Abstract achtergrond
Recombinant botmorfogenetische eiwit twee (rhBMP2) is gebruikt voor een verscheidenheid aan klinische toepassingen bij orthopedische chirurgie en tandheelkundige ingrepen. Ondanks het wijdverbreide gebruik, zijn bezorgdheid geuit met betrekking tot haar korte halfwaardetijd en voorbijgaande bioactiviteit in vivo. Recent onderzoek gericht op het ontwikkelen rhBMP2 gesynthetiseerd uit een kortere polypeptideketen (108 aminozuren) is uitgevoerd.
Methods Ondernemingen De osteopromotive eigenschappen van BMP2 werden onderzocht op cel gedrag. Vijf concentraties van rhBMP2_108 zoals 10, 50, 100, 200 en 500 ng /ml werden vergeleken met een commercieel beschikbare rhBMP2 (100 ng /ml). Elk van de werkende concentraties rhBMP2_108 onderzocht op MC3T3-E1 osteoblasten op hun vermogen om osteoblasten recrutering, proliferatie en differentiatie induceren, zoals bepaald door alkalische fosfatase (ALP) kleuring, alizarine rood kleuring en real-time PCR voor genen die coderen voor ALP, osteocalcine (OCN), collageen-1 (COL-1) en Runx2.
resultaten
De resultaten tonen dat alle concentraties van rhBMP2_108 aanzienlijk verbeterd celrecrutering en proliferatie van osteoblasten bij 5 dagen na zaaien. Bovendien rhBMP2_108 had de meest uitgesproken effecten op osteoblast differentiatie. Het bleek dat rhBMP2_108 had meer dan viervoudig significante toename van ALP activiteit op zeven en 14 dagen na het zaaien en de concentraties variërend van 50 tot 200 ng /ml toonde het meest uitgesproken effect. Analyse van real-time PCR voor de genen die coderen voor ALP, OCN, COL-1 en Runx2 verder bevestigd dosis-afhankelijke verhogingen in 14 dagen na het zaaien. Bovendien alizarinerood vlekken vertoonde een concentratie-afhankelijke stijging van de kleuring van 14 dagen.
Conclusie Ondernemingen De resultaten van dit onderzoek tonen aan dat deze kortere polypeptideketen van rhBMP2_108 is net zo bioactieve als commercieel beschikbaar rhBMP2 voor de werving van voorlopercellen cellen door hun differentiatie vergemakkelijken richting osteoblast lineage. Future in vivo onderzoek zijn nodig om de bioactiviteit te onderzoeken.
Sleutelwoorden
BMP2 Osteo-inductieve osteoinductie osteoblastdifferentiatie Guided botregeneratie Achtergrond
Het gebruik van groeifactoren en biomaterialen met bot-inducerende eigenschappen een centrale rol in behandelingsopties voor heeft gespeeld patiënten die lijden aan een verscheidenheid van botdefecten veroorzaakt door een breuk of ziekte [1-3]. Osteoporose, een ziekte gekenmerkt door lage botmineraaldichtheid en hierop volgende kwetsbaarheid [4] heeft nu naar schatting 200 miljoen mensen wereldwijd bereikt met 80% wordt postmenopauzale vrouwen [5-7]. De aanzienlijke toename van het bot metabole ziekten in combinatie met traumatische letsels veroorzaakt door sportongevallen, auto-ongevallen en andere gerelateerde fracturen noodzakelijk bot-inducerende middelen die in staat het versnellen van botregeneratie vaak in het gedrang scenario's, zoals osteoporose gerelateerde fracturen [8-11].
