Abstracte achtergrond
Preklinische studies ondersteunen de aanname dat bindweefsel enten het behoud van de alveolaire bot uit botresorptie; de onderliggende cellulaire mechanismen blijven echter onbekend. De cellulaire mechanismen kunnen worden toegeschreven aan de paracriene werking van de palatale fibroblasten. Het is dus redelijk om te suggereren dat palatinale bindweefsel grafts verminderen de vorming van osteoclasten.
Werkwijzen Belgique Om deze hypothese te testen humane palatinale fibroblasten werden onderzocht op hun vermogen om de vorming van osteoclasten in muriene beenmerg culturen blootgesteld moduleren RANKL, M-CSF en TGF-β1. Osteoclastogenesis werd bepaald door tartraat-resistent zuur fosfatase (TRAP) kleuring en genexpressie analyse. De vorming van antigen presenterende cellen gebaseerd op de expressie van CD14 en costimmulatory moleculen antigeen presenterende cellen. De paracriene interactie van fibroblasten en het beenmerg werd gemodelleerd in vitro met inserts van cel-occlusieve membranen.
Resultaten
In hulpkweken zonder cel-cel contact, palatale fibroblasten veroorzaakte een afname in de expressie van de marker osteoclast genen in beenmergcellen; calcitonine receptoren, cathepsine K, TRAP en osteoclast-geassocieerde receptor. Ook het aantal TRAP-positieve meerkernige cellen werd verminderd bij aanwezigheid van fibroblasten. Met name palatinale fibroblasten verhoogde de expressie van CD14 en co-stimulatoire eiwitten CD40, CD80 en CD86 in beenmergcellen. Beenmergcellen had geen aanzienlijke invloed op fibroblast levensvatbaarheid en proliferatie merkergenen. Wat celverdeling, osteoclasten waren het meest prominent in het midden van de membranen, terwijl fibroblasten direct naast de rand van het inzetstuk vormen van een ringachtige structuur op het oppervlak van de kweekplaat geaccumuleerd.
Conclusie Ondernemingen De gegevens suggereren dat palatale fibroblasten te paracriene omgeving die osteoclastogenese en verhoogt markers van antigeenpresenterende cellen vermindert. Morover, de paracriene model bleek een gezamenlijke activiteit tussen palatinale fibroblasten en beenmergcellen gevisualiseerd door de karakteristieke verdeling cel in de twee gescheiden compartimenten.
Sleutelwoorden
Palatal fibroblasten Osteoclast macrofagen Co-cultuur Voegt muizen beenmerg culturen Achtergrond
Palatal bindweefsel enten worden gebruikt in parodontologie voor root dekking en de behandeling van tandvlees recessie gebreken [1]. Palatinale bindweefsel enten zijn ook voorgesteld om esthetische parameters verbeteren wanneer buccale bot dun of geresorbeerd in implantologie en prothesen [2-6]. Afhankelijk van de gebruikte techniek kunnen palatinale bindweefsel grafts in direct contact met alveolaire bot worden geplaatst. Rijst de vraag over de mogelijke gevolgen van de palatinale bindweefsel enten op het alveolaire bot. Er is minstens zwak steun voor een mogelijke rol van bindweefsel grafts het behoud van het onderliggende bot. Bindweefseltransplantatie geplaatst aan de buccale zijde van de benige wand, onmiddellijk na tandextractie, leverde een redelijk behoud van de harde weefsels [7]. Bovendien kan het tandvlees bindweefsel enten de resorptie van de marginale crest in honden modellen [8] te verminderen. Bij elkaar genomen, zowel preklinische studies ondersteunen de aanname dat bindweefsel enten het alveolaire bot kan behouden; de onderliggende cellulaire mechanisme blijft echter onbekend. Ondernemingen De cellulaire mechanisme kan worden toegeschreven aan de paracriene werking van de palatale fibroblasten. Deze aanname wordt ondersteund door in vitro experimenten met geïsoleerde gingiva fibroblasten en hun vermogen om osteoclastogenese, de vorming van botresorberende cellen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, geconditioneerd medium verkregen van gingiva fibroblasten en parodontale ligament fibroblasten remt de vorming van osteoclast-achtige cellen in de muis beenmerg culturen [9-11]. Het is dus waarschijnlijk dat paracriene factoren vrijgemaakt uit palatinale fibroblasten het proces van osteoclastogenese te verminderen. Intrigerend is om het moleculaire mechanisme hoe het paracriene factoren vrijgemaakt uit palatinale fibroblasten de expressie van genen die osteoclasten veranderen verstaan, maar ook de antigeen presenterende cellen, beide afkomstig FOM hematopoëtische precursorcellen.
