampling website
Breedte van JE (mm)
Dikte van JE (mm)
Area van JE (mm2)
Breedte SE (mm)
1
21
Premolar
1.135
0.069
0.047
0.325
1.134
0.066
0.045
0.321
1.133
0.064
0.043
0.334
2
28
Molar
1.113
0.062
0.043
0.308
1.102
0.066
0.044
0.303
1.120
0.065
0.044
0.323
3
31
Molar
0.850
0.058
0.041
0.563
0.845
0.059
0.041
0.565
0.847
0.060
0.041
0.554
4
28
Molar
0.838
0.052
0.038
0.550
0.844
0.055
0.040
0.552
0.858
0.056
0.040
0.543
5
33
Premolar
1.105
0.083
0.043
0.785
1.108
0.083
0.043
0.801
1.105
0.083
0.041
0.808
6
38
Premolar
1.081
0.069
0.041
0.625
1.072
0.065
0.038
0.667
1.078
0.069
0.040
0.644
Mean
1.021
0.066
0.042
0.532
Standard afwijking
0,128
0.009
0.002
0,176
Het monster 2, 3 waren vrouwen en de linker waren mannetjes .
door scheiding van JE met het tandoppervlak na ontkalking, de grens tussen JE en SE werd bepaald volgens huidlijnen, keratinisatie, celmorfologie en kleuring. Volgens de projectie methode werden loodrechte lijnen getrokken uit vrije marge van SE, kruising van JE en SE, en de meest wortel deel van JE de richting van het tandoppervlak, respectievelijk. De projectie lengten van SE en JE op het tandoppervlak werden gemeten als hun breedte. Een loodrechte lijn werd getrokken op het dikste deel van JE en de afstand tussen de twee snijpunten van de loodrechte lijn en epitheel werd gemeten als de dikte van JE. Een curve getrokken uit de wortel van JE de oprit SE inbegrip van de volledige JE gebied en gebied (figuur 1). Figuur 1 Schema beschrijving van de meting JE en SE. A. SE breedte; B. JE breedte; C. JE dikte; D. JE omgeving.
Menselijke JE en OGE cellen cultuur
Om cultuur JE en OGE cellen in vitro, incisies van 2 mm in de lengte werden gemaakt langs buccale en linguale marginale gingivae. Vijf gezond en volledig uitbrak tanden werden verwijderd, samen met orthodontische of beïnvloed tanden (12 tot 25 jaar oud, een goede mondgezondheid en klinisch gezond tandvlees). De tanden samen met de ingesneden marginale gingiva verwijderd. De gratis gingiva (inclusief OGE en SE) werd macroscopisch afgesneden zo veel mogelijk. JE weefsels stevig aan de tandhals (niet de wortel) werden afgeschraapt van het tandoppervlak (figuur 2), en gewassen met oplossing D-Hank's bevattende penicilline-streptomycine double antibiotica. De studie protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van Zhongshan Ziekenhuis (No: 2009-173). Figuur 2 JE monsters. A. Verwijder volledig losgebarsten geïmpacteerd tand met marginale tandvlees; B. Knip de overtollige vrije gingiva (inclusief OGE en SE); C. Blijf JE weefsel aan de tand nek; D. verkrijgen JE weefsel door schrapen op de tand nek; E. verwijderd JE weefsels; F. Smooth tandhals na het afschrapen.
