Abstracte achtergrond
Nano-hydroxyapatiet (NHA) is een potentiële ideaal biomateriaal voor botregeneratie. Echter, studies nog het gedrag van menselijke osteoblasten afgeleid van alveolaire bot op NHA karakteriseren. Derhalve was het doel van deze studie om de invloed van NHA op de hechting, proliferatie en differentiatie van deze alveolaire bot afkomstige cellen evalueren.
Methods
primaire humane alveolaire osteoblasten werden uit de alveolaire kam van een mannelijke parodontale patiënt tijdens osseuze resectieve chirurgie en gekweekt op kweekplaten bekleed met polylysine of polylysine met nano-hydroxyapatiet (POL /NHA) composiet. De cellen werden gekweekt en gedurende 14 dagen en vervolgens beoordeeld op mogelijke wijzigingen van osteoblasten homeostase zoals geëvalueerd door kwantitatieve reverse transcriptase-polymerasekettingreactie (real time RT-PCR), scanning electron microscopie en atomic force microscopie.
Resultaten
Real time PCR onthulde een significante toename in de expressie van het geselecteerde markers van osteoblast differentiatie (bot morfogenetisch eiwit (BMP) -2, -5, -7, ALP, COLL-1A2, OC, oN) in cellen gekweekt op de POL /nhà substraat. Bovendien, in vergelijking met het oppervlak POL cellen gegroeid op de POL /NHA substraat aantoonbaar beter osteoconductieve eigenschappen, zoals blijkt uit de toename van hechting en spreiding, waarschijnlijk als gevolg van de toegenomen oppervlakteruwheid van de composiet.
Conclusies
de verhoogde expressie van BMP's en osteoinductieve biomarkers suggereren dat nano-hydroxyapatiet de proliferatie en differentiatie van de lokale alveolaire osteoblasten kunnen stimuleren en daarmee botregeneratie te stimuleren op plaatsen van alveolaire bot regeneratie.
Sleutelwoorden
Nanohydroxyapatite Human osteoblasten alveolaire bot regeneratie Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-22) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is achtergrond
De belangrijkste. zorg van parodontologie is de rehabilitatie van parodontaal gecompromitteerde tanden, eventueel met het oog op de volledige parodontale weefselregeneratie [1]. Idealiter zou dit proces de vorming van nieuw bot, nieuwe periodontale ligament en nieuw cement, ofwel een nieuwe bevestiging over de wortel die eerder is ontnomen alle bevestigingsinstrument [2] omvatten. De therapeutische benaderingen een poging om dit doel te bereiken onder meer het gebruik van verschillende enten materialen (autogeen, allogene, xenogene en alloplastisch transplantaten), fysieke barrières voor Guided Tissue Regeneration (GTR), email-matrix afgeleide eiwitten en verschillende groeifactoren [3, 4 ].
aangenomen wordt dat het gebruik van bottransplantaten of alloplastisch materialen zou leiden zowel de hergroei van alveolaire bot en de vorming van een nieuwe laag cement met ingezette collageenvezels op de eerder parodontitis-betrokken worteloppervlak [5]. Het werkingsmechanisme kan ofwel via de stimulatie van osteogenese (nieuwe botvorming van de botvormende cellen in het transplantaat), osteoconductie (wanneer het implantaat dient als een matrix voor botvorming van de aangrenzende gastheerbot) of osteo-inductie ( de matrix van het bottransplantaat bevat bot-inducerende stoffen die leiden tot botvorming in het omliggende weefsel zelfs zonder botweefsel) [6]. Alloplastisch materialen worden geacht botgenezing bevorderen door osteoconductie en vervolgens gedragen als een scaffold voor deze werkwijze [5].