Osteoclastogenesis in muriene beenmerg culturen vereist de aanwezigheid van de receptor activator van de nucleaire factor kappa-B ligand (RANKL), M-CSF, en de respectievelijke receptoren [12]. Osteoclasten typisch meerkernige en express tartraat-resistent zuur fosfatase (TRAP), cathepsine k (CatK) en de calcitonine receptor (CTR). Osteoclasten ook een co-stimulerende moleculen activeren immunoreceptor tyrosine-gebaseerd activatie motief (ITAM) -afhankelijke route [13]. Osteoclast geassocieerde receptor (OSCAR) en triggering receptor expressie in myeloïde cellen (TREM2) zijn receptoren die zijn gekoppeld aan de betreffende adapter moleculen Fc receptor gemeenschappelijke gamma-keten (FcRy) en DNAX-activerend eiwit 12 kDa (DAP12) respectievelijk [13] . Wanneer de differentiatie verschuift naar een macrofaag fenotype, de expressie van CD14, een co-receptor voor lipopolysaccharide signalering, en de co-stimulatoire eiwitten CD40, CD80 en CD86, gewoonlijk uitgedrukt in antigenpresenterende cellen zoals monocyten en macrofagen, stijgen [14, 15].
Doel van onderhavige pilootstudie was het effect van de paracriene milieu van palatale fibroblasten op osteoclasten uit beenmerg precursors met behulp van een in vitro model waarbij zowel celbronnen worden gescheiden door cellen occlusieve membranen te onderzoeken.
Methods
Human palatale fibroblast
Menselijke palatale fibroblasten werden bereid uit explantkweken van drie onafhankelijke donoren na goedkeuring van de ethische commissie van de Medische Universiteit van Wenen (EK Nr. 631/2007). Fibroblasten die uit groeide van de explantaten en niet hadden ondergaan meer dan vijf passages werden gebruikt. Fibroblasten werden gekweekt in Dubeccos Modified Eagle Medium (DMEM) met antibiotica (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)) en uitgeplaat bij 100.000 cellen /cm
2 in de respectievelijke 12-wells platen (Greiner Bio-One GmbH) . Na de kweekperiode, kleuring van de fibroblast werd uitgevoerd met DiffQuik (Roche Diagnostic Systems, Bazel, Zwitserland).
Murine beenmergkweken
Beenmergcellen werden bereid door spoelen femur en scheenbenen van 4-8 weken oud vrouwelijk Balb /c muizen (BE76 /12 Veterinärdienst des Kantons Bern) en gezaaid in ThinCert ™ celkweek inserts (12 putjes met een nominale poriëngrootte van 0,4, um, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Duitsland) op één miljoen cellen per cm 2 in Eagle's Minimum Essential Medium-Alpha Modification (aMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), antibiotica, M-CSF bij 25 ug /ml, TGF-β1 bij 10 ug /ml en RANKL op 25 ug /ml. Beenmergkweken werden vervolgens overgebracht naar platen die de fibroblasten bevatten. Recombinante eiwitten werden gekocht van Prospec (Ness-Ziona, Israël). Beenmergcellen werden gekweekt met en zonder de fibroblast. Beide celtypen gescheiden blijven door de cel occlusieve membraan van de ThinCert ™ celkweek inserts. Kleuring voor TRAP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) werd uitgevoerd op dag vijf. De cellen werden beschouwd osteoclasten als positief voor TRAP en met drie of meer kernen zoals waargenomen door lichtmicroscoop.