In primaire kweek werden JE weefsels gedigesteerd met 2 ml DispaseII werkoplossing bij 4 ° C gedurende 16-18 uur. Het epitheel werd gescheiden van de lamina propria van forceps, en vervolgens in stukken gesneden, omgezet met 4 ml van 0,025% trypsine-EDTA 0,01% 5-8 minuten onder roeren. De digestie werd beëindigd door toevoeging van oplossing D-Hank's bevattende 10% FBS, gevolgd door filtratie via 180 urn roestvrijstalen zeef en vervolgens centrifugeren. De precipitaten werden gemengd in (gedefinieerd keratinocyten kweekmedium) DKGM naar cel suspensie. Cellen werden gezaaid in 24-well platen bij 2 x 10 5 cellen /ml, en in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator. Het medium werd ververst na 3 dagen voor de eerste keer, daarna eenmaal daags. In passage kweek werden de cellen gepasseerd op 60-70% confluentie door toevoeging van 0,25% trypsine-EDTA 0,02% bij 37 ° C gedurende 5-8 min. Wanneer de cellen onder een microscoop verscheen afgerond, werd de digestie beëindigd. Vervolgens werden de cellen gesuspendeerd en gecentrifugeerd. DKGM werd toegevoegd aan celsuspensie te vormen, en verdeeld over nieuwe petrischalen. Anderzijds werden OGE cellen behandeld zoals hierboven JE cellen. Anders werd het OGE weefsel snijd ze in kleine stukjes van 5 x 5 mm 2. De OGE celsuspensie werd gezaaid met dichtheden variërend 5-10 x 10 5 cellen /ml in petrischalen van 60 mm diameter. De gekweekte cellen werden dagelijks geobserveerd via omgekeerde fase contrast microscoop hun morfologie en groei-omstandigheden te volgen. Bovendien werd de passage enkele celsuspensie geïnoculeerd dichtheden variërend 2-5 x 10 5 cellen /ml op dekglaasjes in steriele petrischalen. Vervolgens behandeld met H & E kleuring wanneer cellen werden gekweekt tot 60% confluentie en waargenomen met een lichtmicroscoop veranderingen in de morfologie en structuur volgen
Cell groeicurve van JE en OGE cellen
Primaire JE, OGE cellen. bij 100% confluentie werden gedigereerd enkelvoudige celsuspensie te vormen en geënt bij een dichtheid van 2 x 10 4 /cm 2 in 24-well platen. Cellen in twee willekeurige putjes werden dagelijks geteld met een hematocytometer. Een celgroei curve uitgezet door het gemiddelde aantal cellen per dag versus het aantal dagen. De verdubbeling van de tijd werd verkregen uit de groeicurve die de lengte van de tijd die nodig is voor de cellen te verdubbelen van het aantal gedurende de logaritmische fase zouden kunnen wijzen.
Immunohistochemie analyse van menselijke tandvlees epitheel weefsels en vitro gekweekte cellen
Immunohistochemische peroxidase-geconjugeerd streptavidine (SP) methode werd uitgevoerd op menselijke gingivale weefsel door incubatie met anti-CK 5/6 (kloon D5 /16B4), anti-CK 7 (OV-TL12 /30), anti-CK 8/18 (kloon Zym5.2) anti-CK 10/13 (kloon DE-K13), anti-CK 16 (kloon LL025), anti-CK 17 (kloon E3), anti-CK 19 (kloon A53 /BA2) en anti-CK 20 (kloon KS20 0,8). Deze anti-cytokeratine humane monoklonale antilichamen werden verkregen van Zymed (U.S.A.). Menselijke parotis weefsel werd gekleurd zoals positieve controle [25] en het primaire antilichaam vervangen door PBS werd gebruikt als negatieve controle. De immunohistochemische kleuring procedure werd uitgevoerd door Ab instructies van de fabrikant. Eenvoudig werden van was ontdaan secties geïncubeerd met pepsine oplossing bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten en geïncubeerd met blokkerende serum bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Primair antilichaam op 1:50 verdunning werd in de werkgroep en de positieve controle toegevoegd. PBS in plaats van het primaire antilichaam is in de negatieve controle toegevoegd. Na bij 4 ° C worden geïncubeerd gedurende de nacht werden de coupes geïncubeerd in de werkoplossing met biotine gemerkt tweede antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 30 min, gevolgd door mierikswortelperoxidase gemerkt streptavidine oplossing bij kamertemperatuur. DAB chromogene oplossing werd gedurende 5-10 minuten. Coupes werden gespoeld met stromend water, opnieuw gekleurd met hematoxyline en gemonteerd. Anderzijds, gepasseerd cellen gehecht aan enten dekken werden bevestigd met 10% neutrale formaline. De cellen werden behandeld zoals hierboven JE weefsels. In deze cellen, CK-Pan, CK19, CK10 /13 en CK16 werden gedetecteerd. Het cytoplasma van CK positieve cellen was bevlekt en werd geclassificeerd als negatief (-) zonder kleurstoffen, zwak positief (+) met het kleuren van licht geel, matig positief (++) met het kleuren van geel of sterk positief (+ + +) met kleuring van bruin [26].