Een ideale steiger is een biocompatibel materiaal passende mechanische ondersteuning biedt [7]. Het moet een soortgelijke structuur als het natieve extracellulaire matrix bezitten, vertonen gunstige oppervlakte-eigenschappen en leidt tot een toename van hechting, proliferatie en differentiatie van osteoblasten [7]. Hydroxyapatiet (HA) [Ca
5 (PO 4) 3 OH] is een alloplastisch materiaal, chemisch vergelijkbaar met de anorganische component van het bot matrix dat deze eigenschappen zich vertaalt in een waardevolle en optimale biocompatibiliteit [7] . Wanneer HA is geënt onder een gezonde periosteum en goed gevasculariseerd bot, eerst het wordt geïntegreerd door een stolsel [8] en geeft vervolgens fosfaat-ionen in de omgeving, die neo-osteogenesis bevordert.
Een fundamentele factor inzake optimale integratie van HA met bot de afmetingen van de kristallen. HA deeltjes met afmetingen dichter bij de grootte van natuurlijke kristallen in gewervelde harde weefsels (dat wil zeggen van 1 tot 10 nm), zijn nu beschikbaar [9], en ze zijn gerapporteerd aan de extracellulaire matrix van bot nabootsen omvang en structuur [10]. In vitro
onderzoeken met het oog op het begrijpen van het werkingsmechanisme van deze nano-sized materiaal hebben een stimulerend effect op mesenchymale stamcellen [11], een toename van eiwitopname en osteoblast adhesie beschreven boven de traditionele micro-sized HA [12, 13], stimulatie van humane osteoblast-achtige celproliferatie resulterend in botvorming [14], en het stimuleren van PDL celhechting [15]. Desondanks is er weinig informatie over de datum responsen van humane alveolaire osteoblasten in contact met dit entmateriaal, zodra de botdefect wordt gevuld. Derhalve was het doel van ons onderzoek te evalueren in vitro of the effecten van NHA de hechting en proliferatie van humane alveolaire osteoblasten en het effect dat dit alloplastisch materiaal op de expressie van biomerkers van botvorming tijdens bepalen HA-gemedieerde parodontale botregeneratie.
methoden
Isolatie van humane primaire osteoblasten
Fresh menselijk bot verwijderd van de alveolaire kam werden verkregen met toestemming van de Ethische Commissie van de Universiteit Sapienza van Rome en geïnformeerde toestemming van de patiënt.
primaire humane alveolaire osteoblasten (kookplaten) werden geoogst van een 53-jarige man parodontale patiënt tijdens resectieve parodontale chirurgie volgens een eerder gevalideerde protocol [16, 17].
geoogste bot monsters werden opgeslagen in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO) met 100 U /ml penicilline en 100 mg /ml streptomycine tot verwerking. Voor verwerking werden botmonsters gespoeld in steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, gefragmenteerd met een scalpel, en verteerd in oplossing van 1 mg /ml Type IV collagenase en 0,25% trypsine (in PBS) bij 37 ° C 30 min onder roeren volgden twee bijkomende fasen digestie gedurende 40 min en 90 min, zoals eerder beschreven [18, 19]. Cellen verkregen uit de tweede en derde digesties werden verzameld, gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in Dulbecco's gemodificeerd Eagles Medium (DMEM, Gibco-BRL, Rockville, MD) aangevuld met 50 U /ml penicilline, 50 ug /ml streptomycine, 4 mmol /l L- glutamine en 10% foetaal runderserum (FBS, Hyclone, Thermo Scientific, Wilmington, DE). Cellen hechting, proliferatie en morfologie werden visueel geïnspecteerd door microscopie (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Tokyo, Japan) over de 2 weken tijdsbestek. Nadat de cellen confluentie bereikte 70-80%, werden ze losgemaakt met trypsine-EDTA geoogst en gebruikt voor experimenten tussen passages 2 en 4.
