Abstract achtergrond
Het doel van deze studie was om de in vitro reacties van ERM cellen onder de combinatie van centrifugale onderzocht en drukkrachten, qua expressie van HSP70 mRNA.
Methods Ondernemingen de ERM cellen waren positief voor CK19 aangeeft dat zij zijn afgeleid van de odontogene epitheel. Gekweekte cellen werden toegepast ERM centrifugaalkracht compressiekracht op 2:59 keer mechanische krachten. Na toevoeging van krachten werden cellen waargenomen met een rasterelektronenmicroscoop (SEM) en werden expressie van HSP70 mRNA gemeten met RT-PCR.
Resultaten
SEM waarnemingen liet de cellen werden onmiddellijk afgevlakt na het toepassen van mechanische kracht, maar nucleaire uitsteeksels teruggewonnen dezelfde als de controle 3 uur later. Een significant hogere expressie van HSP70 mRNA werd waargenomen in ERM cellen onder mechanische kracht vergeleken met de controlegroep, maar geleidelijk af met de tijd. Geen accumulatie van HSP70 mRNA expressie opgetreden met intermitterende kracht. De expressie van HSP70 mRNA met intermitterende werking herhaald 3 maal was significant hoger in vergelijking met onderbroken aangebrachte kracht slechts eenmaal of tweemaal.
Conclusies
Deze bevindingen suggereren dat ERM cellen brengen HSP70 mRNA in reactie op mechanische kracht, en dat intermitterende kracht handhaaft het niveau van HSP70 mRNA expressie.
Sleutelwoorden
HSP70 Epitheliale rest van Malassez mechanische kracht in vitro centrifugeren Achtergrond
het is bekend dat de ruimte van de parodontale ligament (PDL) gedurende het hele leven wordt gehandhaafd. Sommige studies hebben gemeld dat de epitheliale rest van Malassez (ERM) waarschijnlijk bijdraagt tot de instandhouding van de breedte PDL [1]. De ERM is gescheiden van Hertwig's epitheliale wortel schede (haar) in het embryonale stadium van de tandwortel ontwikkeling. HERS cellen zijn nauw verbonden en worden omringd door een continue basale membraan. Wanneer dentale papilla cellen zijn aan de HERS de binnenste basale membraan van de HERS intermitterend onmiddellijk na deze cellen beginnen met een dentine matrix synthetiseren. Dental sac cellen vervolgens migreren tussen de gefragmenteerde HERS [2]. Na het cement gesynthetiseerd door deze mesenchymale cellen van de dentale zak, epitheelcellen aggregeren celclusters genoemd ERM, die weer worden omringd door een continue basale membraan en worden meestal bij het cement gebied in de PDL of het cement na het vormen uitbarsting van de tanden, en zijn niet gerelateerd aan het ouder worden [3]. Carrie en Katchburian gemeld dat apoptose van ERM cellen deel van het mechanisme van de omzet van ERM [4] kan zijn. Vele studies hebben zowel de morfologische en functionele veranderingen van ERM cellen onder verschillende omstandigheden in vivo [5-7] gerapporteerd. Inoue et al. gemeld dat regeneratie opgetreden bij een alveolair been PDL-tandholte bereid, echter dento-alveolaire ankylose opgetreden 2 maanden na de operatie. Zij merkten op dat er geen ERM bestaat in de geregenereerde PDL en concludeerden zij dat het ontbreken van de ERM moet worden in verband met dento-alveolaire ankylose [5]. Bovendien Yamashiro et al. gemeld dat denervatie van de inferieure alveolaire zenuw leidt tot een verminderde verspreiding van het ERM in 1 week en dento-alveolaire ankylose vindt plaats op 6 weken. Zij bevestigden ook dat ERM receptor was immuun-positief voor trkA, die een hoge affiniteit voor de NGF receptor toont en zij concludeerden dat de gevoelszenuw een regulerende rol kunnen spelen in het ERM [6]. Mine et al. Waargenomen het genezingsproces van de PDL na tand opnieuw plantage in ratten en vergeleken de ingesloten groep met de niet-afgesloten groep. Zij vonden dat dento-alveolaire ankylose werd duidelijk gedetecteerd in de niet-afgesloten groep, maar werd niet gedetecteerd in de afgesloten groep. Zij concludeerden dat occlusale stimuli bevorderen van de regeneratie van de PDL en voorkomen dento-alveolaire ankylose [7]. Deze feiten suggereren dat de vermindering van ERM distributie in de PDL de ontwikkeling van dento-alveolaire ankylose kan voorafgaan en mechanische stimuli dento-alveolaire ankylose moeten voorkomen. Echter slechts enkele studies gerapporteerd wijzigingen van de ERM onder de verschillende soorten mechanische krachten in vitro [8].