Co-cultuur van menselijke JE cellen en wortel plakjes
tanden plakjes waren van dezelfde monsters aangeworven voor de primaire cellen JE. Monsters werden overlappend schroot met een Grace curette om de parodontale membraan te verwijderen. Ze werden gefixeerd in 10% neutraal formaline gedurende 12 uur, en ontkalkt gebruik Plank-Rychło ontkalking oplossing voor 2 weken. De kronen werden verwijderd en de tanden doorgesneden langs het worteloppervlak in tandheelkundige films van 5 x 5 mm 2 groot en 1-1,5 mm dik. De films werden gewassen 2-3D en gedrenkt in oplossing D-Hank's bevattende penicilline-streptomycine double antibiotica bij 4 ° C voor gebruik. De gepasseerde menselijke JE celsuspensie werd geënt in een dichtheid van 5 x 10 5 cellen /ml aan de wortel plakjes met de cement oppervlak in 24-well platen, 2-3 plakken per putje en geplaatst 14 d in een 37 ° C 5% CO 2 verzadiging vochtigheid incubator. Het medium werd 3 d later vernieuwd, en daarna eenmaal daags
Observatie via TEM. Root plakken werden verzameld 3, 5, 7, 9, 11 en 14 d na inoculatie respectievelijk in 2% glutaaraldehyde gefixeerd bij 4 ° C gedurende 2 uur. Root segmenten, met de cement oppervlak omhoog werden gesneden in stukjes van 5 × 1 × 1 mm, post-gefixeerd in 1% osmic zuur bij 4 ° C gedurende 2 uur, gedehydrateerd ethanol geweekt propyleenoxide bij KT 24 h, en ingebed in Araldite. De ingebedde monsters werden gesneden in ultradunne schijfjes, die zijn gekleurd met behulp loodcitraat, gevolgd door waarneming via TEM (PHILIP CM-120, Nederland) aan de vorming van JE cellen hechting aan het oppervlak te volgen cement.
Resultaten
Morfologische analyse van menselijke tandvlees epitheel weefsels
Onder de microscoop, JE was kort en stripachtige, geleidelijk verdikt uit de cement-glazuur afslag naar de coronale. Na gekleurd met HE, geen keratinisatie of epitheliale ruggen bestond in JE weefsel dat werd verdeeld in basale laag en suprabasale laag, terwijl keratinized of gedeeltelijk verhoornde epitheel, dicht en onregelmatige epitheliale ruggen uitsteekt in aangrenzende bindweefsel gevonden in donker gekleurd SE en OGE weefsel (Figuur 3A). Bovendien JE cellen waren verschillend van SE en OGE in morfologie en had duidelijke grens met SE (Figuur 3B). De cellen in JE weefsel waren uniform van vorm, vlak of as, evenwijdig aan het tandoppervlak en de cellulaire verbindingen waren los met duidelijke intercellulaire ruimte. Echter, SE en OGE cellen waren allemaal onregelmatige veelhoeken en strak uitgelijnd met minder of zelfs helemaal geen intercellulaire ruimte. Daarnaast JE cellen overvloedig in organellen en de kern was groot, en evenzo de kernen van SE en OGE cellen werden ook groot, maar hyperchromatische. Verder, SE en OGE cellen gepresenteerd typische structurele kenmerken van plaveiselcellen en kon wederzijds transformeren zonder duidelijke grens. Figuur 3 HE kleuring van humane gingivale weefsel. A. Het gebied tussen de pijlen is JE (x150); B. De grens tussen JE en SE, de pijl wijst naar de grens (x1200).
Volgens metingen in de beeldanalyse, JE weefsel was 1,021 ± 0,128 mm breed, 0,066 ± 0,009 mm dik, en 0,042 ± 0,002 mm 2 in het gebied, terwijl de SE was 0,532 ± 0,176 mm in breedte (tabel 1).
