?
Abstracte achtergrond
Er is verwarring over de definitie van de term "levensvatbaarheid toestand (en)" van microorganismen. "Levensvatbaarheid kleuring" of "leefbaarheidskleuring technieken" worden voor levende onderscheiden van dode bacteriën. Deze kleuringen, voor het eerst vastgesteld op planktonische bacteriën, kunnen ernstige tekortkomingen wanneer toegepast op multispecies biofilms. De resultaten van kleuring technieken moeten worden vergeleken met de nodige microbiologische gegevens.
Discussie
Veel termen te beschrijven "vitaliteit states" van micro-organismen, maar een aantal van hen zijn misleidend. Auteurs definiëren "levensvatbaar" als "in staat is om te groeien". Dienovereenkomstig, kleuringen zijn vervangers, aangezien er geen vlekken levensvatbaarheid kan bewijzen Ondernemingen De betrouwbaarheid van een commerciële "levensvatbaarheid" kleuring assay (Molecular Probes) wordt besproken op basis van het desbetreffende product informatieblad. (I) kleuring principe; (II) Concentraties van bacteriën;.
(III) Berekening van levende /dode verhoudingen vitro
Resultaten van de "levensvatbaar" kit door de concentratie van de vlekken en hun verhouding tot het aantal bacteriën in de proef. Algemeen deze vlekken systeem is niet geschikt voor multispecies biofilms, waardoor onjuiste verklaringen zijn van gebruikers van deze techniek is gepubliceerd. Belgique Om de resultaten van de kleuring te vergelijken met bacteriële parameters geschikte technieken worden geselecteerd. De beoordeling van kolonievormende eenheden onvoldoende eerder het berekenen van Plating efficiëntie nodig. Vital fluorescentie kleuring met fluoresceïnediacetaat en ethidiumbromide lijkt de beste beproefde en geschikte methode in biofilm onderzoek.
Met betrekking tot de mutageniteit van kleuring componenten gebruikers moeten zich ervan bewust dat niet alleen ethidiumbromide schadelijk zou kunnen zijn, maar ook een verscheidenheid aan andere stoffen waarvan de toxiciteit en mutageniteit wordt niet gemeld
Samenvatting
-. de nomenclatuur met betrekking tot 'leefbaarheid' en 'vitaliteit' moet zorgvuldig worden gebruikt
-. de handleiding van de commerciële "levensvatbaarheid" kit zelf opmerkt dat de kit niet geschikt voor natuurlijke multispecies biofilm onderzoek, zoals ondersteund door een reeks literatuur Catawiki -. resultaten verkregen met verschillende vlekken worden beïnvloed door de verhouding tussen de bacteriële tellingen en de hoeveelheid vlek in de test. Overeenkomstige vitaliteit gegevens gevoelig voor kunstmatige verschuiven Catawiki -. Microbiologische parameter de Plating efficiëntie worden gebruikt ter vergelijking Catawiki -. Ethidiumbromide mutageen. Onderzoekers moeten zich ervan bewust dat er alternatieve vlekken verbindingen ook kunnen zijn, of zelfs mutageen.
Sleutelwoorden
Tandplak Biofilm Micro-organismen levensvatbaarheid staat Vital fluorescentie Bacteriële levensvatbaarheid kit Mutageniteit Achtergrond
De definitie van de zogenaamde "levensvatbaarheid staat ( s) "van micro-organismen is een kwestie van verwarring en discussie al tientallen jaren (voor een glimp van de overvloed aan literatuur zie [1-5]). Onlangs zijn twee manuscripten besproken dit onderwerp. Hannig et al. [6] onderzochten de invloed van een nieuwe mondspoeling met hydroxyapatiet microclusters op bacteriële hechting met de BacLight ™ levende /dode stainstechniek. Tawakoli et al. [7] vergeleken verschillende levende /dode kleuringen "voor detectie en kwantificering van hechtende micro-organismen"
in de orale biofilm. In lijn met eerdere literatuur aan te tonen deze twee artikelen die serieuze pogingen zijn gedaan in de afgelopen decennia aan de verschillende toestanden tussen dode (marine en mondeling) micro-organismen te definiëren en te leven, en dat "de levensvatbaarheid vlekken" of "vitale kleuring technieken" zijn geweest en worden nog steeds gebruikt als een proef om het probleem van onderscheid tussen levende en dode micro-organismen in biofilms overwinnen.
