Abstract achtergrond
Protease-geactiveerde receptoren (PARs) zijn G-proteïne gekoppelde receptoren met een actieve rol in het mediëren van ontsteking, pijn en andere functies. De mondelinge pathogeen Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
) scheidt proteases dat PAR's te activeren. Het doel van deze studie was de rol van PAR's in de pathogenese van chronische periodontitis door expressie analyse van PAR's in humane gingivale epitheelcellen (GSC) voor en na P. gingivalis
supernatanten behandeling helderen.
Methods
GSC werden geïsoleerd uit gezonde menselijke gingivale weefselmonsters. De expressie van PAR in GSC werd bepaald door omgekeerde transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) en flowcytometrie. Het effect van P. gingivalis
proteasen werd onderzocht met kwantitatieve real-time reverse transcriptie polymerase kettingreactie (QRT-PCR) en flowcytometrie.
Resultaten
PAR-1, PAR-2, en PAR-3 werden uitgedrukt in GSC. PAR-4 werd niet gevonden door zowel RT-PCR en flowcytometrie. Analyse van genexpressie met behulp QRT-PCR toonde een opregulatie van PAR-2 mRNA in vergelijking met de onbehandelde controlecellen (P
& lt; 0,05). In tegenstelling, het mRNA uitingen van PAR-1 en PAR-3 significant neerwaarts gereguleerd (P
& gt; 0,05) in reactie op P. gingivalis
supernatant vergeleken met die in niet-gestimuleerde controlecellen. Dit effect werd ingetrokken door de proteaseremmer TLCK (P Restaurant & lt; 0,05). De resultaten van flowcytometrie aangegeven PAR eiwit niveau dat in overeenstemming met mRNA niveaus in de resultaten van de QRT-PCR.
Conclusies
Onze studie toont aan dat PAR-1, PAR-2 en PAR-3 worden uitgedrukt in GSC. P. gingivalis
proteasen spelen een rol in de regulatie van de aangeboren immuunrespons bij GSC. GSC gebruiken PAR om P. gingivalis
herkennen en te bemiddelen cel reacties die betrokken zijn bij aangeboren immuniteit.
Trefwoorden
protease-activated receptor Human tandvlees epitheelcellen Porphyromonas gingivalis P
roteases Achtergrond
Protease-geactiveerde receptoren (PAR) zijn een subfamilie van G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR) met vier leden, PAR-1, PAR-2, PAR-3 en PAR-4, die cruciale rol in hemostase, trombose, embryonale ontwikkeling, wondgenezing spelen, ontstekingen en kanker progressie [1]. De activering van PAR's gebeurt door een uniek mechanisme dat proteolytische splitsing van het N-terminale extracellulaire sequentie betrokken door een protease. Deze splitsing ontmaskert een nieuwe N-terminale sequentie, die als een gebonden ligand die bindt aan de receptor meerdere signalering cascades [2-4] initiëren. Hoewel ze hetzelfde werkingsmechanisme delen, is aangetoond dat verschillende PAR's worden gekenmerkt door verschillende distributies en biologische werkingen en kan worden geactiveerd door verschillende proteasen [5]. Trombine is een belangrijke activator van PAR-1, PAR-2 en PAR-3. Andere belangrijke activatoren van PAR-1 omvatten geactiveerde proteïne C (APC) en matrix metalloproteïnase-1 (MMP-1); terwijl trypsine en menselijke mestceltryptase activeren PAR-2 en trypsine en cathepsine G activeren PAR-4. Qua opwekken stroomafwaartse signalering reacties, PAR-1, PAR-2 en PAR-4 autonoom signaal, terwijl PAR-3 voornamelijk als een co-receptor voor PAR-1 en PAR-4 [6-9] is. Zoals PAR uitgedrukt in diverse celtypen, werd recent gesuggereerd dat ze een belangrijke rol in fysiologische processen zoals groei, ontwikkeling, ontsteking, weefselherstel en pijn speelt. Ondernemingen De gingival epitheel is steeds bekend als regulator van de orale aangeboren immuunrespons op verschillende beledigingen, zoals bacteriën en chemicaliën. Human tandvlees epitheelcellen (GSC), waarin de belangrijkste factoren van aangeboren immuniteit zijn, niet alleen een belangrijke rol spelen bij het handhaven van de fysieke barrière tussen de host en het milieu, maar ook actief deelnemen aan het weefsel aangeboren immuniteit [10, 11] door specifiek uiten van bepaalde receptoren die zijn betrokken bij de immuunrespons van de gastheer. Het is algemeen aanvaard dat cellen gebruik maken van patroonherkenning receptoren om bacteriën te identificeren in hun omgeving [12, 13]; echter bovendien bepaalde pathogenen, zoals Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
), scheiden proteasen die door cellen worden opgenomen via de familie van PAR's [14]. PAR's is bekend dat ze worden uitgedrukt in het epitheel van gingiva en zijn betrokken bij de pathogenese van parodontitis [15-18].