Poly-L-lysine en poly-L-lysine-NHA bekledingspreparaat
Eén milliliter per 25 cm 2 van 0,01% poly-L-lysine-oplossing (POL, Bioreagent, molecuulgewicht 150.000-300.000, steriel-gefiltreerd, Sigma-Aldrich) werd gebruikt voor het bekleden van de oppervlakken van petrischalen. De monsters werden voorzichtig geschud bij 4 ° C bij 1200 rpm gedurende 10 min stratificatie homogeniseren. De oppervlakken werden vervolgens gespoeld met steriel water en men liet drogen bij kamertemperatuur. Vervolgens werd 10 mg poeder NHA (Ghimas Spa, Casalecchio di Reno, BO, Italië) werd geresuspendeerd in 1 ml steriel water en gebruikt voor het bekleden van de POL-behandelde platen. Ten slotte werden gecoate oppervlakken gespoeld met steriel water en laten drogen
Osteoblasten-POL en osteoblasten-POL-NHA monsters voorbereiding
Osteoblast gedrag werd op gecoate platen met behulp van twee tests onderzocht. In Test 1, platen bekleed alleen met POL werden geënt met gasfornuis op bij een dichtheid van 2 x 10 4 cellen /cm 2; in Test 2 werden kookplaten uitgezaaid met dezelfde dichtheid op platen bekleed met POL en NHA poeder. Monsters van Test 1 en Test 2 werden gekweekt onder dezelfde experimentele omstandigheden (vochtigheid 95%, 5% CO 2, 37 ° C) in DMEM met 10% FBS. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd en herhaald drie keer per.
Scanning elektronenmicroscopie
oppervlakte-eigenschappen van de beklede platen en osteoblast morfologie visueel onderzocht door scanning elektronenmicroscopie (SEM). Na 24 uur cultuur PUL of POL-NHA beklede oppervlakken werden monsters tweemaal gespoeld met PBS, in 2,5% glutaaraldehyde gedurende 1 uur, gespoeld met gedestilleerd water, gedehydrateerd met gegradeerde concentraties van alcohol (50%, 70%, 90% , 100% ethanol) en tenslotte behandeld met CO 2 op de top-kritieke punt. Monsters werden aan aluminiumverbindingen stubs met een geleidende koolstof band en vervolgens bekleed met een 10 nm-goudlaag (coater E5000, Polaron Ltd. Watford, UK). Exemplaren werden waargenomen met SEM (Leo 1450VP, Carl Zeiss, Jena, Duitsland) bij diverse vergrotingen, het gebruik van secundaire elektronen bij 15 kV.
Atomic Force Microscopy
Atomic Force Microscopy (AFM) werd met behulp van een Nanonics Imaging AFM uitgevoerd systeem (Jeruzalem, Israël) in een geen contact modus en een referentiespanning van 0,8-1,0 V tussen de tip en het monsteroppervlak tijdens alle experimenten.
Genexpressie
Na 14 dagen kweken op en POL POL-NHA oppervlakken, RNA werd geëxtraheerd volgens het protocol eerder beschreven [18]. RNA werd omgekeerd getranscribeerd met behulp TaqMan reverse transcriptie kit (Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, CA), met behulp van willekeurige hexameren. Real time PCR werd vervolgens uitgevoerd onder toepassing van SYBR groen genexpressie assay (Applied Biosystems) op een ABI Prism 7300 Real Time PCR-systeem (Applied Biosystems), om te veranderingen in de expressie van osteogene markers: alkalische fosfatase (ALP), A2 pro-collageen type 1-keten (COLL-1A2), bot-morfogenetisch eiwit (BMP) -2, BMP-5, BMP-7, osteocalcine en osteonectine. Glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) werd toegepast als endogene controle. Sequenties werden ontworpen met behulp van Primer Express-software (Applied Biosystems) en gesynthetiseerd door Primm (Milaan, Italië). Primers worden in tabel 1 getoond Genexpressie werd geanalyseerd volgens de ΔΔCT methode, waarbij de expressieniveaus van Test 2 (POL /NHA) monsters genormaliseerd richting Test 1 (POL) values.Table 1 Menselijke primers gebruikt in RT- PCR voor glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH), alkalische fosfatase (ALP), A2 pro-collageen type 1 chain (COLL-1A2), bot morfogenetische proteïne-2, -5, -7 (BMP-2, -5, -7)
Target gen
Primer sequences
GADPH
5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3′
5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3′
ALP
5′-TGCGGAAGAACCCCAAAG-3′
5′-ATGGTGCCCGTGGTCAAT-3′
Coll-1A2
5′-CCCAGCCAAGAACTGGTATAGG-3′
5′-GGCTGCCAGCATTGATAGTTTC-3′
Osteocalcin
5′-AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT-3′
5′-GCGCCTGGGTCTCTTCACT-3′
Osteonectin
5′-CCACACGTTTCTTTGAGACC-3′
5′-GATGTCCTGCTCCTTGATGC-3′
BMP-2
FW5′-CCAGCTGTAAGAGACACCCTTTG-3′
RV5′-ACCCACAATCCAGTCATTCCA-3′
BMP-5
FW5′-CGTCCTCTGCACCTCTCTTTATG-3′
RV5′-CTCCGACTCTTCAGGATTTTCTTC-3′
BMP-7
FW5′-TCTTCCACCCACGTACCA-3′
RV5'-GCTTCCCCTTCTGGGATCTT-3 '
Statistische analyse van gegevens
Statistical Package for Social Sciences (SPPS v15.0, SPSS Inc. Chicago, IL) werd gebruikt voor statistische analyse . Analyses werden uitgevoerd met behulp van Student's t-test
. Significantie werd vastgesteld op p & lt; 0.05.