Een groeifactor die op grote schaal is gebruikt met goedkeuring van de FDA is dat van het bot morfogenetische eiwitten (BMP's) [12-14]. BMPs werden eerst geëxtraheerd uit gedemineraliseerd botmatrix en bleek dat deze laagmoleculaire eiwitten werd aangetoond dat ectopische botvorming in extra het skelet bij dieren [15, 16]. Sindsdien zijn BMP's kunnen regenereren van een veelheid van botdefecten geweest en is aangetoond dat celrecrutering, proliferatie en differentiatie van mesenchymale cellen verbeteren en versnellen hun differentiatie richting botvormende osteoblasten [17]. Ondanks de klinische voordelen van recombinante eiwitten, zijn bezorgdheid geuit over hun kortstondige bioactiviteit, eiwit instabiliteit, snel oplossnelheden en korte halveringstijd leven [18]. Om deze redenen wordt het gebruik van rhBMPs gewoonlijk toegediend in hoge supra-fysiologische doses dat het risico van mogelijke bijwerkingen geassocieerd met het gebruik ervan [19] dragen. Bovendien zijn er andere factoren die kunnen leiden tot een verminderde in vivo bioactiviteit ook de rol van antagonisten en hun specificiteit voor verschillende BMPs (noggin, chordine, dan) de rol van de gastheer organisme voor expressie (E.coli vs. CHO) en bijbehorende verschillen in glycosylering patronen die kunnen leiden tot verschillen in biologische beschikbaarheid en stabiliteit [20-22]. Onlangs
de ontwikkeling van een nieuw recombinant eiwit vervaardigd uit een kortere polypeptideketen van BMP2 is uitgevoerd met als doel het verbeteren eiwitstabiliteit in vivo. Deze kortere eiwitketen wordt verondersteld dat eiwitvouwing te vergemakkelijken, waardoor potentieel verbeteren van de bioactiviteit van rhBMP2 door verhoging van de halfwaardetijd van het eiwit [23]. Voorafgaand aan dierproeven een volledige karakterisering van deze kortere aminozuursequentie onderzocht op celgedrag in vitro. MC3T3-E1 pre-osteoblasten werden onderzocht op hun reactie op vijf verschillende concentraties rhBMP2_108 zoals 10, 50, 100, 200 en 500 ng /ml en vergeleken met commercieel beschikbare rhBMP2 controle bij een concentratie van 100 ng /ml (R & D Systems ). rhBMP2_108 werd getest op zijn vermogen celrecrutering, celproliferatie, alkalische fosfataseactiviteit, alizarine rood kleuring en mRNA niveaus voor genen coderend alkalische fosfatase, osteocalcine, collageen en een Runx2 induceren, zoals bepaald door real-time PCR.
Methods
rhBMP2_108 aminozuurvolgorde
rhBMP2_108 werd vriendelijk verschaft door Jiuyuan biotechbedrijf (Hangzhou, China). De verkorte aminozuursequentie werd als volgt vervaardigd: MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR een eiwit keten van 108 aminozuren. De commercieel beschikbare BMP2 werd verkregen van R &. D Systems (Minneapolis, USA)
Bereiding van BMP2
Volgens de aminozuursequentie, intracellulaire expressie van rhBMP2_108 in E. coli werd geconstrueerd voor bulk productie van rhBMP2_108 zoals eerder beschreven [24]. Kort samengevat, de sequentie van BMP2 werd opgesteld overeenkomstig zijn aminozuursequentie en vervolgens werd omgekeerd getranscribeerd met reverse transcriptase (Gibco BRL, NY, USA) zoals eerder beschreven [24]. Polymerase kettingreactie (PCR) werd gebruikt om het cDNA dat codeert voor de ingekorte aminozuursequentie rhBMP2_108 eiwit amplificeren. Deze rhBMP2_108 cDNA werd vervolgens gesubkloneerd onder toepassing van een pRSET (A) vector (Invitrogen, VK) de pRSET (A) /rhBMP2_108 expressievector werd verkregen. Vervolgens pRSET (A) /rhBMP2_108 werd verder gebruikt om de E. coli BL21 (DE3) stam te transformeren. Een bioreactor werd vervolgens gebruikt om hoge celdichtheid kweken van E. coli verkregen. In het kort getransformeerde E. coli werd gekweekt in een 5 L fermentor met 3 L van het gedefinieerde medium (batch cultuur, gistextract 1 g /l, pepton 2 g /l) geïnoculeerd met de voorkweek (10% van de partij cultuur volume). Het kweken werd uitgevoerd onder roeren bij 250 rpm gedurende 48 uur bij 30 ° C, waaronder de toevoeging van een voedingsmedium (glucose 33,3 g /L, pepton 10 g /l, gistextract 5 g /l, magnesiumsulfaat
41 g /L, FeSO 48,0 g /L, CaCl 20,048 g /l, ZnSO 40,0176 g /l, CuSO 40,008 g /L). Ondernemingen De gekweekte biomassa werd vervolgens geoogst door breken tweemaal de cellen in een Franse pers en vervolgens gecentrifugeerd. De pellet werd opnieuw gesuspendeerd in 25 mg natgewicht /ml suspensie in een buffer (20 mM Tris-HCl [pH 8,5], 0,5 mMEDTA, 2% [v /v] Triton X-100). De inclusielichamen (pellets) werden opnieuw gesuspendeerd in een oplosbuffer (6Mguanidine-HCl, 0,1 M Tris-HCl [pH 8,5], 0,1 M DTT, 1 mM EDTA) en vervolgens geïncubeerd onder constant roeren bij kamertemperatuur gedurende de nacht. Onoplosbare deeltjes werden vervolgens uit de suspensie door centrifugeren verwijderd.