laatste jaren steeds meer wetenschappers tandheelkundige biofilm onderzoek bekend met commercieel verkrijgbare vitaliteit /haalbaarheid vlekken, vooral de BacLight Assay (geworden BLA; BacLight ™ leven /dood kleuring techniek). Echter, deze vlekken principe heeft ernstige tekortkomingen wanneer toegepast op undefined natuurlijke multispecies biofilm monsters. Resultaten van deze en andere technieken kleuring moet worden vergeleken met klassieke microbiologische technieken zoals de beoordeling van kolonievormende eenheden (CFU) en, betrouwbaarder, de berekening van bacteriële plating efficiëntie (PE). Deze vergelijkingen met een "gouden standaard" zijn zeldzaam bij commerciële kits worden gebruikt in biofilm onderzoek. Bovendien kunnen onderdelen van deze vitale vlekken potentieel mutageen zijn.
Kortom, het doel van dit manuscript is de basis, het nut en het risico van "levensvatbare" en "essentiële" vlekken name biofilm onderzoek bespreken, met speciale aandacht natuurlijke tandheelkundige biofilms en vitale fluorescentie kleuring met fluoresceïnediacetaat /ethidiumbromide [8]. Vanuit wetenschappelijk oogpunt is het van belang dat de gegevens afkomstig van dergelijke vlekken technieken de bacteriële toestand correct moeten weergeven.
Discussie
Wat is de wortel van het probleem?
Vanuit een holistische visie van het debat heeft betrekking op verschillende niveaus. Ten eerste, de discriminatie van de dood of levend micro-organismen vormt een cruciaal probleem in (milieu) bacteriologie. Deze fundamentele probleem bestaat al jaren en is nog niet opgelost. In dit verband zijn de termen "vitaliteit" en "levensvatbaar" vaak gebruikt en vaak gemengd - sommige onderzoekers deze voorwaarden volledig uitwisselbaar [9] Tweede, "essentieel vlekken" zijn algemeen slechts surrogaten, maar zijn snel en eenvoudig. inrichtingen in studies die bijvoorbeeld de antibacteriële werking van stoffen. Hier is het probleem de grote verscheidenheid aan kleuren stoffen en dus kleuring principes, zodat de "overvloed aan keuzes voegt verwarring"
[10]. Evenzo
Pamp et al. [11] staat: "Recenter ontwikkelde vlekken, zoals Syto vlekken .... kan efficiënt cellen vlek in vrijwel alle kleuren van de regenboog "
Dat klinkt misschien humoristische -. maar alleen weerspiegelt het probleem. Zoals zojuist genoemde Tawakoli et al. [7] combinaties van verschillende vlekken (bijvoorbeeld FDA, CFDA, TCFDA, EB, en SYTO 9 /PI, Sytox rood naast calceïne AM). Davey [10] verwijst ook naar de FDA, PI en SYTO 9, maar bovendien op stoffen zoals SYTO groen I, DiBac4, pyronine Y, rhodamine 123 en thiazool oranje. Het is geen wonder dat deze auteur [10] verwijst naar een andere vier reviews alleen te informeren over de 'modus operandi' Website van verschillende fluorescerende vlekken en de "enorme diversiteit aan mogelijkheden op het gebied van selectie vlek, concentratie, kleuring tijd, etc ".
Bij nadere analyse van het probleem nog complexer. Sommige auteurs kritiek beperkt gebruik van propidiumjodide (PI) als cellevensvatbaarheid (sic!)
Indicator [12, 13], terwijl andere gemonitord opvallende verschillen tussen SYTO 9 en SYTO 12 over de invloed van porinen op opnamekinetiek van deze kleurstoffen [14]. Dit betekent dat wanneer antibacteriële stoffen verstoren het celmembraan integriteit onderzocht het gebruik van deze technieken leefbaarheidskleuring misleidend kan zijn. Inherent van dit probleem, namelijk de geschiktheid van kleuringen, is de afhankelijkheid van de concentratie van de resultaten van de vlekken (zie later).
Derde, de gebruikers grotendeels nog niet dat dergelijke "verleidelijk" proeven slechts gevalideerd voor een zeer beperkt aantal bacteriesoorten [13, 15]. Van 15 000 "hits" (250) in PubMed gegenereerd door te vragen voor "stromingscytometrie & amp; bacteriën ", maar drie bleven na filtratie van de gegevensbank bij gebruik" biofilm "als extra tracing termijn. Geen van deze drie artikelen draagt bij aan het debat.