Resultaten
Human primaire osteoblasten extractie en cultuur
Osteoblasten met succes gekoppeld aan het substraat oppervlakken en werd waargenomen dat proliferatie ondergaan van dag 4 tot dag 14, zoals bepaald door visuele inspectie door microscopie (Figuur 1A-C ). Figuur 1 Human primaire osteoblasten. (A) Na 4 (B) Na 5 dagen (C) Na 14 dagen (Original vergroting, 20 ×).
POL en POL-NHA oppervlakteruwheid eigenschappen Ondernemingen De ruwheid van beide substraatoppervlakken werd geëvalueerd door SEM en AFM. De nanometrische oppervlakteruwheid geëvalueerd door AFM was 49,7 rms /nm voor POL-NHA en 6,3 rms /nm voor POL. Aldus platen bedekt POL-NHA toonde een 7,89-voudig hoger nanometrische oppervlakkige ruwheid tegenover POL platen (figuur 2A-D). Bovendien SEM waarnemingen bleek de morfologie van de deeltjes NHA een staafachtige vorm van 70-90 nm in diameter. Figuur 2 scanning microscopie. (A) Elektronenmicroscopie beeld van de polylysine (POL) substraten. (B) Atomic force microscopie van POL /nanohydroxyapatite. (C) Scanning elektronenmicroscopie. (D) Atomic force microscopie van POL /nanohydroxyapatite (POL /NHA).
Effect van nano-hydroxyapatiet op osteoblasenfunctie hechting en proliferatie
De potentiële morfologische aanpassingen aan kookplaten werden na de cellen werden uitgezet op platen bekleed met POL en POL-NHA. Na 24 uur, cellen die groeien op-POL beklede platen handhaafde een bolvorm (figuur 3A), terwijl cellen van de POL-NHA substraat bleek vast bevestigd, zoals blijkt uit de aanwezigheid van talrijke filopodia extensies (figuur 3B), suggereert dat de NHA deeltjes verbeterd osteoblasten hechting en verspreiden. Bovendien beelden verkregen door AFM bleek dat kookplaten gekweekt op POL /NHA gehecht sterker dan die van alleen POL, zoals blijkt uit de toename van nanometrische oppervlakkige ruwheid (Figuur 3C-D). Figuur 3 Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en atomic force microscopie (AFM). (A) Cellen gekweekt op POL verscheen sferische met ingeklapte vezels. (B) cellen gekweekt op POL /Nha verscheen langwerpig en met veel filopodia. (C) Cellen gekweekt op POL verscheen sferische met ingeklapte vezels. (D) Cellen gekweekt op POL /NHA verscheen langwerpig en vele filopodia.