Parodontitis is een chronische besmettelijke ziekte die begint ontsteking van de periodontale weefsels en uiteindelijk veroorzaakt resorptie van alveolaire bot gevolgd tandverlies. P. gingivalis
is een belangrijke verwekker van chronische parodontitis. Deze bacterie produceert en brengt een groot aantal proteolytische enzymen. Trypsine-achtige proteasen, genaamd gingipains, geproduceerd door P. gingivalis
Aangetoond is belangrijk ziekteverwekkers [19, 20] handelen. Recentelijk is aangetoond dat gingipains door cellen worden opgenomen via de familie van PARs, die betrokken zijn bij ontstekingsprocessen in meerdere weefsels. De precieze rol van de PAR in gingiva en het belang van specifieke PAR's in de pathogenese van parodontitis nog worden opgehelderd. In deze studie, reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (RT-PCR) werd gebruikt om de mRNA niveaus van PAR onderzoeken en flowcytometrie werd gebruikt om de eiwitniveaus van PAR in GSC onderzoeken. Bovendien zijn de kwantitatieve real-time RT-PCR (QRT-PCR) werd gebruikt om de mRNA niveaus van PAR's in reactie op celvrije supernatant van P. gingivalis
teneinde de rollen van de afgescheiden proteasen bevestigen onderzoeken.
Methods
gingival epitheliale celkweek
primaire humane GSC werden geïsoleerd uit gezonde menselijke gingivale weefselmonsters van patiënten die een derde molaar extractie bij de Dental Department, Sir Run Run Shaw Ziekenhuis, School of Medicine, Zhejiang University, China. Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle personen die deelnemen aan deze studie. De studie werden geëvalueerd en door de ethische commissie van de Affiliated Sir Run Run Show ziekenhuis van Zhejiang University School of Medicine (20131120) goedgekeurd. Verse tandvlees werd in D-Hanks bevattende 300 U /ml penicilline G en 300 ug /ml streptomycine en geïncubeerd bij 4 ° C. Binnen 1 uur, weefsel bereid was epitheelcellen verkrijgen. In het kort werd het weefsel in kleine stukjes (1 mm x 1 mm), behandeld met een oplossing van 25% Dispase II (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en gedurende 18 uur bij 4 ° C. Na incubatie werd de epidermale laag van menselijke keratinocyten uit de dermis opgetild en geplaatst in een 15 ml steriele centrifugebuis die 2 ml trypsine-EDTA. Het weefsel werd gedurende ongeveer 10 minuten geïncubeerd bij 37 ° C. Vervolgens werden geïsoleerd GSC gezaaid in T-75 kolven (BD Biosciences) bij een celdichtheid van ongeveer 3 x 10
6 cellen per kolf op 10-15 ml serumvrij medium keratinocyten (keratinocyt-SFM) waaraan supplementen waren toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, USA). Vloeistoffen in de kolven vervangen door verse compleet medium en belucht met 5% CO 2 om de 2-3 dagen. Cellen werden gepasseerd bij 75-80% confluentie werd bereikt.