Een Heparine Sepharose 6 Fast Flow kolom werd vervolgens gebruikt om de actieve rhBMP2_108 (dimeer) zuiveren. Een continue NaCl gradiënt (0,1-1,5 M) werd gebruikt om het gebonden eiwit te elueren. Daarna een getrapte gradiënt NaCl (0,15 M, 0,3 M en 0,5 M) werd gebruikt om te elueren en scheiden de actieve rhBMP2_108 eiwit. Daarna werd rhBMP2_108 poeder bevroren bij -20 ° C. Wanneer gebruikt, werd 0,1% azijnzuur toegepast om de BMP2 poeder oplost. Controle rhBMP2 werd gekocht van R & amp; D Systems (Minneapolis, USA) afgeleid van CHO-cellen.
Tweedimensionaal migratieanalyse
MC3T3-E1 pre-osteoblast cellijn werd gebruikt voor deze studie. Geen menselijke of dierlijke monsters werden gebruikt en dus geen ethische toestemming nodig was. De migratie van cellen assay werd uitgevoerd met een Transwell kamer met een 24-wells plaat en polycarbonaat filters (Transwell Costar, Corning, Acton, MA) met een poriegrootte van 8 pm zoals eerder beschreven [25]. 10 4 MC3T3-E1 cellen in 50 ul DMEM werden gezaaid in het bovenste compartiment. rhBMP2_108 bij concentraties van 0, 10, 50, 100, 200 en 500 ng /ml en controle rhBMP2 bij 100 ng /ml werden gezaaid in het onderste compartiment. Men liet de cellen migreren gedurende 24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO 2 atmosfeer. Het filter werd vervolgens verwijderd, de cellen werden in 4% formaldehyde gefixeerd gedurende 20 minuten en gewassen in PBS, na wasbeurten filters werden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur Methylrosanilnium chlorideoplossing (Wuhan Google biotechnologie vennootschap G1014) en de filters werden gewassen met PBS gedurende 10 minuten. Monsters werden onderzocht door microscopie. Niet-gemigreerde cellen op de bovenzijde werd verwijderd door het spoelen van het filter met koude PBS en schrapen met een wisser. De resterende gemigreerde cellen op de onderzijde van het filter werden geteld in negen willekeurige velden per filter (100 × vergroting). Alle monsters werden in drievoud met 3 onafhankelijke experimenten uitgevoerd.
Proliferatie assay Belgique Om het effect van rhBMP2_108 op de proliferatie van MC3T3-E1, CCK-8 assay voor elke groep onderzoeken werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [26]. Kort samengevat werden cellen gezaaid in 96-well platen met een dichtheid van 5 x 10 3 cellen /putje. Op tijdstippen 1, 3 en 5 dagen, de CCK-8 test werd uitgevoerd door het toevoegen van 10 pi van de CCK-8-oplossing (DOJINDO Molecular Technologies, Inc. Japan) aan elk putje en incubatie gedurende 1,5 uur volgens het protocol van de fabrikant. De absorptie werd gemeten bij λ = 450 nm op een plaatlezer. De resultaten werden aangetoond dat de absorptie van elke experimentele goed minus de dichtheid waarde van de blanco wells optische. Alle monsters werden herhaald in drievoud met drie onafhankelijke experimenten.