Morfologische analyse van gekweekte humane gingivale JE en OGE cellen in vitro
om JE cellen observeren duidelijk identificeren en de kenmerken werden JE en OGE cellen gekweekt in vitro. Hierdoor initieel gezaaide cellen primaire JE gepresenteerd verschillende morfologie, zoals veelhoekig vlak, spoelvormige, ovaal en bolvormig. Na 24-96 uur incubatie van de cellen gehecht aan de bodem petrischaal, het cytoplasma donker werd, het membraan was ruw en 2-3 maal cellen werden volledig gestrekt. De kernen waren groot en meestal 2-3 nucleoli in elke cel. Na 7 d, cellen kwam geleidelijk in snelle groeiperiode en verlengd langs de petrischaal rand naar het centrum. Verspreide mitose en celklonen met hoekige of spoelvormige morfologie verscheen zoals getoond in figuur 4A. Na 10-12 d, celklonen met verschillende morfologie, niet-uniforme grootte gevormde samenvloeiende vlekken (figuur 4B). In de eerste doorgang, cellen gehecht aan de schotel bodem en gestrekt in 24-48 uur na inoculatie, waarna de cellen gepresenteerd vergelijkbare morfologie met primaire cellen; In de tweede doorgang, JE cellen vertoonden een onregelmatige morfologie als pseudopodia 'giant cellen', en cytoplasmatische vacuolatie (Figuur 4C); In de volgende passages, de morfologie was onregelmatiger en celproliferatie leek te vertragen, zelfs de presentatie van het ouder worden en de dood tekenen (Figuur 4D). Figuur 4 Observatie van JE en OGE celmorfologie (primaire cellen). A. JE celklonen gevormd (de pijl x 200); B. Bij 10-12 d, JE cellen gepresenteerd ongelijkmatige morfologie en verspreide opstelling (x 200); C. De 3e passage JE cellen meerdere 'giant cells' verscheen (de pijl × 200); D. De 5e passage JE cellen vertoonden tekenen van veroudering en de dood (× 400); E. de OGE celklonen gevormd en geëxpandeerd (de pijl x 200); F. Bij 7-9 d, de OGE cellen gepresenteerd uniforme morfologie, strakke inrichting, en 'stoeptegel-achtige' keratiniserend (× 200); G. In de 3e passage verscheen OGE cellen 'giant cells' (× 200); H. De 7e passage OGE cellen vertoonden tekenen van veroudering en de dood (× 400)
Zoals de OGE cellen, aanvankelijk gezaaid primaire cellen gepresenteerd veelhoekige of bolvormen en gehandeld op grond van de schotel bodem binnen 24-72 uur.; Na 5 d, celklonen gevormd met driehoekige of veelhoekige morfologie, maar deze cellen uniformer dan JE celklonen van dezelfde periode (figuur 4E); Na 7-9 d, de OGE klonen vergroot en geconvergeerde, dan strak geregeld en toonde typische 'stoeptegel-achtige' keratinisatie (Figuur 4F); Na 9-11 d, werden de cellen ongeveer 100% confluent; In de tweede passage, cellen gehandeld en strekte in 48 uur. En dan de 'giant cellen' verscheen (figuur 4G); Na te zijn gepasseerd voor 4 keer werden cellen voornamelijk 'reuzencellen en proliferatie vertraagde ook met veroudering en dood tekens (Figuur 4H).
Daarna werden JE en OGE cellen gekleurd met HE en bekeken onder de microscoop. Hierdoor JE cellen leken diverse morfologie (spoelvormige, driehoek, ovaal), niet-uniforme grootte, ontspannen arrangement, groot en donker gekleurde kernen en nucleaire meerdere divisies zoals hierboven (figuur 5A) genoemd. Echter, OGE cellen dezelfde afmetingen, strak geregeld, meestal verhoornde en met ronde kernen in het centrum, maar ook toegankelijk nucleaire afdelingen (figuur 5B). Daarom JE waren significant verschillend van OGE in celmorfologie. Figuur 5 H & E kleuring van JE en OGE cellen (tweede passage onderworpen cellen, H & E × 400). A. JE cellen aanwezig non-uniform in grootte en morfologie, verspreid regeling, groot en diep-gekleurde kernen en meerdere nucleaire divisies; B. OGE cellen werden uniform in grootte en vorm, strak geregeld, en 'stoeptegel-achtige' keratiniserend.
Groei conditie van gekweekte JE en OGE cellen in vitro
Vervolgens analyseren we de groeiomstandigheden van deze twee cellen. Er waren meer OGE cellen gekweekt tegen JE. Dientengevolge, de incubatietijd JE cellen te hechten en prolifereren was 1-7 d in vitro, terwijl bij OGE cellen was 1-3 d, iets korter. De logaritmische fase en de groei piek van JE cellen verscheen in de 8 e - 12 e d (slechts voor 5 dagen), terwijl van OGE was 4 e - 11 e d (8 dagen). Na 12 d, JE en OGE cellen waren beiden in een periode van stagnatie ingevoerd. Daarnaast aantal JE cellen gegroeid van 6 x 10 4 /ml tot 12 x 10 4 /ml gedurende 9-12 dagen en OGE cellen is gegroeid van 7 x 10 4 /ml tot 14 x 10 4 /ml gedurende 6-10 dagen. Volgens de statistieken, de cel verdubbeling tijd van JE cellen was 48-60 h, terwijl OGE was 72-96 h. Over het algemeen, OGE vertonen zachter bochten dan JE (figuur 6). Zoals getoond in Figuur 7, werden met succes gepasseerd JE cellen gedurende 5 keer terwijl OGE 7 keer in dit experiment. De kwaliteit van de gepasseerde JE cellen drastisch gedaald na de 3e passage, maar na 4 e passage in OGE cellen. Figuur 6 Groeicurve van JE en OGE cellen. De JE cellen werden in latente fase (1-7 d na inenting), exponentiële fase (8-12 d) en plateau fase (daarna 12 d). OGE cellen in latente fase (1-3 d na inoculatie), exponentiële fase (4-11 d) en plateaufase (vervolgens 12 d).