Omgekeerde transcriptie-PCR-analyse (RT-PCR) voor de bepaling van PAR expressie Belgique Om de expressie van mRNA PARs onderzoeken, werd totaal RNA geïsoleerd uit GSC (volwassen tot 70% confluentie) met behulp TRIzol® reagens (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, USA) volgens de gesuggereerde protocol van de fabrikant. De synthese van de eerste cDNA-streng en RT-PCR werd uitgevoerd met een PromeScript® RT-PCR Kit (Takara Biotechnology Co., Ltd, Dalian, China). De primers voor PAR-1, PAR-2, PAR-3, PAR-4 en β-actine werden gesynthetiseerd door Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, China, Tabel 1). Voor amplificatie van PAR-1, PAR-2 en β-actine producten, werd PCR uitgevoerd voor 30 cycli. De eerste cyclus bevatte een denaturatiestap van 5 min bij 94 ° C. Cycli 2-30 had een denaturatiestap van 30 s bij 94 ° C, 30 s annealen bij 60 ° C en 45 s elongatie bij 72 ° C. De laatste cyclus omvatte een verlengingsstap van 10 minuten bij 72 ° C. Voor PAR-3 en PAR-4 amplificatie, werd PCR uitgevoerd voor 30 cycli. De eerste cyclus bevatte een denaturatiestap van 5 min bij 94 ° C. Cycli 2-30 had een denaturatiestap van 30 s bij 94 ° C, 30 s annealen bij 65 ° C en 45 s elongatie bij 72 ° C. De laatste cyclus omvatte een verlengingsstap van 10 minuten bij 72 ° C. DNA producten en molecuulgewichtmerker DL1,000 ™ DNA Marker (Takara Biotechnology Co., Ltd, Dalian, China) werd gescheiden in 1,5% agarose gel, waarna de gels werden gekleurd met GelRed ™ en gevisualiseerd onder UV light.Table 1 Oligonucleotide die worden gebruikt voor de RT-PCR
primers
oligonucleotidesequentie
Lengte (bp)
Sense (5 'naar 3')
Antisense (5 'naar 3')
PAR-1
CCCGCAGGCCAGAATCAAA
AAAGGGGAGCACAGACACAAACAG
395
PAR-2
CTACTCAGATGACCCCAGAAACT
CCCAAAGTGCTAGGATTACAGG
399
PAR-3
GGCTGGACAGGAGCCACGAT
AGCGGTTGATGCTGATGCAGG
403
PAR-4
GGATCGCCTACCACCTGCGTG
CCCGTAGCACAGCAGCATGG
401
β-actin
AGGGGCCGGACTCGTCATACT
GGCGGCAACACCATGTACCCT
202
Bacteriekweek en supernatanten verzameling
P. gingivalis
ATCC 33277 werd verkregen van de American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) en anaëroob gekweekt (80% N 2, 10% H 2 en 10% CO 2) in een hersen-hart infusie (BHI, Oxoid) agarplaat bevattende 5% gedefibrineerd schapenbloed verrijkt met 5 g /l gistextract, 5 mg /l hemine en 10 mg /l menadion (Sigma -Aldrich, Dorset, UK) bij 37 ° C gedurende maximaal 5 weken. Vloeibare kweken werden bereid door inoculatie van bacteriële kolonies (3-4 dagen oud) uit bloed agar platen in 10 ml BHI bouillon, aangevuld met 5 g /l gistextract, 5 mg /l hemine en 10 mg /l menadion en gedurende 24 uur . Tien procent inoculum werd overgebracht in 90 ml van hetzelfde medium en gedurende 6 dagen. Na deze kweekperiode werden de bacteriën geoogst door centrifugatie bij 10.000 g
gedurende 15 min bij 4 ° C en de supernatanten werden verzameld, steriel gefiltreerd over een 0,2 mm filter en opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. Voorafgaand aan de behandeling werden aliquots van het supernatant gebruikt voor pre-incubatie (10 min) met 1 mmol /l van de serine en cysteine protease remmer tosyl-L-lysine chloormethylketon (TLCK; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), die gingipains [15, 21].
Karakterisering van bacteriële kweeksupernatanten en behandeling
P. gingivalis
supernatanten in celkweekmedium verdund en de concentratie uitgedrukt als de som bacterieel eiwit (mg /ml) aanwezig remt in de celkweken. De eiwitconcentratie werd bepaald met BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). De absorptie werd gemeten bij 562 nm op een SpectraMax® Plus plaat lezer. Proteaseactiviteit werd gemeten met een Protease Assay Kit ™ (G-Biosciences, St Louis, MO, USA) [22]. De absorptie van de kleurstof gemerkte peptide werd gemeten bij 570 nm voor het bepalen van de proteaseactiviteit. Chemisch gestabiliseerd trypsine (MSG-trypsine ™) werd geleverd bij de kit als algemene standaard protease. GSC werden gekweekt tot 80% confluentie en gestimuleerd met hetzij 50 ug /ml kweeksupernatant eiwit van P. gingivalis
supernatanten of TLCK-supernatanten geïncubeerd, gedurende 6 h [22]. Ongestimuleerde GEC medium diende als een controle voor de stimulatie experimenten. Elke stimulatie-experiment werd in drievoud uitgevoerd en cellen twee tot vijf verschillende donoren werden getest.