Alkalische fosfatase-activiteit
alkalische fosfatase activiteit colorimetrisch werd geanalyseerd met behulp van alkalische fosfatase testkit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Instituut) met behulp van een beginnende seeding dichtheid van 50.000 cellen per 24 goed schotel zoals eerder beschreven [27, 28]. Op tijdstip zeven en 14 dagen werden de cellen driemaal gewassen met PBS en opgelost in 0,1% Triton X-100 (gebufferd in 0,1 mol /L PBS, pH 7,3) bij 4 ° C gedurende 1 uur. Na sonicatie en centrifugeren werd ALP activiteit in het supernatant colorimetrisch bepaald met metingen OD405 /OD562. Totaal eiwit werd gekwantificeerd door BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.). Het ALP-activiteit werd genormaliseerd naar het totale eiwit. Monsters werden in drievoud met drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd.
Real-time PCR
MC3T3-E1 cellen werden geënt bij een dichtheid van 2 x 10 5 en 14 dagen gekweekt zoals eerder is beschreven [26, 28 , 29]. De effecten van rhBMP2_108 bij verschillende concentraties werden onderzocht op vier-osteogene gerelateerde genexpressie waaronder alkalische fosfatase (ALP), collageen I (COL I), runt-gerelateerde transcriptiefactor twee (Runx 2) en osteocalcine (OCN). Totaal RNA werd geëxtraheerd uit MC3T3-E1 cellen door Trizol reagens (TriPure Isolation Reagent, Roche Applied Science, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. De concentratie en kwaliteit van het totale RNA-monsters werd geanalyseerd door Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc.). Complementair DNA werd gesynthetiseerd van 2 ug totaal RNA met behulp RevertAidTm First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) volgens het protocol van de fabrikant. RT-qPCR werd uitgevoerd in 20 gl reacties die 10 pi SYBR Green Master Mix (Roche Applied Science, Duitsland), 0,6 pl (10 uM) van elke voorwaartse en omgekeerde primer voor elk gen van interesse, 2 pi cDNA matrijs en 6,8 uL water. De primer sequenties (Tabel 1) zijn speciaal ontworpen volgens de referentie. Glyceraldehyde-3-fosfaat-dehydrogenase (GAPDH), een referentie-gen, werd gebruikt als controle. Het reactiemengsel werd geanalyseerd met een ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems), en de PCR-amplificatie run voor 40 cycli. Als u specifieke amplicon versterking valideren zonder genomisch DNA besmetting, werd smeltcurve analyse uitgevoerd en de single top verschenen rond de annealing temperatuur. Relatieve expressieniveaus voor elk gewenst gen werden genormaliseerd tegen de Ct-waarde van GAPDH en bepaald met de Delta Ct methode. Alle monsters werden bepaald in drievoud voor drie onafhankelijke studies.Table 1 Primer sequenties voor osteoblastdifferentiatie markers
GAPDH F
GTGAAGGTCGGTGTGAACGG
GAPDH R
TCCTGGAAGATGGTGATGGG
OPN F
GAGGAAACCAGCCAAGGTAAG
OPN R
AAAGCAAATCACTGCCAATCTC
OCN F
GAGGACCATCTTTCTGCTCACT
OCN R
CGGAGTCTGTTCACTACCTTATTG
ALP F
TGTGGAATACGAACTGGATGAG
ALP R
ATAGTGGGAATGCTTGTGTCTG
RUNX2 F
GTGTTCCCTACTCAGCCGTC
RUNX2 R
GAGGCCTCGGTCCACATTAG
alizarinerood kwantificering
Alizarine rood kleuring werd uitgevoerd om de aanwezigheid van extracellulaire matrix mineralisatie vastgesteld na 14 dagen. MC3T3-E1 cellen werden geënt bij een dichtheid van 50.000 cellen per 24 putjes schotel met de verschillende concentraties rhBMP2_108. Na 14 dagen werden de cellen gefixeerd in 96% ethanol gedurende 15 minuten en gekleurd met 2% alizarinerood oplossing in water (pH 4,2) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en gevisualiseerd onder lichtmicroscopie. Daarna werd alizarinerood kwantificering opgelost met behulp van 200 pi 1% cetylpyridiniumchloride (opgelost in dubbel gedestilleerd water) bij kamertemperatuur gedurende 4 uur. Vervolgens werd 100 gl oplossing overgebracht naar 96-well plaat op tekst OD 560.