In het algemeen wordt de reactie op stress als een cellulair afweermechanisme tegen omgevingsstoringen [9- vertegenwoordigen 12]. Als cellen ofwel blootgesteld aan een milde of matige belasting die voldoende is om de expressie van heat shock eiwitten (HSP's), ze kunnen vaak overleven latere, anderszins letale stressstimuli. HSP's kunnen alle soorten cellen tot expressie worden gebracht en ze spelen een beschermende rol tegen diverse schadelijke factoren, zoals oxidanten, ontsteking, hypoxie, hyperthermie en ook mechanische stimuli orthodontische werking [10-14]. Bovendien sterke orthodontische kracht geïnduceerde apoptose van PDL fibroblasten, en vele ERM cellen ook viel in apoptose [15, 16]. Bevestigd werd dat HSP70 die dient bij het handhaven van homeostase werd optrad als cochaperone door HPS40, apoptose remt door te interfereren met de functie van apoptose inducerende factor (AIF) [17]. Het effect van HSP70 on-apoptotic protease activerende Facor 1 (Apaf-1) is waarschijnlijk verantwoordelijk voor zijn vermogen om weerstand te bieden aan de gerapporteerde stress geïnduceerde apoptose en de expressie ervan bestaat in de PDL levenslange [18].
Doel de onderhavige studie was om de reacties van ERM cellen onder mechanische krachten in vitro onderzoeken, wat de expressie van mRNA coderend HSP70, een stressbestendigheid eiwit.
Werkwijzen Celkweek
Porcine ERM cellen geschonken door Prof. Yoshihiro Abiko (Mondziekten van Hokkaido Medical Science University). De ERM-cellen werden gekweekt in minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en gentamycine bij 75 mm kweekschalen in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO
2 bij 37 ° C. Na subcultuur 3 tijden werden ERM cellen geënt in 35 mm schalen. Wanneer cellen werden gekweekt gedurende 7 dagen en bereikte 70% confluentie, werden ze gebruikt voor de experimenten
verkennende experimenten. Bepaling van mechanische kracht in vitro (fig. 1)
Fig. 1 De afbeelding toont de toepassing methoden van mechanische kracht. Voor het centrifugeren, de rotor roteert met 4800 rpm gedurende 20 min om de mechanische kracht laden (type 1). Voor de compressiekracht, een dekglaasje, 24 x 24 mm2, 0,2 g gewicht werd geplaatst op het celoppervlak gedurende 20 minuten (Type 2). Combinatie van Type 1 en Type 2 (type 3)
Type 1: Centrifugaal kracht (4800 rpm) gedurende 20 min (n = 4
)
Type 2: compressiekracht (20 min) (n
= 4)
Type 3: comprimeren kracht + middelpuntvliedende kracht (4800 rpm) gedurende 20 min (n
= 4)
voor middelpuntvliedende kracht, horizontaal microplaat rotor in een Hitachi centrifuge (HimacCT6D®) werden gebruikt . bedoelde centrifugale experiment van Redlish et al. stelt een drukmodel door centrifugeren van PDL cellen in vitro [19, 20]. Na 35 mm kweekschalen in de rotor adapter werden ingebracht, werd de begrenzers centrifugaalkracht van 4800 rpm (47,2 kPa, 482 g /cm 2), die bijna hetzelfde als een snelle expansiekracht is [13 ].