Kwantitatieve real-time RT-PCR (QRT-PCR)
Na stimulatie werd totaal RNA geëxtraheerd onder toepassing van een RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) en reverse getranscribeerd met een SuperScript® RT-PCR Kit (Takara, Tokyo, Japan). Kwantitatieve real-time RT-PCR werd uitgevoerd met het Applied Biosystems 7500 PCR machine en SYBR Premix Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. PCRs werden uitgevoerd in 96-well platen uitgevoerd in een totaal volume van 20 pi, inclusief 1 pi cDNA en 0,8 pl primers (10 uM; Tabel 2). Monster expressie werd genormaliseerd tegen die van het huishoud-gen β-actine, die werd opgenomen in elke QPCR run. PCR-controles werden uitgevoerd onder toepassing van water in plaats van cDNA. Alle reacties werden in duplo uitgevoerd. Op elk tijdstip werden de uitingen van het geselecteerde mRNA's in cellen geïncubeerd met P. gingivalis
supernatanten of TLCK-gepreïncubeerd supernatanten berekend op de housekeeping gen β-actine (ΔC
t) voor elk monster en uitgedrukt in verhouding tot onbehandelde cellen op hetzelfde tijdstip via de 2 -ΔΔC
t methode [23] .table 2 Oligonucleotidesequenties gebruikt QRT-PCR
genproduct
Oligonucleotide opeenvolging
Sense (5 'naar 3')
Antisense (5 ' 3’)
PAR-1
GTGATTGGCAGTTTGGGTCT
GCCAGACAAGTGAAGGAAGC
PAR-2
CCTGGCCATGTACCTGATCT
GACACTTCGGCAAAGGAGAG
PAR-3
GGTGTGGGCAACAGTTTTCT
GGACTCGCAAGTGTTGTGAA
β-actin
AGGGGCCGGACTCGTCATACT
GGCGGCAACACCATGTACCCT
Flowcytometrie
cellen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) werden gewassen, gedurende 30 minuten bij 4 ° C met PBS dat 20% door warmte geïnactiveerd normaal humaan serum, opnieuw gewassen en daarna gedurende 30 minuten bij 4 ° C met 15 nM van specifieke monoklonale antilichamen (mAb) aan humane PAR-1-4 (PE-geconjugeerd; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). Flowcytometrie analyses werden uitgevoerd op een FACScan (BD Biosciences, San Jose ., CA, USA) controle cellen geïncubeerd met PE-geconjugeerde-specifieke antilichamen verkregen uit dezelfde fabrikanten werden gebruikt om de drempelwaarde voor de parameter fluorescentie, zodat de fractie van cellen met positieve fluorescentie was & lt vastgesteld, 2,5% van de totale cellen. het percentage PAR-1-4 positieve cellen werd bepaald uit de fractie van cellen in het monster geïncubeerd met specifieke antilichamen die de drempel voor de fluorescentie-intensiteit van het signaal verkregen met het controlemonster overschreden.