Statistische analyse Leer Alle data-analyse werd uitgevoerd onder toepassing van GraphPad Prism6.0 software. Normaalverdeling van voorbeeldgegevens werd uitgegaan van de huidige studie en derhalve parametrische tests werden geanalyseerd met ANOVA en statistisch significante waarden p
& lt vastgesteld; 0,05. Gemiddelde en standaardfout (SE) werden geanalyseerd met behulp van one-way ANOVA met een test post hoc met de analyse van Tukey's.
Resultaten
Effect van rhBMP2_108 op celrecrutering
Met het oog op de gevolgen van rhBMP2_108 op celrecrutering onderzoeken een transwell kamer werd gebruikt bij vijf verschillende concentraties rhBMP2_108 (fig. 1). Het bleek dat na 24 uur periode alle concentraties rhBMP2_108 en controle rhBMP2 konden aanzienlijk toenemen celrecrutering van MC3T3-E1 cellen in vergelijking met controlemonsters. Weinig variatie tussen de monsters werd waargenomen blijk van een sterk potentieel voor alle concentraties van rhBMP2_108 naar cel werving induceren (afb. 1). Fig. 1 celrecrutering assay toonde dat alle concentraties van rhBMP2_108 aanzienlijk kunnen MC3T3-E1 celrecrutering verbetering is in vergelijking met controlemonsters zonder rhBMP2 (Schaal bar = 100 urn). Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud met drie onafhankelijke experimenten (n = 9
). Gegevens vertegenwoordigen middelen +/- SEM. ** Geeft alle monsters significant hoger dan controlemonsters, blz Restaurant & lt; 0,01)
Effect van rhBMP2 op celproliferatie
Het effect van rhBMP2_108 onderzocht op vijf concentraties en controle rhBMP2 op het vermogen om celproliferatie te stimuleren in vitro (fig. 2). Het bleek dat MC3T3-E1 cellen toonde zeer vergelijkbaar aantal cellen 1 dag na het zaaien, ongeacht celkweek mediaconcentratie van rhBMP2_108 (afb. 2). Een lichte toename van celaantal werd waargenomen na 3 dagen, echter geen significant verschil worden waargenomen tussen de verschillende behandelingsmodaliteiten (fig. 2). Per 5 dagen na het zaaien, een significante toename van celaantal werd waargenomen voor MC3T3-E1 cellen met alle concentraties van rhBMP2_108 die in deze studie (fig. 2). Interessant genoeg kon geen voordelen te hebben hogere concentraties rhBMP2_108 vergelijking met hun lagere tegenhangers (fig. 2). Fig. 2 Het aantal cellen zoals berekend door een CCK-8 test voor MC3T3-E1 cellen geënt bij verschillende concentraties rhBMP2_108 vergelijking met weefselkweek kunststof (Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud met drie onafhankelijke experimenten (controle n
= 9). Gegevens vertegenwoordigt middelen +/- SEM # geeft controlemonsters aanzienlijk lager dan alle andere behandelingsvormen, blz
. & lt; 0,05)
Effect van rhBMP2 op celdifferentiatie
RhBMP2_108 daarna werd beoordeeld op zijn vermogen om te versnellen osteoblast differentiatie in verschillende concentraties (fig. 3, fig. 4, fig. 5, fig. 6). Eerst bleek dat rhBMP2_108 was aanzienlijk kunnen verhogen ALP activiteit op zeven en 14 dagen na zaaien alle concentraties rhBMP2_108 (fig. 3). Interessant werd waargenomen na 7 dagen dat ALP activiteit was significant hoger bij rhBMP2_108 concentraties van 50, 100 en 200 ng /ml vergeleken met controlemonsters (fig. 3). Op 14 dagen, alle behandelingsmodaliteiten ontvangen rhBMP2_108 bij verschillende concentraties toonde een duidelijke 16-voudige toename van ALP-activiteit in vergelijking met controlemonsters leegte van rhBMP2_108 (fig. 3). Fig. 3 ALP activiteit werd significant verhoogd zeven en 14 dagen na zaaien voor monsters geënt met rhBMP2_108 vergelijking met weefselkweekkunststof alleen controle (Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud met drie onafhankelijke experimenten (n = 9