Het is cruciaal dat 'vitale vlekken "en, veel belangrijker, hun combinaties worden direct vergeleken met conventionele bacteriologische gegevens. Zoals verderop in detail dit niet de beoordeling van CFU kan zijn, maar PE. In de tandheelkunde sommige bijbehorende werk is voltooid met behulp van enkele of een lucide aantal soorten in vitro
zonder het uitvoeren van bacteriologisch onderzoek [6, 16-18], terwijl sommige bedrijven gebruik gemaakt van deze kleuring vertrouwen per se
in de betrouwbaarheid [ ,,,0],19, 20]. Wanneer de SYTO 9 /PI combinatie in feite was gerelateerd aan overeenkomstige microbiologische evaluaties het resultaat was inconsistent [21-23]. Naar onze mening is het onmogelijk om uit te vinden studies waarin specifieke voorbeelden van deze vitale vlekken en de combinaties goed waren vergeleken en gerelateerd aan microbiologische gegevens over de natuurlijke multispecies biofilms als tandplak.
Slotte, de kleurstoffen zijn of giftig zijn of mutagene . Met betrekking tot de lijst van verbindingen, zoals eerder vermeld en overgenomen uit [7] en [10], moet worden nagegaan of er sprake is van een schade of risico's bij het gebruik van deze stoffen.
Levensvatbaarheid versus Vitality
Netuschil [8] opgenomen 49 termen "vitaliteit states" van micro-organismen te beschrijven (bijvoorbeeld: actieve microben, cryptisch groei, directe levensvatbare telling [DVC], progressieve slaaptoestand, vegetatieve slaaptoestand, dwerg cellen, stervende cellen, nonculturability, nonplateable, stasis overleving, reproductieve levensvatbaarheid levensvatbare maar niet kweekbare [VBNC], niet-levensvatbare maar resuscitable, vitale viviform, etc.) zoals geciteerd in 34 verschillende overeenkomstige publicaties [1, 2, 4, 24-54] (zie Tabel 1). Terwijl de tabel toont referenties uit 1962 tot 1998, het debat is ouder en was al betrokken bij het wisselen van de 19
e tot de 20 e eeuw [55-60]. Een voorbeeld hiervan is de "Grote kiemgetal Anomaly" [61, 62] zie ook [63]. Zelfs toen vitale kleuringen zijn besproken wordt gebruikt als proef om de tekortkomingen van kweektechnieken [64-68] overwinnen. Het lijkt erop dat het verleden discussie [69] werd "nieuw leven ingeblazen" aan het begin van deze eeuw [41, 70-78]. Van de nota is dat sommige termen (bv, slapende, VBNC) zijn ook van belang bij de verwijzing naar probiotische bacteriën [79, 80] .table 1 Algemene gebruikt om "vitaliteit states" van micro-organismen te beschrijven (uit [8])
Acclimatisering [ ,,,0],30]
"latente cellen" [17]
Active microben [20]
Reanimatie [3, 4, 15, 24, 28-31]
Alive, "levendigheid" [15]
"shut down cellen", "shut down state" [17]
"Anabiotic (slapende) state "[15]
Somnicells [8, 11, 30]
" Tassen van enzymen "[4, 12]
Honger [10, 17, 29]
Cryptic groei [24, 26, 27, 29]
- "True honger" [15]
gekweekt, kweekbaarheid [4 , 10, 11, 31]
"Substrate versnelde dood", "substraat
- Nonculturable, nonculturability [22, 24]
versnelde spanning" [6 , 15, 26, 29, 31, 33]
verzwakking [9]
Survival [5, 11, 20, 22, 29]
dood, dood [3, 4, 9, 11, 15, 16, 20, 26], [29]
- "Overlevingsvermogen" [3]
- "Death fase "[15, 29]
-" Stasis overleven "[25]
" Die-off "[31]
Levensvatbare [3, 10, 15, 16, 18, 30, 31]
Direct levensvatbare count (DVC), DVC methode [3, 4, 10, 15, 18, 29-31, 34]