Statistische analyses Leer Alle gegevens weergegeven als het gemiddelde ± de standaardafwijkingen (SD). QRT-PCR gegevens worden uitgedrukt als C
t (cyclus drempelwaarde), ΔC
t (C
t PAR mRNA - C
t β- actine mRNA) en relatieve kwantificatie (RQ; uitgedrukt als fold change). De vouw veranderingen van de PAR's mRNA expressie werden berekend met behulp van de 2 -ΔΔC
t methode [23]. Student's t-test
werd gebruikt voor vergelijking tussen de twee groepen. SPSS versie 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) werd gebruikt voor statistische analyse en P
≤ 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
RT-PCR analyse van PAR in GSC
RT -PCR analyse van RNA geëxtraheerd uit GSC onthulde de aanwezigheid van PAR-1, PAR-2 en PAR-3 mRNA (fig. 1). Geen PCR product bleek voor PAR-4 (Fig. 1). Het resultaat laat zien dat PAR-1, PAR-2 en PAR-3 worden uitgedrukt in GSC, maar PAR-4 niet. Fig. 1 RT-PCR analyse van mRNA in PAR GSC. RT-PCR werd uitgevoerd onder toepassing van de voor elk type PAR primers, zoals beschreven in Tabel 1. De PCR-producten werden onderworpen aan elektroforese door een 1,5% agarosegel. Lijnen 1-6 vertegenwoordigen β-actine, PAR-4, PAR-3, PAR-2, PAR-1 en Marker afzonderlijk. RT-PCR-analyse onthulde de aanwezigheid van PAR-1, PAR-2 en PAR-3 mRNA in GSC. Geen PCR product bleek voor PAR-4
P. gingivalis
supernatant verandert PAR genexpressie
De proteolytische activiteit van het supernatant van P. gingivalis
werd aangetoond na 4, 8 en 16 uur. Voorincubatie van de supernatant met de proteaseremmer TLCK vertoonden significant verminderde proteolytische activiteit in vergelijking met die in natief supernatant na 4 en 8 uur (P
& lt; 0,05; fig. 2). Om het effect van de P. gingivalis
supernatant op expressie van PAR-1 evalueren, PAR-2 en PAR-3 mRNA, GSC werden gekweekt tot 80% confluentie en gestimuleerd met supernatans van 6 uur. Analyse van genexpressie met behulp QRT-PCR vertoonde opregeling van PAR-2 mRNA in vergelijking met onbehandelde controlecellen (P
& lt; 0,05; fig. 3b). Daarentegen werden de mRNA blijken van PAR-1 en PAR-3 significant neerwaarts gereguleerd (P
& lt; 0,05) in reactie op P. gingivalis
supernatant vergeleken met die van niet-gestimuleerde controlecellen (fig. 3a, c) . Voorincubatie van het P. gingivalis
supernatant met proteaseremmer TLCK schafte de werking en herstelde de PAR mRNA expressie met die van onbehandelde cellen. Controles vast met behulp van lege bacteriële medium en TLCK vertoonde geen effect op de mRNA expressie van PAR-1, PAR-2 en PAR-3 (fig. 3). De resultaten waren in overeenstemming met eerdere studies [22]. Fig. 2 De protease-activiteiten van P. gingivalis
bovendrijvende of TLCK-gepreïncubeerde supernatant. Proteaseactiviteit werd gemeten met een Protease Assay Kit ™ en werd gedurende 4, 8 en 16 uur. De absorptie van de kleurstof gemerkte peptide werd gemeten bij 570 nm voor het bepalen van de proteaseactiviteit. Inheemse supernatant toonde significant hogere proteolytische activiteit dan TLCK-gepreïncubeerd supernatant na 4 en 8 uur. Triplo werden uitgevoerd. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van de standaarddeviatie (gemiddelde ± SD). *, P Restaurant & lt; 0,05, in vergelijking met autochtone bovenstaande waarden
Fig. 3 PAR-1 (a), PAR-2 (b) en PAR-3 (c) genexpressie in respons op P. gingivalis
supernatant. PAR genexpressie beoordeeld door kwantitatieve real-time RT-PCR (QRT-PCR) als reactie op celvrije supernatant van P. gingivalis Kopen en TLCK-gepreïncubeerde supernatant GSC. Na P. gingivalis