Effecten van nano-hydroxyapatiet op genexpressie van humane osteoblasten
RNA werd geëxtraheerd uit cellen gekweekt gedurende 14 dagen op beide substraten (POL POL versus /NHA) en onderworpen aan real time RT-PCR te beoordelen van veranderingen in de expressie van specifieke osteoblastische differentiatie genen (Tabel 1): BMP-2, -5 en -7, ALP, COLL-1A2, OC en ON, welbekend differentiatiekenmerken. Zoals getoond in figuur 4, BMP-2, BMP-5 en BMP-7 verhoogd met ongeveer 1,7, 4,5 en 4,3 maal, respectievelijk kookplaten gekweekt op POL /NHA substraten vergeleken met die gekweekt op POL alleen (p & lt; 0,05). Interessant COLL-1A2, OC en ON expressie was 1,6, 1,9 en 2,1 maal hoger, respectievelijk kookplaten gekweekt op POL /NHA vergeleken met die gekweekt op POL (p & lt; 0,01). ALP was ook 2,5 maal verhoogd kookplaten gekweekt op POL /NHA (p & lt; 0,01), hetgeen wijst op een toename van differentiatie van deze cellen onder het huidige kweekomstandigheden. Figuur 4 genexpressie van kookplaten geplaatst in cultuur in POL en POL /NHA.
Kortom, onze resultaten laten zien dat, binnen een 14-dagen termijn, kan POL /NHA substraat de expressie van specifieke osteoblastenactiviteit genen, die sterk wijst op een positief effect van Nha op osteoblast differentiatie (figuur 4) te verbeteren.
discussie
hydroxyapatiet tussen de verschillende bot enten substituten, is op grote schaal onderzocht in parodontale regeneratie van de afgelopen drie decennia [4, 20]. HA alloplastisch grafts, ondanks hun vergelijkbare chemische samenstelling bot, zijn vooral bekend vanwege hun osteoconductieve eigenschappen [5]. Ons onderzoek heeft osteoconductieve eigenschappen van nano een grotere versie van dit materiaal bevestigde, waaruit blijkt dat NHA osteoblasten geselecteerde biomarkers representatief botvorming en mesenchymale celrecrutering produceren kunnen stimuleren. Ondernemingen De reden voor de keuze van humane alveolaire osteoblasten berust het feit dat deze cellen zich op het botoppervlak van het defect, waardoor de geënte materiaal in direct contact met deze osteoblasten tijdens de genezing. De celinzameling werkwijze werd uitgevoerd met een bot scalpel als onderdeel van een goed gedocumenteerde techniek tijdens resectieve parodontale chirurgie [21, 22]. Celcultuur en de vorming van de substraten werden uitgevoerd gevolgd modellen eerder gebruikte (dispersie van deeltjes van Nha in poli-ethyleen-glicol-dimethacrylaat of NHA geassocieerd met een polycarbonaat, polyamide, polysaccharide) [23-27]. Humane alveolaire osteoblasten zijn de primaire cellen die verantwoordelijk zijn voor alveolaire botvorming, hoewel zij niet kunnen migreren en prolifereren op afgelegen locaties waar botherstel vereist. Albrektsson & amp; Johansson gesuggereerd dat vooraf bestaande osteoblastische cellen slechts een klein gedeelte van het nieuwe bot nodig is in een fractuurgenezing situatie en de rekrutering van onrijpe cellen en hun differentiatie tot osteoblasten dragen zijn waarschijnlijk de basis en zwenkmechanisme regelen botgenezing [6]. Inderdaad, osteoblasten aangetoond bijdragen aan de productie van groeifactoren die cellulaire migratie alsmede de osteogene en chondrogene differentiatie van mesenchymale progenitorcellen [28] stimuleren. Onze studie toont aan dat NHA stimuleert de lokale alveolaire osteoblasten relevante botspecifieke BMP's, waarvan bekend is dat initiëren en regelen botvorming vanaf de voorlopercellen cellen.