Voor compressiekracht, een dekglaasje, 24 x 24 mm 2 in grootte en 0,2 g in gewicht, werd direct op het celoppervlak (fig. 1). Er zijn geen rapport over middelpuntvliedende kracht met compressie materialen geweest. Hoshina et al. gebruikte 9,0 g glasplaat echter cellen onder de glasplaat met centrifugaalkracht resulteerde dood [14]. Vervolgens probeerden we goede drukkracht onder 0,2 g dekglas voorbeeld.
Voor de combinatie van compressie en centrifugaalkracht een dekglaasje (24 x 24 mm 2, 0,2 g) werd direct op de cellen gebracht en was verwijderd na centrifugeren bij 4800 rpm.
cellen in elk van 3 typen hierboven werden continu gekweekt gedurende 12 uur en zonder geweld werd als controle.
als resultaat Type 3 een significant hogere expressie van HSP70 mRNA dan de controle, type1 en type2 (afb. 2). Dus hebben we besloten om de gecombineerde centrifugeren en het deksel glas groep te gebruiken als de experimentele groep. Fig. 2 HSP70 mRNA uitdrukking na 3 uur na verschillende mechanische stimuli. Type 3 geeft een significant hogere expressie van HSP70 mRNA dan de controle, als ook het type 1 en type 2 klep Er was geen significant verschil tussen de controle, type 1 en type 2, hoewel zowel type 1 als type 2 neiging hoger te zijn dan de controlegroep. ** P
& lt; 0.01
Scanning elektronenmicroscoop (SEM) waarnemingen
ERM-cellen werden eerder waargenomen, direct na en 3 uur na mechanische kracht met behulp van een Elionix ERA-8900FE veldemissie elektronenbundel 3D oppervlakteruwheid analyzer (4channel 3-dimensionale scanning elektronenmicroscoop ( 4CH-3D-SEM, Elionix Co., Ltd., Tokyo, Japan) bij een versnellend voltage van 15 kV. voor SEM waarnemingen werden cellen eerst gefixeerd met 2% glutaaraldehyde gedurende 1 uur bij 4 ° C. De cellen werden vervolgens gedehydrateerd in een gegradeerde reeks van ethanol, gedroogd door tetramethylsilaan (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) en sputtering gecoat met Au-Pd (Bio-Rad, Tokyo, Japan). de hoogte van de cellen werd gemeten als een één-lijnbesnoeiing systeem op de teller lijn figuur met behulp van Image J-analyse software (NIH, Bethesda, MD, USA).
Proefopzet
Experiment 1
ERM-cellen werden verzameld met behulp van mobiele schraper na de toevoeging van mechanische kracht om 3 uur , 6 h, 12 h, 24 h en 36 h, en de expressie van HSP70 mRNA werd gemeten. ERM cellen zonder krachten werden gebruikt als controle.
Experiment 2 Experiment 2
onderzocht of het aantal intermitterende mechanische krachten beïnvloedt de accumulatie van mRNA HSP70 (tabel 1). De dekking van glas werd verwijderd na het centrifugeren en de kweek werd voortgezet tot de volgende aanvullende force.Table 1 Experiment ontwerp van experiment 2
Time
Groep 1
Groep 2
Groep 3
0
-
-
-
3 h
-
-
Force
6 h
-
Force
Force
9 uur
Force
Force
Force
12 h
mRNA
mRNA
mRNA
Force, Toevoeging van centrifugale kracht; mRNA, isolatie van RNA; -, Geen kracht
Groep 1: Negen uur na de kweek, een centrifugaalkracht (4800 rpm) werd gedurende 20 min en de cellen werden waargenomen 3 uur na continue kweek
Groep 2: Zes uur na de kweek. een 1 st centrifugaalkracht (4800 rpm) werd gedurende 20 minuten en 3 uur na de continue kweek, een 2 nd centrifugaalkracht (4800 rpm) werd gedurende 20 min en de cellen werden waargenomen 3 uur . na continue cultuur
Groep 3: Drie uur na de cultuur, een 1 st middelpuntvliedende kracht (4800 rpm) werd toegepast gedurende 20 minuten en 3 uur na de continue cultuur, een 2 nd middelpuntvliedende kracht ( 4800 tpm) werd gedurende 20 minuten en 3 uur na de continue kweek, een 3 rd centrifugaalkracht (4800 rpm) werd gedurende 20 min en cellen waargenomen 3 uur na continue kweek (tabel 1).