- Non levensvatbare [3, 15, 16, 20]
levensvatbaarheid [3, 4, 6, 9, 12, 13, 15, 16], [19, 22, 23, 26, 29]
Slapende, slaaptoestand [11, 12, 15, 20, 23, 28-30, 32]
- "Schijnbaar levensvatbaarheid" [6, 15]
- "Progressive kiemrust" [1, 30]
- "Reproductieve levensvatbaarheid" [23]
- "vegetatieve kiemrust" [15]
Catawiki - "True levensvatbaarheid" [6]
Dwarf cellen, inactief dwergen, ultramicrobacteria [6, 14, 15, 29, 32]
"Leefbare maar nonculturable" ( VBNC) [3, 4, 8, 10, 12, 15, 16, 21], [22]
groeistop [25]
- VBNC hypothese [2-4 , 7]
"Killer fenotype" [15]
- VBNC staat [3, 4, 10, 22, 24, 29, 31, 33], [34]
Lysis [20]
- "Leefbare maar nonrecoverable" [31]
Stervende cellen [29]
- "Non -viable maar resuscitable "[16]
'Nonplateable" [24]
- "cultiveerbare maar haalbare" [28]
Protistan grazen [ ,,,0],11]
Vital, vitaliteit [15, 16, 26]
"Pseudosenescent" [29]
Viviform [11, 30]
Referenties:
1Barcina et al. 1989 [24]
18Kogure et al. 1979 [40]
2Barer et al. 1993 [25]
19Korber et al. 1996 [41]
3Bogosian et al. 1996 [26]
20Mason et al. 1986 [1]
4Bogosian et al. 1998 [27]
21McKay 1992 [42]
5Bowden & amp; Hamilton 1998 [28]
22 Morgan et al. 1993 [43]
6Button et al. 1993 [29]
23Nebe-von Caron et al. 1998 [44]
7Colwell 1993 [30]
24 Nilsson et al. 1991 [45]
8 Colwell et al. 1985 [31]
25Nyström 1995 [46]
9 Dawe & amp; Penrose 1978 [32]
26 Postgate 1977 [47]
10 Duncan et al. 1994 [33]
27 Postgate & amp; Hunter 1962 [48]
11 Gonzáles et al. 1992 [34]
28 Rose et al. 1990 [49]
12Gribbon & amp; Barer 1995 [35]
29Roszak & amp; Colwell 1987a [2]
13Höfle 1983 [36]
30 Roszak & amp; Colwell 1987b [50]
14 Hood et al. 1987 [37]
31 Roszak et al. 1984 [51]
15Kaprelyants et al. 1993 [4]
32Stevenson 1978 [52]
16Kell et al. 1991 [38]
33 Whitesides & amp; Oliver 1997 [53]
17Koch 1996 [39]
34 Wilson & amp; Lindow 1992 [54]
Helaas, een aantal van de termen gevonden en gebruikt in publicaties zijn onjuist, misleidend of zelfs paradoxaal, in het bijzonder de vaak gebruikte term "levensvatbare maar niet kweekbare (VBNC)", die vervaagt de lijn tussen vitaliteit en leefbaarheid. Om verwarring te minimaliseren zoveel mogelijk verwezen naar Kaprelyants et al. [4]: "Verschillende classificaties van de fysiologische toestanden van micro-organismen zijn gepresenteerd. We hebben eerder gesuggereerd
[3] dat alle celtypes geacht kan worden verminderd tot drie groepen, als volgt: "levensvatbaar" te verwijzen naar een cel die een kolonie op een agar plaat kan vormen, 'onmisbare te verwijzen naar een die slechts kan doen na reanimatie en "niet-levensvatbaar" verwijst naar een cel die daartoe niet onder alle getest geleverd. Volgens deze terminologie, slapende cellen zijn van vitaal belang "
(zie tabel 2) .table 2" Verklarende woordenlijst van termen die worden gebruikt om de 3 belangrijkste fysiologische toestanden hierin gedefinieerd te beschrijven "(geciteerd uit [3])
fysiologische toestand
fenotype
Levensvatbare
Capable van verdeeldheid; zal een kolonie vormen op een agarplaat.
Vital of slapend
Kan verdelen of om een kolonie op een agarplaat te vormen zonder voorafgaande reanimatie fase .
Niet-levensvatbaar
Niet in staat van verdeeldheid; zal een kolonie op een agarplaat vormen geen onder geen enkele voorwaarde getest.
