Abstract achtergrond
Krüppel-achtige factor 4 (KLF4) is een transcriptiefactor het reguleren van de proliferatie-differentiatie balans tussen epitheel en down- geregeld in minder gedifferentieerd en geavanceerde orale carcinomen. Hoewel de expressie wordt geïnactiveerd door promoter hypermethylering in kwaadaardige tumorcellen, blijft onbekend orale carcinoomcellen.
Werkwijzen
Genomisch DNA geïsoleerd uit negen verschillende orale carcinoma cellijnen en normale keratinocyt lijn werd behandeld met natrium bisulfiet, en methylering bij KLF4
genpromotor werd bepaald door PCR met directe sequentieanalyse. . KLF4 expressie in cellen gekweekt met of zonder demethylatie reagens werd gevolgd door kwantitatieve real-time PCR en immunoblot
Resultaten
een 237-bp promotorgebied spanning - 718 en - 482 van KLF4
gen gehypermethyleerd in orale carcinoom cellen die KLF4 uitdrukken
op een laag niveau, maar de methylatie kwam niet vaak voor in cellen die KLF4
hoog bedrag. De stroomafwaartse gebied van - 481-192 was niet gemethyleerd in elke cellijnen. Demethylering behandeling van cellen opgereguleerd de expressie van mRNA en eiwitniveaus.
Conclusie
Deze studie toonde aan dat Hypermethylering in een smal bereik van het promotorgebied neerwaarts reguleert KLF4 expressie, en suggereert dat het verlies van expressie door de hypermethylatie draagt bij aan orale carcinoom progressie
Sleutelwoorden
Gene promotor hypermethylering Krüppel-achtige factor Mondkanker Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi:.. 10 1186 /s12903-016-0172- 5) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is. achtergrond
Oral carcinomen zijn een meest voorkomende kwaadaardige tumor van het hoofd en de nek, maar de patiënt prognose is niet voldoende verbeterd. Carcinoomcellen bij invasieve voorzijde vertonen vaak afwijkende genexpressie en dedifferentiate in mesenchymale cel-achtige toestanden in een proces van ziekteprogressie [1-3]. Bovendien, aanhoudende proliferatie is een belangrijk kenmerk in een agressieve subset van carcinomen. Proliferatie en differentiatie van cellen te controleren evenwicht ontwikkeling en homeostase van epitheel en spelen een rol bij definitieve pathologische toestand carcinomen [4]. Ze worden voornamelijk gereguleerd door tumor onderdrukkende genen en de expressie van de genen wordt vaak geïnactiveerd door epigenetische mechanismen [5]. Het is belangrijk om een oorzaak te onthullen inactiveren tumor onderdrukkende genexpressie mechanismen oraal carcinoom progressie begrijpen.
In meerlagig plaveiselepitheel waaronder orale epitheel, Krüppel-achtige factor (KLF) 4 en 5 zijn uitgedrukt in post-mitotische cellen keratiniserend suprabasale en proliferatieve minder gedifferentieerde basale cellen. Ze kritisch bestuurt een proliferatie-differentiatie balans van het epitheel [6, 7]. KLFs transcriptioneel reguleren doelwit genexpressie door binding aan de promotor, en eerdere studies aangetoond dat het verlies van KLF4 expressie associeert met dedifferentiatie van orale carcinoma cellen en wordt vaak waargenomen in een agressieve subset van de carcinomen [7, 8]. Het suggereert een betrokkenheid van het verlies van expressie in carcinomen progressie.
Sinds chromosomale deletie van KLF4
gen locus 9q31.2 komt zelden voor in carcinomen [9, 10], epigenetische inactivatie van het gen is een eerste kandidaat verantwoordelijk voor het verlies van meningsuiting. Onder epigenetische afwijkingen in carcinoomcellen, promotor hypermethylatie is een meest voorkomende causatieve genexpressie [11, 12] inactiveren. In feite is Hypermethylering bij KLF4
gen promoter en enhancer gedocumenteerd in carcinomen van de dikke darm, maag, baarmoederhals en nieren [13-16]. Echter, de hypermethylated regio variabel gelokaliseerd in carcinomen van verschillende herkomst en onbekende in orale carcinomen. In deze studie analyseerden we de hypermethylering en correlatie met KLF4 expressie in orale carcinoomcellen.