Real-time reverse transcriptie PCR (RT-PCR)
Totaal RNA werd geëxtraheerd met de zure guanidium thiocyante /phenochloroform werkwijze, met een totale RNA-isolatie reagens (TRIzol Reagent, Invitrogen, USA) volgens de instructies van de fabrikant. De RNA's werden aan omgekeerde transcriptie tot cDNA in een Thermal Cycler behulp Oligo (dT) primer (Invtirogen), RNase Inhibitor (Takara), reverse transcriptase (Takara), dNTP mengsel en RNA PCR buffer (Sigma). Een kwantitatieve RT-PCR-test werd uitgevoerd met een LightCycler ™ (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland) met de dubbelstrengs DNA kleurstof SYBR Green 1 (Roche Diagnostics) uitgevoerd om het niveau van mRNA observeren. Primersequentie en grootte die in deze studie worden getoond in Tabel 2. Kwantificering werd uitgevoerd door het vergelijken van de resultaten verkregen met standaardmonsters als eerder onderzoek [21] niveaus. In deze studie, de concentraties van cDNA in de niet-gestimuleerde monsters waren 0,2, 0,5, 1,0 en 2,0 pl. Smeltcurve analyses werden uitgevoerd na de PCR amplificatie en geen primer dimmer in de PCR-producten te bevestigen. De verhoudingen van HSP70 mRNA expressie werd aangepast door de waarde van het huishoud-gen GAPDH.Table 2 primersequentie en grootte die in deze studie
Gene
Sequence
Size
HSP70
Forward
5’-CGGACGAGTACAAGGTTGA-3’
206
Reverse
5’- CTCTTTCTCCGCCAACTG-3’
GAPDH
Forward
5’-AGGGGCTCTCCAGAACATCA-3’
196
Reverse
5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTT-3’
Statistische analyse
Data zijn weergegeven als gemiddelde ± SD. De significantie van verschillen werd vastgesteld met ANOVA gevolgd door testen Scheffe's Excel 2013 (Microsoft, Redmond, WA, USA). De verschillen zijn significant bij p Restaurant & lt beschouwd; 0.01.
Resultaten
SEM waarnemingen
De ERM cellen werden verspreid en nucleus uitsteeksels en afgeplatte cytoplasma waren duidelijk in de controlegroep. De kern uitsteeksels werd vlakker onmiddellijk na het centrifugeren en nucleaire uitsteeksels werden opnieuw waargenomen na 3 uur na de centrifugatie (fig. 3). Fig. 3 SEM waarnemingen. De afgeronde kernen en afgevlakte cytoplasma van gekweekte ERM cellen waargenomen in de controlegroep. Slechts afgeplatte cellen zonder nucleaire uitsteeksels werden onmiddellijk waargenomen na centrifugatie en enkele uitsteeksels kernen werden waargenomen bij 3 uur na het centrifugeren. Schaal bar, 10 urn
De gemiddelde hoogte van ERM cellen was 1,4 ± 0,2 urn in de controlegroep. De hoogte van de ERM cellen was 0,78 ± 0,18 pm onmiddellijk na het centrifugeren en hersteld tot het controleniveau bij 3 uur na het centrifugeren. De hoogte van ERM cellen direct na het centrifugeren was significant lager dan de controlegroep en bij 3 uur na de centrifugatie (fig. 4). Fig. 4 celhoogte na centrifugeren. De hoogte van ERM cellen direct na centrifugeren was significant lager dan de controlegroep en bij 3 uur na centrifugeren. ** P
& lt; 0,01
expressie van HSP70 mRNA door mechanische krachten
Experiment 1