Figuur 7 Passage aantal cellen en aantal cellen per doorgang voor JE en OGE cellen. (JE cellen werden vijfmaal door passage behandeld. OGE cellen werden 7 keer gepasseerd).
Immunohistochemie analyse van menselijke epitheel tandvlees weefsels en gekweekte cellen in vitro
Om de functionele eigenschappen van JE diep te identificeren, werden verschillende CK geanalyseerd. In humane gingivale epitheel weefsel, de expressie van CK5 /6 en CK20 vergelijkbaar hoewel CK5 /6 was sterker gekleurd. Ze werden positief gekleurd in de suprabasale laag (met name in de buurt van de oppervlakte) en negatieve gekleurd in de basale laag; De expressie van CK7 en CK17 negatief was of slechts een zwakke positieve in zeer weinig cellen; In CK10 /13 en CK16 werden ze uitgedrukt in alle lagen van JE maar alleen in de suprabasale laag OGE en SE; De expressie van CK10 /13 was sterk positief en CK16 was zwak positief of positief; CK19 werd gedetecteerd in alle lagen van JE met sterke positieve expressie, terwijl de expressie in OGE en SE beperkt tot de suprabasale laag en geen kleuring werd waargenomen in de basale laag. De grens tussen JE en SE speler vanwege het verschil in CK19 kleuring; Het expressiepatroon van CK8 /18 op een lager niveau soortgelijke CK19 behalve de basale laag van OGE en SE was. Daarnaast toonde ook zwakke positieve expressie in de suprabasale laag (dichtbij de basale laag) in sommige segmenten. De gedetailleerde beschrijvingen waren in tabel 2 en figuur 8.Table 2 Expressie patroon van verschillende cytokeratines in JE, OGE en SE
Antibody
CK
monster niet. (N)
Slice geen. (N)
JE
OGE
SE
b
sb
b
sb
b
sb
D5/16B4
5/6
6
20
-
++
-
+
-
+
OV-TL12/30
7
6
10
-
-
-
-
-
-
Zym5.2
8/18
6
15
++
++
+
-*
+
-*
DE-K13
10/13
6
20
+++
+++
-
+++
-
+++
LL025
16
6
18
+
+
-
++
-
+
E3
17
6
11
-
-
-
-
-
-
A53/BA2
19
6
10
+++
+++
+++
-
+++
-
Ks20.8
20
6
14
-
+
-
+
-
+
Let op: b: basale laag, sb: suprabasale layer, -. Negatief, +: zwak positief, ++: gematigd positief, +++: sterk positief, *: zwak positieve uitdrukking in de suprabasale laag in sommige plakken
Figuur 8 Immunohistochemie vlek van menselijke tandvlees weefsels (× 100). Kleuring tegen verschillende cytokeratines uitgevoerd. A. CK5 /6; B. CK7; C. CK8 /18; D. CK10 /13; E. CK16; F. CK17; G. CK19; H. CK20; I. Menselijke gingivale weefsel werd als negatieve controle; J. Human oorspeekselklierweefsel werd gebruikt als positieve controle.
In gekweekte cellen werden beide JE en OGE cellen positief gekleurd voor CK-Pan (Figuur 9A, B). Sterk positieve kleuring van CK19 werd waargenomen bij JE cellen (Figuur 9C), maar slechts een klein aantal verspreide OGE positieve cellen werden gekleurd (figuur 9D); De CK10 /13 smet van zowel JE en OGE cellen waren zwak positief of positief (Figuur 9E, F); Daarnaast werden twee soorten cellen verspreid positief gekleurd met CK16 (figuur 9G, H). De negatieve controles werden niet gekleurd in alle omstandigheden (figuur 9I, J). Figuur 9 Immunohistochemische kleuring van JE en OGE cellen (tweede passage cellen, SP × 400). A. JE cellen, CK-Pan positief; B. OGE cellen, CK-Pan positief; C. JE cellen, CK19 sterk positief; D. OGE cellen, CK19 in een zeer klein aantal verspreide positieve cellen; E. JE cellen, CK10 /13 zwak positief op positief; F. OGE cellen, CK10 /13 zwak positief op positief; G. JE cellen, CK16 verspreid positief; H. OGE cellen, CK16 verspreid positief; I. JE cellen, negatieve controle; J. OGE cellen, negatieve controle.