Werkwijzen
Cellijnen
oraal carcinoom cellijnen (Ca9.22, Ho-1-u-1, HOC313, HSC2 , HSC3, KOSC3, OSC19, SCCKN, TSU) en een geïmmortaliseerde maar niet getransformeerde normale keratinocyt cellijn HaCaT [17], werden gekweekt in 10% foetaal bovien serum-bevattend medium.
bisulfiet-gemodificeerd sequentieanalyse van KLF4
promotorregio
promotor methylatie toestanden bij KLF4
gen werden geanalyseerd op basis van een eerdere studie [18]. Genomisch DNA geïsoleerd uit cellen werden behandeld met natrium bisulfiet en toegepast voor PCR amplificatie van het promotergebied spanning - 718 en 192 (de transcriptie startplaats is ingesteld op 1) voor directe sequentieanalyse. De primer sequenties voor de analyse zijn als volgt: 5 '-
-736GTATGTTAGTAGGGGTG-3' (voorwaartse), 5 '- -442GAGTTTGTTGATTTAGTTGT-3' (voorwaartse), 5 '- -331AAGGAAGTTATAAGTAAGGAA- 3 '(forward), 5' - -72AATAAAACTAACTACC-3 '(omgekeerde), en 5' - + 213AAACCCAAAACCCCAAATTAA-3 '(omgekeerde). We bedoeld een DNA sequentiegegevens van KLF4
gen gedeponeerd bij GenBank (DQ658241.1).
Kwantitatieve real-time PCR Totaal RNA
geïsoleerde vorm cellen met of zonder 5 pM 5-aza-2-deoxycitidine ( 5-aza) behandeling werd reverse getranscribeerd in cDNA door MultiScribe Reverse Transcriptase (Applied Biosystems) en onderworpen aan real-time kwantitatieve PCR met de StepOne real-time PCR-systeem (Applied Biosystems). PCR-omstandigheden waren 95 ° C gedurende 20 s, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 1 s en 60 ° C gedurende 20 s. De TaqMan probes specifiek voor KLF4
(Hs00358836_m1, Applied Biosystems) werd gebruikt. Expressie niveaus genormaliseerd tegen ACTB
(TaqMan endogene controle Human ACTB, Applied Biosystems) werden berekend door de standaard curve methode (2 -ΔΔCt). Relatieve-voudige veranderingen van de expressie analyse, de expressie na de 5-aza behandeling werd gedeeld door die zonder behandeling.
Immunoblot
Totale cellysaten in SDS monsterbuffer bevattende 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride en proteaseremmer cocktail ( Roche Diagnostic GmbH) werd aangebracht op SDS-polyacrylamidegels onder reducerende conditie en electroforese PVDF membranen. De membranen werden gehybridiseerd met antilichamen tegen KLF4 (Santa Cruz Biotechnology) of β-actine (Sigma-Aldrich) gevolgd door mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen. De signalen werden gedetecteerd met behulp van Chemi-Lumi One Super (Nakarai Tesque) en vastgelegd op Ez-Capture MG (ATTO).
Resultaten
Expressie van KLF4 in orale carcinoomcellen
Expressie van KLF4
mRNA was gekwantificeerd door real-time PCR (Fig. 1). Onder carcinoma cellijnen, werd sterk tot expressie in normale keratinocyten HaCaT. Zij is vastgesteld op een relatief hoog niveau KOSC2 cellen en HOC313 cellen, weinig HSC2 cellen, Ho-1-u-1 cellen en Ca9.22 cellen, en niet detecteerbaar in OSC19 cellen. Fig. 1 Expressie van KLF4
mRNA in orale carcinoma cellijnen en normale keratinocyten (HaCaT). KLF4
expressie werd kwantitatief onderzocht door de real-time PCR. Relatieve expressie werd gestandaardiseerd door expressie van ACTB
in elk monster (n = 4
) en vergeleken met de expressie in cellen HaCaT
promotor hypermethylatie in carcinoomcellen
methylering bij KLF4
genpromotor van - 718-192 werd onderzocht door de bisulfiet gemodificeerde PCR direct-sequentie-analyse. De promoter inbegrepen 109 methylering-gevoelige cytosines (aanvullende bestandsinformatie 1: Figuur S1), en we beschreven methyleringstaat elk cytosine als U (gemethyleerd), M (gemethyleerd) of U /M (mengsel van unmethylation en methylering) in deze studie. In tegenstelling tot de afwezigheid van methylatie in HaCaT-cellen, alle carcinoma cellijnen bevatte M en /of U /M cytosinen en frequentie van M cytosine grotendeels verschillend (figuur 2 en aanvullende bestandsinformatie 1. Tabel S1). De methylering werd opgesloten in een 237-bp regio die - 718 en - 482 dat 39 methylatie-gevoelige cytosines aangewezen als # 1 tot # 39 bevat, en de cytosinen in 673-bp stroomafwaarts van # 39 cytosine (# 40- # 109 ) werd niet gemethyleerd. Computationele analyse gaf aan dat het 237 bp-gebied bevat methylatie-gevoelige cytosines vier-Sp1 bindingsplaatsen (# 5, 6, 23, 34 en 38 cytosinen) en één PU.1-bindingsplaats (# 19 cytosine). De # 5, 6, 19 en 23 cytosines werden vaak gemethyleerd in cellen die KLF4