De expressie van HSP70 mRNA van de experimentele groep (centrifugeren en compressie) significant hoger dan de controlegroep helemaal tijdsperiode, (fig. 5) . De expressie van HSP70 mRNA van de experimentele groep was het hoogst bij 3 uur na het toevoegen van de kracht. Het expressieniveau van HSP70 mRNA was niet stabiel en verminderde in de tijd. Fig. 5 HSP70 mRNA uitdrukking na 3 uur, 6 uur, 12 uur, 24 uur en 36 uur na de mechanische kracht. De expressie van HSP70 mRNA 3 uur na het centrifugeren was de hoogste en de expressie geleidelijk af tot 36 uur. De mRNA-expressieniveau niet constant blijven en verdwenen tijd. ** P
& lt; 0,01, vergeleken met 3 uur na de mechanische kracht
Experiment 2
De expressie van HSP70 mRNA door de controlegroep was significant lager dan de andere 3 groepen (p
& lt; 0,01). Er was geen significant verschil tussen de 3 verschillende groepen mechanische kracht (fig. 6). Het aantal intermitterende mechanische stimuli maakte geen verschil wat betreft de expressie van HSP70 mRNA, wat betekent dat zodra HSP70 mRNA expressie plaatsvond, was er geen verdere accumulatie van expressie vertonen. Fig. 6 HSP70 mRNA expressie bij 12 uur na de intermitterende stimuli 1. De expressie van HSP70 mRNA van de controle groep was significant lager dan de andere 3 groepen. Er was geen significant verschil tussen de 3 verschillende spanning groepen. Het aantal keren mechanische stimuli maakte geen verschil qua HSP70 mRNA-expressie vertonen. ** P
& lt; 0.01
Discussie
Hoewel de PDL wordt continu blootgesteld aan mechanische belastingen, zoals drukkrachten of uitbreiding krachten tijdens occlusie en kauwen [10-12], worden deze stressreacties beschouwd als een cellulair afweermechanisme tegen verstoringen van het milieu als gevolg van te vertegenwoordigen het up-gereguleerde expressie van HSP's [17]. Deze studies toonden aan dat ERM cellen verminderen de functies van vorming hard weefsel en vergroten alveolaire botresorptie en voorkomen van de PDL gevoelig voor dento-alveolaire ankylose [3, 18].
Eerder is aangetoond dat HSP's een essentiële rol spelen het handhaven van de integriteit van cytoskeletstructuren vanwege hun functie als moleculaire chaperones [9, 22]. Kaarniranta et al. analyse van de effecten van hydrostatische druk (HP) op HSP genexpressie door primaire menselijke fibroblasten en gerapporteerd dat HSP70 genexpressie werd gedetecteerd in humane fibroblasten [23]. Hun resultaten suggereerden dat HSP70 een belangrijke rol kan spelen in de vroege stadia van de aanpassing van cellen op mechanische belasting expressie. Bovendien, Lui en Kong gemeld dat HSP70 werd gevonden voorbijgaand opgereguleerd tijdens depolarisatie en behield AIF in het cytoplasma naar apoptose [17].
Lee et al voorkomen. gemeld dat de toevoeging van intermitterende centrifugatie MC3T3-E1 cellen gestimuleerd hun ALP activiteit [24]. De expressie van HSP70 mRNA 3 uur na centrifugeren was de hoogste en daarna geleidelijk af in de tijd tot 36 uur in deze studie. De expressie van HSP70 mRNA met intermitterende werking elke 3 uur was significant hoger dan de controle, echter transcriptioneel niveau van HSP70 mRNA werd niet gehandhaafd. Voorgesteld wordt ERM cellen reageren op elke mechanische kracht maar niet transcriptioneel niveau van HSP70 mRNA ter bescherming en ondersteuning van hun homeostatische functie te behouden.