TEM waarneming van de vorming van cellen JE bevestiging aan segmenten
Tenslotte zal het ontstaan bevestiging tussen JE cellen en tandoppervlak werd onderzocht door een co-cultuurmodel wortel. JE cellen en wortel plakjes werden samen gekweekt in vitro. Vervolgens JE cellen menselijke cement oppervlak waargenomen. Drie dagen na inoculatie werden de cellen bolvormig en niet volledig gestrekt (figuur 10A); Vijf dagen later, het aantal JE cellen op cement oppervlak vergroot en een gedeelte van de cellen werden gestrekt (figuur 10B); Op 7 d, werden JE cellen volledig gestrekte vlakke-vormig, verbonden aan het cement oppervlak met celmembraan te zijn, maar bleek niet duidelijk basaal membraan en hemidesmosome-achtige structuren (figuur 10C); Bij 9 d, JE cellen bleek een klein aantal elektron-dichte vervuiling zoals bv hemidesmosome ten lokaal celmembraan gehecht aan cement oppervlak (pijlen, Figuur 10D); Bij 11-14 d, was er een significant verhoogd aantal cellen in de root segmenten en meerlagige cellen zich vormden (figuur 10E). Daarnaast is een groot aantal elektron-dichte deposito verscheen celmembraan-cement oppervlak junction. Tot slot, basaal membraan-achtige en hemidesmosome-achtige structuren werden gevormd (pijlen, Figuur 10F). Figuur 10 TEM opmerkingen van de structurele vorming van JE cellen bevestiging aan het cement oppervlak. A. Op 3 d, was er een klein aantal cellen op cement oppervlak, cellen bolvormig, niet rekken (TEM x 13.500); B. Op 5 d, cellen op cement oppervlak in aantal toegenomen, en een gedeelte van cellen gerekt (TEM x 9700); C. Op 7 d, cellen gestrekt flat-vormig zijn, en aan het cement oppervlak, maar vormden geen duidelijke basaalmembraan-achtige en hemidesmosome structuren (TEM x 24.500); D. Op 9 d, JE cellen bleek een klein aantal elektron-dichte vervuiling zoals bv hemidesmosome ten lokaal celmembraan gehecht aan cement oppervlak (pijlen, TEM x 33.000); E. Bij 11-14 d, was er een significante toename in celaantal op cement oppervlak en meerlagige cellen leken (TEM × 7400). F. een groot aantal elektronen-dichte deposito's (pijlen) verscheen JE celmembraan-cement oppervlak kruising, de vorming van het basaal membraan-achtige en hemidesmosome-achtige structuren (TEM × 46000).
Discussie
JE is een unieke menselijke tandvlees epitheel weefsel
Volgens de waarneming van de weefsels, vonden we dat normaal menselijk weefsel JE behoorde tot eenvoudige gelaagde epitheel. De cellen waren uniform van vorm, relatief lager in differentiatie, zonder keratinisatie en epitheliale randen in vivo. Dit is waarschijnlijk vanwege de locatie onder in de gingivale sulcus, tandoppervlak hechting en zelden onderworpen aan externe stimulatie. De SE en OGE worden blootgesteld aan mondholte milieu en vertonen typische kenmerken van plaveiselepitheel cellen. Zij werden veelhoek vorm, goed uitgelijnd, verhoornde in de oppervlaktelaag met dichte huidlijnen die geprojecteerd in het bindweefsel, en een duidelijk grens met JE. In preliminaire experimenten werden epitheliale ruggen ook gezien in JE van het tandvlees atrofie of parodontale pockets. Daaruit blijkt dat externe stimulatie en ontsteking kan leiden tot de vorming van epitheliale randen. Bovendien beeldanalyse resultaten bleek dat JE slechts ongeveer 1 mm lang, 60 urn breed en 15 tot 20 cellagen diep. Dit resultaat toonde aan dat het volume van JE weefsel was zeer klein en moeilijk te verzamelen, dat is een van de belangrijkste redenen waarom JE is moeilijk te bestuderen. Anderzijds, JE en OGE cellen werden geïsoleerd en gekweekt in vitro. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