). Gegevens vertegenwoordigt gemiddelde ± . /- SEM * geeft significant verschil tussen 500 ng /ml en 10 ng /ml rhBMP2, blz
& lt; 0,05; ** geeft significant hoger dan alle andere modaliteiten, blz
& lt; 0,05, # geeft controlemonsters aanzienlijk lager dan alle andere behandelingsvormen, blz Restaurant & lt; 0,05)
Fig. 4 mRNA niveaus van (a) ALP, (b) OCN, (c) COL-1 en (d) Runx2 voor MC3T3-E1 cellen geënt bij verschillende concentraties rhBMP2_108 (Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud met drie onafhankelijke experimenten (n < . br> = 9) gegevens vertegenwoordigt middelen +/- SEM * geeft p
. & lt; 0,05; ** geeft significant hoger dan alle andere modaliteiten, blz Restaurant & lt; 0,05, # geeft controlemonsters aanzienlijk lager dan alle andere behandelingen, blz Restaurant & lt; 0,05)
Fig. 5 Kwalitatieve analyse van alizarinerood kleuring aangetoond van de mineralisatie voor MC3T3-E1 cellen bij toenemende concentraties van rhBMP2_108 14 dagen na het zaaien
Fig. 6 Kwantitatieve analyse van alizarinerood kleuring. rhBMP2_108 aantonen dat er een concentratie-afhankelijke stijging van alizarinerood kleuring (Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud met drie onafhankelijke experimenten (n
= 9). De gegevens vertegenwoordigt middelen +/- SEM. * Geeft significant verschil tussen de twee groepen, p
& lt; 0,05; ** geeft significant hoger dan alle andere modaliteiten, blz Restaurant & lt; 0,05, # geeft controlemonsters aanzienlijk lager dan alle andere behandelingsvormen, blz Restaurant & lt; 0,05)
dan MC3T3-E1 cellen werden onderzocht op mRNA-niveaus door real-time PCR voor genen die coderen voor ALP, OCN, COL-1 en Runx2 bij verschillende concentraties rhBMP2_108 (fig. 4). Voor gen coderend Runx2, tot vijfvoudige toename werd waargenomen bij een concentratie van 500 ng /ml vergeleken met controlemonsters met een significante verhoging bij 100 en 200 ng /ml in vergelijking met lagere concentraties (Fig. 4a). Evenzo COL-1 toonde ook concentratieafhankelijke toename van genexpressie (Fig. 4b). Hier echter slechts tot een tweevoudige toename werd waargenomen ten opzichte van de monsters te controleren (afb. 4b). Waargenomen werd dat mRNA niveaus van ALP was dan vijfvoudig verhoogd met 14 dagen bij concentraties van tien en 50 ng /ml rhBMP2_108 terwijl bij een concentratie van 100 en 200 ng /ml 20-voudige toename van de ALP-activiteit (Fig. 4c). De hoogste concentratie van 500 ng /ml vertoonden een 40-voudige toename van ALP-activiteit in vergelijking met kweekmedium zonder rhBMP2 (fig. 4c). De grootste voudige verandering werd waargenomen in OCN niveaus waar tot 300 voudige verhoging waargenomen in vergelijking met de respectievelijke controle zonder rhBMP2 (fig. 4d).