expressie op laag niveau (figuur 3 en aanvullende bestandsinformatie 1. Tabel S1). Fig. 2 Methylering van KLF4
gen promoter. Positie van methylatie-gevoelige cytosines in de promotor wordt aangeduid als de blauwe (bovenste regel
) en de cytosinen worden numeriek genummerd van # 1 naar # 109. Lagere lijnen geven cytosines die volledig werden gemethyleerd (zwart-) of niet-gemethyleerd (wit
) en mengsel van methylatie en unmethylation (grijs
). M% en U /M% geven percentage van gemethyleerde cytosinen en het mengsel in 39 cytosines, respectievelijk. b Sequence data op # 10 en # 11 cytosines. Vier carcinoma cellijnen die gemethyleerd (M) en gemethyleerde (U) cytosinen en het mengsel (E /M) werden gepresenteerd als een voorbeeld
Fig. 3 Transcriptiefactor bindingsplaatsen in de 237-bp. Methylatie-gevoelige sites worden gekenmerkt door rode, en Sp1 bindingsplaatsen (blauwe pijlen
) en PU.1-bindingsplaats (groene lijn
) zijn aangegeven
KLF4
expressie na de demethylering
een betrokkenheid van de methylatie in KLF4 expressie onderzocht werden de cellen behandeld met een demethylatie reagens 5-aza en de expressie werd geanalyseerd mRNA en eiwitniveaus. De behandeling sterk verhoogde mRNA expressie in TSU cellen en vooral HSC2 cellen (Fig. 4a) waarin de promoter werden grondig gehypermethyleerd. Andere cellijnen verhoogde de expressie verscheiden, met uitzondering van OSC19 cellen die mRNA expressie gebracht onder een detecteerbaar niveau. KLF4 eiwitexpressie was bijna identiek aan de mRNA-expressie. Het was niet detecteerbaar in cellen HSC2, HSC3 cellen, Ho-1-u-1-cellen, TSU cellen en OSC19 cellen. Na demethylering behandeling gehypermethyleerd HSC2 cellen en TSU cellen sterk opgereguleerd de eiwitexpressie (Fig. 4b), en Ho-1-u-1-cellen, en cellen HOC313 Ca9.22 cellen die geen M cytosine bevatte niet verhogen uitdrukking. OSC19 cellen heeft het eiwit als mRNA niet uitdrukken. Onder de drie cellijnen die zowel M en U /M cytosines in verschillende tarieven, HSC3 cellen en KOSC2 cellen blijkbaar verhoogde de expressie maar een andere (SCCKN cellen) niet. Fig. 4 Expressie van KLF4 na de demethylering. een relatieve plooi van KLF4
mRNA expressie in cellen behandeld met 5-aza demethylatie reagens gedeeld door de expressie zonder 5-aza behandeling (n = 4
). b KLF4 eiwitexpressie in cellen met (+) en zonder (-) 5-aza behandeling werden onderzocht door immunoblot. β-actine werd gebruikt als een interne controle
Discussie
carcinoomcellen verwerven agressief gedrag bij een proces van progressie door het activeren en inactiveren van tumor-geassocieerde genexpressie. KLF4 expressie is verminderd bij vele soorten carcinomen vergevorderd stadium en het verlies van expressie initieert epitheliale-mesenchymale overgang carcinoomcellen die de progressie [19] sterk toeneemt. In feite KLF4 is down-gereguleerd in minder gedifferentieerd en geavanceerde orale carcinomen en onderdrukt dedifferentiatie van de cellen [7]. Hoewel de promotor hypermethylatie wordt beschouwd als een oorzaak van het verlies van expressie [13-16], is niet in orale carcinomen bekend. Deze studie toont aan dat de expressie nauw correleert met hypermethylering toestanden bij een 239 bp-gebied in de promoter.
Hypermethylering belast geninactivatie wordt vaak waargenomen in CpG eilanden tumor onderdrukkende genen [11, 12] en er werd aangetoond in KLF4
gen in dit onderzoek suggereert dat de regio belangrijk KLF4 expression orale carcinoomcellen. Dit wordt ondersteund door die demethylering behandeling opwaarts gereguleerd KLF4 mRNA en eiwit in de hypermethylated cellen, maar niet de cellen zonder hypermethylering. Ca9.22 cellen, Ho-1-u-1-cellen en OSC19 cellen die niet werden gehypermethyleerd bijna niet de uitdrukking niet te verhogen. Het suggereert de aanwezigheid van bijkomende factoren om de expressie te activeren. Het is echter duidelijk dat de Hypermethylering verantwoordelijk voor KLF4 downregulatie, en dat de bp-gebied 237 een belangrijke rol bij de expressie kan spelen.