Expressie van markergenen in muizen beenmerg culturen
RNA werd geïsoleerd uit het beenmerg culturen en de palatale fibroblasten met behulp van de High pure RNA Isolation Kit (Roche Applied Science, Rotkreuz, Zwitserland). Reverse transcriptie (RT) uitgevoerd met Transcriptor Universal cDNA Master en PCR-analyses werden in triplo middels TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) of FastStart Universal Probe Master Rox op 7500 Real-Time PCR System ( Roche). Beenmergcellen werden geanalyseerd op de volgende genen: SYBRGreen: RANK, C-FMS, TRAF6, C-FOS, MITF, PU1, NFATC-1, DC-STAMP, ATP6V0D2, CD14, CD40, CD80, CD86, CD 11 c; TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA): CTR, CATK, TRAP, OSCAR, TREM2, DAP12, FcRy. Fibroblasten werden geanalyseerd op de volgende genen: BCL2, Plk1, CCNB1, CCNE1, CCND1, MYBL2, GAPDH, BAD, BAX, en BCL-XL. De gegevens werden genormaliseerd voor β-actine met behulp van de ΔΔCt methode (tabel 1 en 2) .table 1 SYBRGreen Primers voor RT-PCR
Gene
Forward primer
Reverse primer
m 18 s
tccagcacattttgcgagta
cagtgatggcgaaggctatt
m βactin
ctaaggccaaccgtgaaaag
accagaggcatacagggaca
m RANK
gtgctgctcgttccactg
agatgctcataatgcctctcct
m c-fms
gaccatggtgaatggtaggg
ggataacgttgaatcccactg
m TRAF6
ttgcacattcagtgtttttgg
tgcaagtgtcgtgccaag
m c-fos
gcaactttctatgacactgaaacac
tctctctagggctgcattgg
m MITF
gacaccagccataaacgtca
ttttccaggtgggtctgc
m PU1
ggagaagctgatggcttgg
caggcgaatctttttcttgc
m NFATc-1
ccgttgcttccagaaaataaca
tgtgggatgtgaactcggaa
ben DC-Stamp
aagctccttgagaaacgatca
caggactggaaaccagaaatg
m Atp6vOd2
aagcctttgtttgacgctgt
gccagcacattcatctgtacc
m CD14
aaagaaactgaagcctttctcg
agcaacaagccaagcacac
m CD40
gagtcagactaatgtcatctgtggtt
accccgaaaatggtgatg
m CD80
tcgtctttcacaagtgtcttcag
ttgccagtagattcggtcttc
m CD86
gaagccgaatcagcctagc
cagcgttactatcccgctct
m CD11c
gagccagaacttcccaactg
tcaggaacacgatgtcttgg
h βactin
ccaaccgcgagaagatga
ccagaggcgtacagggatag
h BCL2
caggagaatggataaggcaaa
ccagccagatttaggttcaaa
h Plk1
aaccgagttattcatcgagacc
ttggttgccagtccaaaatc
h CCNB1
cctccggtgttctgcttc
ttcagcattaattttcgagttcc
h CCNE1
ggccaaaatcgacaggac
gggtctgcacagactgcat
h CCND1
gccgagaagctgtgcatc
ccacttgagcttgttcacca
h MYBL2
gtcaaatggacccatgagga
gtcagtgcggttagggaagt
h GAPDH
agccacatcgctcagacac
gcccaatacgaccaaatc
h BAD
cgagtttgtggactcctttaaga
caccaggactggaagactcg
h BAX
agcaaactggtgctcaagg
tcttggatccagcccaac
h BCL XL
agccttggatccaggagaa
agcggttgaagcgttcct
Tabel 2 TaqMan primers Assay ID voor RT-PCR
m CTR
Mm 00432282_m1
m CatK
Mm 00484039_m1
m TRAP
Mm 00475698_m1
m Oscar
Mm 00558665_m1
m Trem2
Mm 04209424_g1
m Dap12
Mm 00449152_m1
m FcRy
Mm 02343757_m1
Statistische analyse
Celkweken werden gedaan met behulp van ten minste drie verschillende fibroblast donoren. De twee groepen werden vergeleken met de gepaarde T-testen hotels met α & lt; 5%.