supernatant behandeling, werd de expressie van PAR-2 opgereguleerd in vergelijking met onbehandelde controle cellen. Omgekeerd werd PAR-1 en PAR-3 expressie significant neerwaarts gereguleerd. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van de standaarddeviatie (gemiddelde ± SD). *, P Restaurant & lt; 0,05, vergeleken met de controlewaarden. Controle: zonder supernatant stimulatie. P. gingivalis
S: P. gingivalis
bovendrijvende
Pars eiwitexpressie beoordeeld door flowcytometrie
Flowcytometrie toonde eiwit expressie van PAR-1, PAR-2 en PAR-3 door GSC, maar geen PAR-4 expressie (Fig. 4). Na P. gingivalis
supernatant behandeling van 6 uur werd de eiwitexpressie van PAR-2 opgereguleerd in vergelijking met onbehandelde controlecellen (P
& lt; 0,05; fig. 5). Omgekeerd werden de eiwitniveaus van PAR-1 en PAR-3 significant neerwaarts gereguleerd na behandeling (P
& lt; 0,05). De resultaten van flowcytometrie aangegeven PAR eiwitniveaus overeenstemming met mRNA niveaus in de resultaten van QRT-PCR. Fig. 4 Eiwit niveau van de PAR in GSC door flowcytometrie. a, b, c en d tonen representatieve resultaten van de flow cytometrische analyses van PAR-1, PAR-2, 3-PAR en PAR-4 respectievelijk. Het resultaat toonde GSC expressie PAR-1, PAR-2 en PAR-3, maar niet PAR-4. Zwarte lijn: isotype controle. Groene lijn: anti-PAR
Fig. 5 PAR-1 (a), PAR-2 (b) en PAR-3 (c) eiwitexpressie als reactie op P. gingivalis
supernatant. PAR expressie werd beoordeeld door flowcytometrie als reactie op celvrije supernatant van P. gingivalis Kopen en TLCK-gepreïncubeerde supernatant GSC. Flowcytometrie analyses werden uitgevoerd op een FACScan. Na P. gingivalis
supernatant behandeling van 6 uur werd de expressie van PAR-2 opgereguleerd in vergelijking met onbehandelde controle cellen. Daarentegen werd PAR-1 en PAR-3 expressie significant neerwaarts gereguleerd na behandeling. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van de standaarddeviatie (gemiddelde ± SD). *, P Restaurant & lt; 0,05, vergeleken met de controlewaarden. Controle: zonder supernatant stimulatie. P. gingivalis
S: P. gingivalis
bovendrijvende
Discussion
Parodontitis is een infectie van parodontale weefsels die de ondersteunende structuur voor de tanden. In de complexe structuur van periodontale weefsels, wordt tandvlees epitheel directe blootstelling aan parodontale bacteriën en hun producten, door het ontvangen en verzenden van signalen, speelt een belangrijke rol in de totale dialoog die optreedt tussen pathogenen en de gastheer. PAR expressie en functie GSC als deel van de immuno-bewakingssysteem. Deze receptoren zijn duidelijk belangrijk GSC reacties op het milieu die kunnen pathogene of fysiologisch producten.
Vier PAR familieleden (PAR-1, -2, -3, en -4) zijn tot dusver geïdentificeerd. In deze studie hebben we laten zien dat PAR-1, PAR-2 en PAR-3 worden uitgedrukt in GSC, maar PAR-4 wordt niet uitgedrukt in GSC. Veel onderzoekers hebben al gemeld de expressie van PAR's in een grote verscheidenheid aan celtypen, terwijl er controverse over de expressie van PAR [2, 3, 13, 17]. Er zijn ook enkele studies over de expressie van de PAR in GSC, maar de meeste studies waren bezorgd op de expressie en de rollen van PAR-2. Overexpressie van PAR-2 is positief geassocieerd met inflammatoire klinische parameters en het niveau van interleukine-6 (IL-6), IL-8, tumor necrose factor alpha, matrix metalloprotease-2 (MMP-2), MMP-8, hepatocyt groeifactor en vasculaire endotheliale groeifactor [5, 24, 25]. Slechts één onderzoek vond PAR-1, PAR-2 en PAR-3 expressie in KB cellen door RT-PCR en PAR-1, PAR-2 en PAR-3 expressie in GSC door immunohistochemische studies [17]. In onze studie, RT-PCR en flowcytometrie werden gebruikt om de expressie van PAR's te analyseren. De resultaten werden bevestigd de PAR-1, PAR-2 en PAR-3-expressie in GSC.