Hypermethylering van KLF4
gen gebeurde enhancer van het gen menselijke kwaadaardige tumorcellen; -2.128 -1.770 ~ Regio in medulloblastoom cellen [20] en - 1852 ~ -1658 regio in cervixcarcinoom [15]. Hoewel we hier niet aan de orde methylatie op de versterker in deze studie, methylering bij promotor regio meer rechtstreeks als een platform om genexpressie te reguleren in het algemeen [11, 12]. Hypermethylering bij KLF4
gen promoter waargenomen in gastrische carcinoomcellen (-130 ~ -13 regio; ref. 14) en colorectale carcinoomcellen (79 ~ 355 regio; ref. 13), maar - 481 ~ gebied 192 niet gemethyleerd in deze studie. Het geeft aan dat Hypermethylering beperkt bij een 237-bp gebied van - 718 tot - 482 is belangrijk voor de negatieve regulatie in orale carcinoomcellen. Recente bewijzen vastgesteld dat Hypermethylering optreedt bij verschillende regio genpromotor /enhancer in verschillende carcinoomcellen en de promotor hypermethylatie is aangewezen voor cel-afstamming en celtype specificatie [11, 12]. Het is aannemelijk dat de Hypermethylering-gevoelige plaatsen in orale carcinoomcellen lokaliseren naast andere typen carcinoomcellen. Ondernemingen De 237-bp codeert Sp1 en PU.1 bindingsplaatsen die noodzakelijk zijn voor de expressie [21, 22] . Sp1 speelt een cruciale rol in epitheliale ontwikkeling [23, 24], en Klf4
- /-
muizen ontwikkelen orale carcinomen [8, 25]. Daarom hypermethylering het 237-bp lijkt een belangrijke rol in KLF4 downregulatie hebben. Sinds het verlies van KLF4 expressie nauw associeert met orale carcinoom progressie, het herstel van de expressie kan een intrigerende strategie om de patiënten te behandelen zijn.
Conclusies Inloggen Deze studie toonde aan dat KLF4
gen promoter werd gehypermethyleerd in orale carcinoma cellen bij een verschillend gebied van andere soorten carcinoomcellen, en dat het in verband met KLF4 expressie.
5-aza: sinds KLF4 is tumor onderdrukkende, kan de inactivatie van de promotor hypermthylation een mechanisme van oraal carcinoom progressie
Afkortingen
5-aza vastgesteld in carcinoma cellijnen geanalyseerd in deze studie. -2-deoxycitidine
KLF:
Krüppel-achtige factor
M cytosine:
gemethyleerde cytosine
U cytosine:
niet-gemethyleerd cytosine
U /M cytosine:
Mengsel van niet-gemethyleerd en gemethyleerde cytosines
verklaringen
Erkenning
Deze studie werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant nummer 26462859, en in het kader van een curriculum van Research for Life Dental Science aan de School of Life Tandheelkunde aan Tokyo uitgevoerd, The Nippon Dental University.
Open AccessThis artikel wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http:. //creativecommons org /licenties /door /4. 0 /), die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie mogelijk maakt in elk medium, op voorwaarde dat u de juiste krediet te geven aan de oorspronkelijke auteur (s) en de bron, een link naar de Creative Commons-licentie, en aangeven of wijzigingen zijn aangebracht. De Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http: //creativecommons org /publicdomain /zero /1 0 /.) Is van toepassing op de ter beschikking gestelde in dit artikel, tenzij anders vermeld data
Extra. bestand
Extra file 1: Figuur S1. Methylering gevoelige plaatsen bij KLF4
-gen en de promotor. DNA sequentie geanalyseerd in deze studie wordt weergegeven (de sequentie in exon 1 geactiveerd). Cytosinen potentieel gevoelig voor methylering en hun numerieke nummer werden benadrukt in het rood, en een hypermethylated 237 bps-gebied werd onderstreept. Tabel S1. Een samenvatting van methylering verklaart in elk methylatie vatbaar cytosine. (PDF 160 kb) Concurrerende belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen. Bijdrage
Authors '
AY, KK, AT, AS, HA, TH, DU, KY en TC afgerond alle experimenten. TC en KI ontwierp de studie, en KI schreef het manuscript. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