Een voordeel van het gebruik van centrifugaalkracht is dat het mogelijk is om zelfs toevoegen meer kracht om de cellen zonder de kweekomstandigheden, zoals minder zuurstof verarmd voeding [13]. Salter et al. toonde de integrine als mechanoreceptoren dat componenten van de extracellulaire matrix met actine filament verbinding in het cytoplasma [25]. Tanaka beschreef de mogelijkheid dat deze route via integrine de kern mogelijk links naar mechanotransductie [26]. SEM waarnemingen in dit onderzoek bleek dat de nucleaire uitsteeksels in de controlegroep en afvlakking van de kernen zich voordoet onmiddellijk na de centrifugering maar keerde terug naar de originele vormen net als de controle bij 3 uur na het centrifugeren. Dit suggereert dat centrifugaalkracht invloed kunnen de structurele route van actine filamenten direct na het centrifugeren, en dat het netwerk van signaaloverdracht wordt geactiveerd.
Redlich et al. meldde dat de toepassing van een 1000 rpm centrifugaalkracht menselijke fibroblasten PDL celdood gepromoot met 20%, terwijl de expressie van mRNAs coderend type 1 collageen matrix metalloproteïnase en weefsel remmer van matrix metalloproteinase verhoogd [19, 20]. Naito et al. meldde de effecten van 4800 rpm, die werd gebruikt in deze studie en vertoont gelijkenis met de occlusale kracht en bijten kracht te op beenmergstamcellen [13]. Zij concludeerden dat cellen aan een 4800 rpm centrifugaalkracht vertoonden een hogere celproliferatie activiteit en expressie van bot-gerelateerde eiwit mRNA vergeleken met cellen gecentrifugeerd bij 600 rpm.
Integendeel, cellen onder een dekglas als een compressiekracht, zoals die in deze studie werden gerapporteerd door Hoshina et al. potentieel worden hypoxische en ondervoed, maar ze tot de conclusie dat 0,9 g /cm 2 belasting door de glazen plaat had geen verschil in termen van cellulaire morfologie en functionele analyse [14]. Zij meldde dat het comprimeren van kracht de finale celdifferentiatie in de verkalking fase van osteoblastische cellen kunnen onderdrukken. In dit onderzoek werd de expressie van HSP70 mRNA was veel hoger voor de combinatie van middelpuntvliedende krachten en comprimeren dan elk centrifugaalkracht alleen of compressiekracht alleen. Deze resultaten suggereren dat de compressiekracht aanvankelijk maakt veranderingen in de intracellulaire omgeving en dat de middelpuntvliedende kracht verandert de structuur van actine filamenten en versnelt de verandering van HSP70 genexpressie.
Conclusies Deze resultaten geven aan dat ERM cellen brengen HSP70 mRNA in reactie op mechanische kracht, en dat intermitterende kracht handhaaft het niveau van HSP70 mRNA expressie. Echter, de expressie van HSP70 afneemt met de tijd, en transcriptie niveau van HSP70 mRNA-gen werd niet gehandhaafd. Voor toekomstige beschouwing, de analyse van eiwit is noodzakelijk.
Verklaringen
Dankwoord
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door een Oral Health Science Center Grant 7 van de Tokyo Dental College en door de MEXT (Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie) van Japan, 2010-2012. Ik wil graag de leden van de afdeling Klinische Pathofysiologie bedanken voor hun technische bijstand
Open AccessThis artikel wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http:.. //Creativecommons org /licenties /door /4. 0 /), die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elk medium toestaat, mits u de juiste krediet te geven aan de oorspronkelijke auteur (s) en de bron, een link naar de Creative Commons-licentie en aangeven of wijzigingen zijn aangebracht. De Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http:. //Creativecommons org /publicdomain /zero /1 0 /) van toepassing op de ter beschikking gestelde in dit artikel, tenzij anders vermeld data
Competing. interesse de auteurs verklaren dat zij geen concurrerende rente. bijdragen
Authors '
KM, TN en TI ontwierp het onderzoeksplan. HK, KN en TSO voerde de cel morfologische studie. HK, TSO AAW en KM voerde de RNA-analyse en de statistische analyse. KN, TN en TI schreef de krant. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