Wij gebruiken de termen 'honger' of 'honger cellen te verwijzen naar de omstandigheden waaronder de cellen worden geïncubeerd, in plaats van een fysiologische toestand. Zo uitgehongerde cellen (of cellen die andere belastingen hebben geleden) al dan niet slapend zijn. Ondanks de historische gebruik van deze voorwaarden, de uitdrukkingen 'direct levensvatbaar count' en 'levensvatbare-maar-niet-kweekbare' zijn misnomers, omdat dergelijke cellen zijn niet levensvatbaar is als hierboven omschreven.
In overeenstemming met [4] we definiëren "levensvatbaar" strikt "in staat is om te groeien". In dit opzicht geen andere tests, bijvoorbeeld rek testen (DVC; [50]) of vlekken methoden, zijn slechts proxies, omdat geen enkele vorm van vlekken levensvatbaarheid kan bewijzen. Zo is de term "levensvatbaarheid vlek" is een verkeerde benaming per definitionem Kopen en deze vlekken moeten correct worden genoemd 'vitale vlekken ". Helaas is de verkeerde benaming vaak gebruikt door Invitrogen Ltd. (BacLight ™), en is dus - maar ten onrechte - door de gebruikers van deze vitaliteit testen goedgekeurd Ondernemingen De BacLight ™ bacteriële levensvatbaarheid kit (BacLight Assay, BLA)
. volgens de fabrikant [81] BLA bestaat uit twee vlekken, propidiumjodide (PI) en SYTO 9, die beide vlek nucleïnezuren. SYTO9 is een groen fluorescerende intercalerende permeabel membraan molecuul en vlekken alle cellen. Daarentegen PI is een rode intercalerende kleurstof en is het membraan ondoorlatend en wordt derhalve "gezonde" cellen uitgesloten. De fabrikant beschrijft dat PI een sterkere affiniteit voor nucleïnezuren dan SYTO 9; Wanneer aldus beide vlekken aanwezig zijn in een cel, SYTO 9 wordt verplaatst van nucleïnezuren en de cel (len) fluoresceren rood. Om te bewijzen dat het mechanisme Stocks [82] uitgevoerd "cell-free" fysisch-chemische metingen met de "levensvatbaarheid Stain, Bac
Licht", en kon zien dat de vlekken principe is niet zo eenvoudig. Deze auteur werd een zogenaamde fluorescentie-energieoverdracht (FRET), hoewel onder bepaalde omstandigheden kleuring, SYTO 9 emissie overtreft de PI emissie. Verhogen van de concentratie SYTO 9 kunnen zo het PI emissie, waardoor een dubbele kleuring van cellen. Voorraden [82] benadrukt meerdere malen dat voor een interpretatie van de kleuring uitkomst "van de relatieve concentraties van PI, SYTO9 en DNA waren van cruciaal belang" Kopen en "dat een passende controle of validatie experimenten (zou moeten zijn) uitgevoerd".
Dubbele kleuring en /of FRET werd ook gedocumenteerd door andere auteurs [41, 83], die de levensvatbaarheid parameters van levensvatbare en formaldehyde gedood of UVA-behandelde kweken respectievelijk onderzocht. De volgende bespreking van de Molecular Probes handboek moet worden gezien in deze context
Met betrekking tot de betrouwbaarheid van de "levensvatbaarheid kit" gebruikt in biofilm onderzoek willen we het product informatieblad (s) van Molecular Probes 2001 rechtstreeks citeren.; Productinformatie Live /DEAD ® BacLight ™ Bacterial Levensvatbaarheid Kit, Herzien: 26 januari 2001, alsmede Herzien: 15-juli-2004 (waarbij de laatste staat voor de meest actuele versie in oktober 2013) [81] :( I) "... vlekken alleen verschillen in hun spectrale eigenschappen en hun vermogen om gezonde bacteriële cellen penetreren. Wanneer alleen wordt gebruikt, de SYTO 9 vlek labels in het algemeen alle bacteriën in een populatie - die met intacte membranen en mensen met beschadigde membranen. In tegenstelling dringt propidiumjodide alleen bacteriën met beschadigde membranen, waardoor een verlaging van de SYTO 9 vlek wanneer beide kleurstoffen aanwezig zijn. Dus, met een passende mix van de SYTO 9 en propidiumjodide vlekken, bacteriën met intacte celmembranen vlek fluorescerend groen, terwijl bacteriën met beschadigde membranen vlek fluorescerend rood. "
(II)" Kleuring met Bacteriën ofwel Kit L7007 of L7012 - 4.1 Pas de E. coli schorsingen (live en gedode) tot 1 × 10