Verschillende soorten BMP's die behoren tot de transformerende groeifactor (TGF ) -β familie, zijn onderzocht en gekarakteriseerd op modulerende rol in botweefsel homeostase. BMP-2 en BMP-7 zijn van bijzonder belang, aangezien ze van nature zijn afgegeven in reactie op trauma of bij botombouw en zijn tot op heden de enige bekende inductieve middelen [6]. Stimulatie van BMP-2, -5 en -7 is een belangrijk aspect van osteogenese, aangezien deze eiwitten zijn drie van de meest potente groeifactoren verbeteren botvorming. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat Nha bevordert BMP expressie door alveolaire osteoblasten in vitro
. Deze waarneming suggereert dat NHA kan optreden als promotor van botregeneratie het botdefect op twee manieren: door het induceren osteogene differentiatie geobserveerd door Lock et al. [11] en /of door het induceren van de afscheiding van bepaalde factoren, zoals BMP's of andere groeifactoren niet getest in dit experiment. Bovendien is de NHA beïnvloedde een significante toename in de expressie van een aantal belangrijke markers van osteogenese ALP, OC, ON en COLL-1A2. Belgique Om de botvorming aanzetten, moeten cellen hechten en prolifereren. Oppervlakteruwheid is een belangrijke overweging bij de keuze van een bot-inducerende substraat. Volgens fysische en mechanische principes, een substraat met oppervlakkige ruwheid toont een hogere capaciteit voor adhesie vergeleken met een glad oppervlak [29-32]. In deze studie werd osteoblasten hechting geëvalueerd op basis van veranderingen in de cel vorm en op de aanwezigheid van filopodia. SEM en AFM afbeeldingen toonden dat NHA had een ruwer oppervlak dan de controle substraat en het voordeel van de hechting en proliferatie van menselijke osteoblasten. Deze resultaten zijn in overeenstemming met die van Thian et al., Blijkt dat NHA verbeterde hechting en verspreiding van humane osteoblast-achtige cellen [33] en Liu et al., Tonen de inductie van hechting en proliferatie van humane osteoblast-achtige MG 63 cellen op Nha [14].
Conclusies
Binnen de grenzen van deze studie hebben we geconstateerd dat Nha aanzienlijk kunnen vergroten op het terrein menselijke alveolaire osteoblasten hechting en differentiatie, en daarom speculeren dat Nha botvorming door lokale osteoblasten kunnen stimuleren op plaatsen van alveolaire bot wederopbouw. Bovendien kan de verhoogde expressie van BMP Nha oppervlak een toename van de rekrutering van progenitorcellen tijdens genezing met NHA steigers geven. Deze in vitro
bevindingen kunnen verklaren, althans ten dele, de nieuwe botvorming gezien in botdefecten vol NHA entmateriaal [34, 35] en stelt de verdere rol van NHA in periodontale herbevestiging processen, waaronder de vorming van nieuwe cement en nieuwe parodontale ligament. Verdere histologische en klinische studies zijn nodig om betekenis voor de in vitro
resultaten en een biologische verklaring van de klinische resultaten waargenomen door anderen.
Verklaringen
Auteurstheater originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
hieronder zijn de links naar de oorspronkelijke ingediende dossiers van de auteurs voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12903_2013_367_MOESM2_ESM.tiff Authors' 12903_2013_367_MOESM1_ESM.tiff Auteurs originele bestand voor figuur 2 12903_2013_367_MOESM3_ESM.tiff 'originele bestand voor figuur 3 12903_2013_367_MOESM4_ESM.tiff Authors' Auteurs oorspronkelijke bestand voor originele bestand figuur 4 12903_2013_367_MOESM5_ESM.png Authors 'voor figuur 5 tegenstrijdige belangen Ondernemingen de auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.
auteurs bijdragen
AP en SM waren de belangrijkste onderzoekers van deze studie. Ze maakten een aanzienlijke bijdrage aan de conceptie en het ontwerp, evenals de verwerving, analyse en interpretatie van gegevens; GP, MS, GDC en BZ waren betrokken bij het opstellen van het manuscript of te herzien kritisch voor belangrijke intellectuele inhoud, en gaf definitieve goedkeuring van de versie worden gepubliceerd. LR, MB en FW aanzienlijke bijdragen in de verwerving van data en nam deel aan het opstellen van het manuscript en hielp bij de herziening van het manuscript. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