Resultaten
Palatal fibroblasten remmen de osteoclast-achtige cellen pathway Belgique Om de impact van de palatale fibroblast op osteoclastogenesis te bepalen, een paracriene co-cultuur model op basis van inserts werd uitgevoerd. Een belangrijke bevinding was dat de aanwezigheid van palatale fibroblasten in de onderste kamer van de expressie van de typische osteoclasten markergenen CTR, CATK, TRAP en OSCAR daalde met ongeveer 30% (p & lt;
0,05), maar niet de andere co- stimulatoire moleculen osteoclastogenese. RANK en c-fms bleef ook ongewijzigd. Bovendien werd TRAP kleuring zichtbaar verminderd in de aanwezigheid van palatinale fibroblast. Gemiddeld aantal osteoclasten in co-cultuur met fibroblasten per regio van belang, willekeurig gekozen in elk putje: 11,7 (SD 6.7). Gemiddeld aantal osteoclasten zonder fibroblasten per regio van belang was 53,0 (SD 12,8; p & lt;
0,05). Belangrijk is dat de aanwezigheid van palatinale fibroblasten verhoogde de expressie van CD14 en co-stimulatoire eiwitten CD40, CD80 en CD86 met ongeveer 2-4-voudig (p & lt;
0,05) vergeleken met de respectieve controles zonder aanwezigheid van palatinale fibroblasten (Tabel 3). Dus de gegevens ondersteunen het concept dat de palatale fibroblasten bevorderen de ontwikkeling van antigeenpresenterende cellen in plaats van een osteoclast fenotype. Beenmergcellen geen invloed op de levensvatbaarheid of de proliferatie van de palatale fibroblasten, zoals aangegeven door de expressie analyse van apoptose en celcyclus verwante genen (gegevens niet getoond) .table 3 RT-PCR van osteoclast-achtige cellen (OCL) in samenwerking -Cultuur met gehemelte fibroblasten (PF) met M-CSF, RANKL en TGF-β1 in vergelijking met co-culturen zonder PF, met gemiddelde waarden en standaarddeviatie
Target genes
CD14
CD40
CD80
CD86
CTR
CatK
TRAP
OSCAR
Mean
3.13
2.48
1.57
4.31
0.63
0.71
0.75
0.62
Standard Deviation
0.66
0.82
0.53
1.42
0.31
0.34
0.31
0.30
De genen waren CD-merker 14, 40, 80 en 86 (CD), calcitonine receptor (CTR), cathepsine K (CatK), tartraat-resistente zuur fosfatase 5 (TRAP), osteoclast geassocieerde immunoglobuline-achtige receptor (OSCAR). De tabel geeft de gemiddelde en standaarddeviatie van n = 6
gevolg van twee onafhankelijke experimenten met fibroblasten van drie verschillende donoren. Alle gemiddelde waarden waren verschillend in vergelijking met controles zonder fibroblasten (p & lt;
0,05)
Kenmerkend distributie van osteoclasten en palatinale fibroblasten in de insert culturen
Palatal fibroblast een grote invloed op de verdeling van de osteoclasten gehad. TRAP positieve osteoclasten werden prominent in het midden van het inzetstuk (fig. 1). Een ander verschijnsel deed aan de verdeling van de palatale fibroblasten. De fibroblasten geaccumuleerde direct naast de rand van het inzetstuk, waardoor een ringstructuur van hoge celdichtheid (fig. 1). Deze waarnemingen ondersteunen in wezen dat palatale fibroblasten verminderen de vorming van osteoclasten in een paracriene werkingsmechanisme, maar ook dat de beenmergcellen fibroblasten in vitro kunnen trekken. Zo is de paracriene model op basis van cell afsluitende membranen met beenmergcellen in de inzetstukken en fibroblasten in het onderste compartiment van de cultuur plaat bleek een wederzijdse activiteit gevisualiseerd door de verdeling differentiële cel. Fig. 1 Kleuring van fibroblasten in putten en osteoclast-achtige cellen in voegt na incuberen murine beenmergcellen gedurende 5 dagen met M-CSF, RANKL en TGF-β1 (MRT). Gecombineerd kweken met fibroblasten en osteoclasten (a1) toonde een accumulatie van fibroblasten direct naast de rand van het inzetstuk, waardoor een ringstructuur van fibroblasten met een hoge celdichtheid (a2, a3). Bovendien palatale fibroblast had een grote invloed op de verdeling van de osteoclasten: osteoclasten waren prominent in het midden van het inzetstuk (A4, A5). In culturen waren geen fibroblasten aanwezig waren (b1, b2, b3), de TRAP-kleuring van osteoclast-achtige cellen vertoonden een vermindering van het aantal en was meer uniform verdeeld ten opzichte van osteoclast-cellen die interactie had met fibroblasten (b4, b5)
Discussie
de belangrijkste bevinding van deze studie was dat palatale fibroblasten creëerde een paracriene omgeving die matig onderdrukt osteoclastogenesis terwijl het verschuiven van de differentiatie in de richting van een macrofaag fenotype. Osteoclast meester genen neerwaarts gereguleerd in de aanwezigheid van fibroblasten, terwijl genen kenmerkend voor antigeenpresenterende cellen opgereguleerd. RANK en c-fms bleef ongewijzigd suggereert dat de differentiatie verschuiving niet kan worden verklaard door een verlaging van de respons op respectieve liganden met M-CSF zijn ook belangrijk voor monocyt ontwikkeling. Bovendien vonden we een kenmerk in vitro celverdeling, met osteoclasten nog in de centra van de inserts, terwijl fibroblasten verzameld in een ringachtige structuur.