Tenslotte werd alizarine rood kleuring voor het visualiseren in vitro mineralisatie (Fig. 5). Waargenomen werd dat zonder rhBMP2, MC3T3-E1 pre-osteoblasten konden geen visuele mineralisatie genereren waargenomen met alizarine rood kleuring (fig. 5). De effecten van rhBMP2_108 blijkt aanzienlijk concentratieafhankelijke toename alizarinerood kleuring 14 dagen na zaaien
(fig. 6). Discussie
Het doel van deze studie was om de bioactiviteit van een kortere recombinant BMP2 onderzoeken (rhBMP2_108 ) volgorde op osteoblast gedrag. Het gebruik van rhBMP2 voor orthopedische en tandheelkundige behandelingen is gebruikt voor een aantal procedures, zoals open breuken, heup reconstructieve chirurgie en geleide botregeneratie procedures tandtechnisch [30-33]. Ondanks tonen veelbelovende resultaten in vivo, heeft groeifactor gebruik een mix van succes gehad wanneer deze gebruikt worden voor klinisch gebruik. Enkele van de belangrijkste bezwaren met betrekking tot groeifactor gebruik is hun voorbijgaande bioactiviteit die is voorgesteld kon om in de orde van minuten tot uren [18].
Er zijn drie belangrijke gebieden van onderzoek ter verbetering van de bioactiviteit van groeifactoren; 1) toepassing van gentherapie, 2) het verbeteren eiwitstabiliteit of 3) het verbeteren van de groeifactor afgiftesysteem. Een methode die vroege belofte voor groeifactor levering heeft aangetoond dat gentherapie waar het gebruik van virale vectoren zoals adenovirus kan vele beperkingen eiwit levering omzeilen door vertoont een hoge in vivo transductie efficiëntie met een relatief korte expressieperiode [34 -38]. Hun voornaamste voordeel is de overexpressie gebracht eiwit wordt geconstrueerd in de organismen belangrijkste cel en heeft dus toegang tot een veelheid van vouwen eiwitten die in staat nauwkeurig verpakken en afleveren groeifactoren aan hun omringende weefsels [25, 39, 40]. Ondanks de vooruitgang op dit gebied van het onderzoek, wordt het gebruik van gentherapie nog steeds verboden door de FDA het maken van de toekomst klinisch gebruik op het moment dat een toekomst optimistische benadering zonder bekende tijdschema voor de uiteindelijke gebruik. Bovendien hebben recente strategieën gebruik korte synthetische peptiden nabootsen BMP2 aangetoond voor botherstel [41-44], maar een gebrek aan klinische rapporten toepassen van dergelijke strategieën ontbreekt nog vergemakkelijken.
Zo wordt het essentieel om alternatieve methoden die kunnen vinden geschikt voor verbetering groeifactor bioactiviteit beschouwd. In deze studie, een nieuwe recombinante versie van BMP2 (rhBMP2_108) met een korte aminozuursequentie. Voorafgaand aan dierproeven echter in vitro testen werd uitgevoerd op celactiviteit. Het werd gevonden in de huidige studie dat r rhBMP2_108 was in de eerste plaats in staat om de aanwerving van voorlopercellen te richten door begunstiging van vroege en snelle rekrutering van cellen binnen 24 uur (fig. 1). De homing van progenitorcellen en stamcellen is een van de belangrijkste beginfase in de vroege fase van fractuurherstel en is een noodzakelijk onderdeel van wondgenezing van bot-defecten. Als zodanig is de mogelijkheid voor rhBMP2_108 het versnellen van de snelheid en het aantal stamcellen gebreken sites is van cruciaal belang voor botherstel.