In tandvlees epitheel, arginine-specifieke cysteïne proteases (Arg-gingipain, Rgp) van P. gingivalis
, een belangrijke ziekteverwekker geassocieerd met chronische periodontitis, PAR activeren en expressie van inflammatoire cytokines [22, 26, 27] induceren. De PAR familie structureel niet verwant aan de patroonherkenning receptoren (PRR) maar, zoals PRRS signaleren ze potentieel gevaar in het milieu door het activeren aangeboren immuunsysteem markers en ontstekingsreacties [28]. Er is echter weinig bekend over de functie wanneer ze worden geactiveerd door de agonist enzymen, trombine en trypsine en trypsine-achtige enzymen, in gingival epitheel. PAR worden uitgedrukt door een grote verscheidenheid aan celtypen en voorgesteld belangrijke rol spelen in de fysiologische processen zoals groei, ontwikkeling, ontsteking, pijn en weefselherstel [29]. De studie toonde aan dat de expressie van PAR-2 werd opgereguleerd met P. gingivalis
supernatant behandeling in vergelijking met onbehandelde controle cellen. Omgekeerd werd PAR-1 en PAR-3 expressie significant neerwaarts gereguleerd, nadat P. gingivalis
bovenstaande behandeling. In feite is PAR-2 activering geassocieerd met verscheidene chronische ontstekingsaandoeningen [3, 30-32]. Bovendien in vitro en in vivo studies hebben duidelijk gesuggereerd dat PAR-2 speelt ook een rol bij periodontale ontsteking [15, 16, 33, 34]. PAR-1 activering, via trombine of door de mens gemaakte activerende peptiden, is betrokken als een potentiële regulator van zowel pijn en ontsteking [35-37]. Een recente studie toonde ook aan dat PAR-1 werd uitgedrukt in tandvleesweefsels [18] en PAR-1 activering door trombine een rol bij het herstel en de homeostase van parodontale weefsels [38] spelen. De rol van de PAR-3 is van belang omdat de functie van deze schijnbaar niet-signalerende receptor onduidelijk blijft [9, 39, 40]. Het vermogen van PAR-3 om een intracellulair signaal te genereren blijft ook twijfel omdat het geen de cytoplasmatische staartdomein Prijzen in andere PARs, die nodig is om te koppelen met G-proteïnen [9]. Een recente studie heeft aangetoond dat PAR-3 is een kritische factor voor PAR-1 functie en PAR-3 kan de werking van PAR-1 milderen endotheliale responsen, zoals vasculaire ontsteking [41]. PAR-3 regelt PAR1 signalering door receptor dimerisatie. Er is controverse over de rol van de PAR's geweest. In sommige weefsels spelen zij een rol proinflammatoire [42], terwijl in andere weefsels lijken ze een anti-inflammatoir of beschermende werking [43] hebben. Deze beschermende functie kan worden vergemakkelijkt door de opregulatie van PAR-2 en downregulatie van PAR-1 en PAR-3 genexpressie in respons op P. gingivalis
proteasen. Er zijn echter verdere studies nodig om de rollen van PAR-1, PAR-2, en PAR-3 volledig helderen de pathogenese van parodontitis.
Conclusies
De hier beschreven studie bevestigt de rollen van PAR-1, PAR -2 en PAR-3 in gingivale epitheliale reacties die verband kunnen houden met parodontitis. Bijgevolg zullen de mechanismen die ten grondslag liggen aan de effecten gemedieerd door de grote PAR bij parodontitis, met inbegrip van hun correlatie met cytokines, vereist nader onderzoek. Deze informatie zal een beter inzicht in de ontwikkeling van parodontale aandoeningen te verschaffen en de strategie te informeren voor de identificatie van therapeutische benaderingen voor deze omstandigheden.
Verklaringen
Dankwoord
Wij danken de tandartsen (Dental Department, Sir Run Run Shaw ziekenhuis, School of Medicine, Zhejiang University) voor hun hulp. Wij danken Dr. Yu Yunsong en zijn onderzoeksteam (Department of Infectious Diseases, Sir Run Run Hospital Show, School of Medicine, Zhejiang University) voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr 81000447) logo VPRO AccessThis artikel wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http:. //Creativecommons org /licenties /door /4. 0 /), die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elk medium toestaat, mits u de juiste krediet aan de oorspronkelijke auteur (s) en de bron te geven, een link naar de Creative Commons licentie, en aangeven of wijzigingen zijn aangebracht. De Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http:. //Creativecommons org /publicdomain /zero /1 0 /) van toepassing op de ter beschikking gestelde in dit artikel, tenzij anders vermeld data
Competing. belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende rente.
auteurs bijdragen
Dr. Zhang voerde de experimenten en schreef het manuscript. Dr. Li had de leiding van de verzameling van tandvlees weefsels. Dr. Hu geholpen voeren de experimenten. Dr. Sheng was verantwoordelijk voor data-analyse. Prof. Chen bedacht en ontwierp de experimenten. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