Deze in vitro bevindingen zijn interessant omdat zij ondersteunen in wezen de opmerkingen van preklinische studies dat bindweefsel grafts verminderen de resorptie van de buccale botachtige wand [7, 8]. Het is niet verwonderlijk dat de verminderde osteoclastogenesis gaat samen met een verschuiving in de richting antigeen presenterende cellen. Soortgelijke waarnemingen werden gedaan met speeksel [15], en ook doxycycline en minocycline induceerde de expressie van dendritische cel markers, CD 11 c en CD86 in beenmergcellen in de aanwezigheid van RANKL [14]. Tezamen, de gegevens inzicht in een mogelijke paracriene mechanisme hoe gehemelte fibroblasten osteoclasten kan verminderen en tegelijkertijd aangeboren immuniteit geïndiceerd door expressie van merkers van antigeenpresenterende cellen, ten minste in vitro ondersteunen. Het is duidelijk dat dit niet een conclusie, in plaats van een suggestie ondersteund Wees onze voorlopige gegevens. Zo is de in vitro data en dinerkaart de mogelijke klinische relevantie moeten zorgvuldig worden geïnterpreteerd. Ondernemingen De pilot-studie heeft verdere beperkingen. Dit is een observationele studie toont een fenomeen, terwijl de onderliggende moleculaire mechanismen die onduidelijk blijven. De factoren vrijgegeven door de palatinale fibroblasten die verantwoordelijk zijn voor de waargenomen verschuiving van osteoclasten aan de vorming van nog niet nader gedefinieerd antigeenpresenterende cellen moet nog worden bepaald. Een waarschijnlijke kandidaat is osteoprotegerine, een decoy-receptor voor RANKL [12]. Osteoprotegerine wordt geproduceerd door fibroblasten, maar in welke mate en, als dat al deze factor heeft veroorzaakt de remming van osteoclastogenese is nog onduidelijk. Bovendien gebruikten we een xenogene systeem, dat het algemene resultaat zou kunnen hebben beïnvloed; menselijke palatinale fibroblasten en beenmergcellen van de muis. Echter, moleculen die een rol spelen in de differentiatie van osteoclasten evolutionair geconserveerd en werken dus interspecifieke [16]. Daarom is het gebruik van beenmergcellen van muizen in combinatie met humane fibroblasten dient als bewijs-van-beginselen experiment dat kan worden verfijnd door het toekomstige gebruik van interspecies in vitro modellen.
Conclusies
Tezamen voorliggend pilot-studie is een wetenschappelijke basis voor toekomstig onderzoek gericht op de invloed van de paracriene omgeving van palatale fibroblasten op osteoclastogenese en de respectievelijke impact op het aangeboren immuunsysteem te onthullen. De huidige studie is ook een primer om de dynamiek van de cel beweging gecreëerd door de onderlinge paracriene milieu verder te bestuderen.
Beschikbaarheid van gegevens en Materials
De datasets ter ondersteuning van de conclusies van dit artikel worden opgenomen in het artikel.
verklaringen
Dankwoord
We willen graag Catherine Solioz bedanken voor haar hulp. De studie werd ondersteund door een ITI Grant 852_2012
Open AccessThis artikel wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http:.. //Creativecommons org /licenties /door /4. 0 /), die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elk medium toestaat, mits u de juiste krediet aan de oorspronkelijke auteur (s) en de bron te geven, een link naar de Creative Commons-licentie, en aangeven of wijzigingen zijn aangebracht. De Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http:. //Creativecommons org /publicdomain /zero /1 0 /) van toepassing op de ter beschikking gestelde in dit artikel, tenzij anders vermeld data
Competing. belangen Ondernemingen de auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen bijdragen
Authors '
VV voerde de experimenten en schreef samen met RG het manuscript.; RG gepland de onderzoeksopzet, JCS geholpen om de methoden vast te stellen en workted op de cijfers. AS bijgedragen aan het opstellen en wijzigen van het manuscript. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