Hoewel de effecten zoals gezien in de huidige studie aangetoond dat rhBMP2_108 was significant in staat om celproliferatie te induceren, is het werd niet waargenomen in een concentratie afhankelijke wijze. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat cellen celdifferentiatie ondergaan zijn niet gevoelig voor gelijktijdig vermenigvuldigen. Hoewel niet veel afhankelijk van de concentratie waarnemingen werden gevonden voor celrecrutering of proliferatie, werden significante verschillen gevonden voor osteoblastdifferentiatie in reactie op rhBMP2_108. Werd waargenomen dat op een viervoudige toename van ALP activiteit werden gedetecteerd met rhBMP2_108 en verdere concentratie afhankelijke toename in alizarine rood kleuring verder gevalideerd onze hypothese dat rhBMP2_108 werkt voornamelijk door het stimuleren van osteoblast differentiatie. Ook werd waargenomen dat een aanzienlijke toename van mRNA-niveaus van ALP werd waargenomen bij een concentratie afhankelijke wijze. Interessant OCN, een late differentiatiemerker voor osteoblasten werd opgereguleerd ongeveer 300-voudig in vergelijking met controlemonsters (fig. 4b). Deze bevinding geeft aan dat waarschijnlijk de MC3T3-E1 pre-osteoblasten uitgezaaid in controleputjes zonder rhBMP2 waarschijnlijk bleef voorlopercellen en niet differentiëren tot de osteoblast lineage in de loop van deze experimenten. Dit wordt verder duidelijk door het feit dat de monsters zonder rhBMP2 toonde geen mineralisatie potentieel in de alizarinerood experimenten (fig. 5).
Hoewel de resultaten van dit onderzoek bevestigen de effecten van deze kortere aminozuursequentie van rhBMP2_108 on cell activiteit blijft veel onderzoek nodig om deze bevindingen te valideren in een diermodel voorafgaand aan klinische testen. Het blijft nagenoeg onbekend of de eiwitactiviteit in vivo wordt beïnvloed door de verkorte aminozuursequentie en veel toekomstig onderzoek onderzoekt deze relatie zowel wat duur halfwaardetijd eiwit en de daaropvolgende effecten op botvorming moeten zorgvuldig geëvalueerd. Bovendien zijn relatie tot leidende rhBMP2 momenteel op de markt FDA goedkeuring moet ook een beter begrip van de effecten van eiwitten aminozuurlengte op bioactiviteit van recombinant eiwitten verschaffen.
Conclusie De resultaten van deze studie aantonen dat een kortere aminozuursequentie van recombinante BMP2 (rhBMP2_108) behoudt bioactieve eigenschappen van BMP2 vergeleken met commercieel beschikbare rhBMP2 in vitro. Aangetoond werd dat rhBMP2_108 kon snel celrecrutering van MC3T3-E1 pre-osteoblasten bevordert en ondersteunt hun differentiatie naar de osteoblast lineage in een concentratie afhankelijke wijze. Toekomstig onderzoek in vivo analyse van het gebruik van de aminozuursequentie van rhBMP2_108 nu noodzakelijk kritisch-sized botdefecten. Verder onderzoek naar de optimale afgiftesysteem deze groeifactor zijn nodig om mogelijk verder de bioactiviteit voor klinisch gebruik verbeteren
Afkortingen
rhBMP2:.
Recombinant bot morfogenetische eiwit 2
rhBMP2_108:
Korte polypetitde keten van 108 aminozuren voor recombinant bot morfogenetische proteïnen twee
ALP:
alkalische fosfatase
OCN:
osteocalcine
COL-1:
collageen 1
Runx2:
runt- gerelateerde transcriptiefactor twee
GAPDH:
glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase
FDA:
food and drug Administration
CHO:
Chinese hamster ovarium
PCR:
polymerase chain reaction
PBS :
fosfaat gebufferde oplossing
HCl:
zoutzuur
EDTA:
ethyleendiaminetetraazijnzuur
NaCl:
natriumchloride
DMEM:
Dulbecco's gemodificeerd eagle medium
BCA:
bicinchoninezuur
OD:
pptical dichtheid
SE:
standaardfout
verklaringen
Dankwoord
Dit project werd ondersteund door het Programma voor New Century Excellent talents in University (NCET-11-0414), Excellent Youth Foundation van Hubei en de fondsen van de National Natural Science Foundation of China (81.271.108).
Open AccessThis artikel wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http:. //creativecommons org /licenties /door /4. 0 /), die onbeperkt gebruik mogelijk maakt, distributie en reproductie in elke vorm, mits u de juiste krediet aan de oorspronkelijke auteur (s) en de bron te geven, een link naar de Creative Commons-licentie, en aangeven of wijzigingen zijn aangebracht. De Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http:. //Creativecommons org /publicdomain /zero /1 0 /) van toepassing op de ter beschikking gestelde in dit artikel, tenzij anders vermeld data
Competing.
