Abstracte achtergrond
Door de toenemende prijzen van orofaryngeale kanker, mondelinge HPV-infectie is een belangrijke zorg. Methoden voor het detecteren van orale HPV is niet gestandaardiseerd want er zijn verschillende technieken beschikbaar. Wij stellen dat het gebruik van mondspoeling monsters te detecteren HPV is een geschikte techniek bij een kliniek instelling. Zo, onze belangrijkste doelstelling is om HPV-detectie in mondspoeling monsters te bestuderen.
Methods
In onze studie gebruikten we mondspoeling monster collectie in combinatie met real-time PCR op te sporen voor HPV types 16 en 18, en bij voorkeur versterkt
FAP PCR monsters te detecteren voor een groot aantal HPVs, orofaryngeale plaveiselcelcarcinoom (OPSCC), niet-OPSCC en gezonde patiënten. Resultaten
Drieëndertig procent van 100 kankerpatiënten waren positief voor elk type HPV ; van die 23 waren positief voor HPV16. Slechts 1 van 110 gezonde controles was positief (dit onderwerp was positief voor HPV18).
Conclusie
Onze resultaten geven aan dat HPV-detectie in mondspoeling monsters bruikbaar als screeningsmethode te HPV geassocieerde orale kankers kan detecteren.
Achtergrond
Tissues besmet met het humaan papillomavirus (HPV) hebben de mogelijkheid om te evolueren naar een HPV-geassocieerde kanker. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een veldeffect waarin HPV normale celfuncties waardoor maligniteit kan wijzigen. Hoewel we weten hoe om te testen op HPV-gerelateerde vormen van kanker, is er momenteel geen standaard voor het detecteren van HPV-infectie [1], en het screenen op HPV kunnen personen met een risico voor hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) te identificeren. Spreken over die, hebben HNSCC gevallen geassocieerd met HPV een uitdaging voor het screenen op, in het bijzonder de mondholte plaveiselcelcarcinoom (OSCC) en oropharyngeal plaveiselcelcarcinoom (OPSCC) gevallen, die subsets van HNSCC zijn geweest. De orofaryngeale gebied omvat de basis van de tong, zachte gehemelte, amandelen, en tonsillar regio, met de mondholte omvat de rest van het interieur weefsels van de mond. De meest gebruikelijke werkwijzen voor HPV-detectie in de mond en orofarynx beginnen verzameling cellen met een wattenstaafje, cytobrush of mondspoeling [2], gevolgd door het gebruik van PCR-gebaseerde assays of DNA in situ hybridisatie [3]. Er zijn echter problemen aanwezige bepaalde technieken. Bijvoorbeeld, het gebruik van een wattenstaafje /kwast beperkt de hoeveelheid slijmvlies dat wordt bemonsterd, en het verkrijgen van een monster van een niet zichtbare laesie binnen de tonsillen crypte mogelijk niet haalbaar [4]. De basis van de tong niet volledig toegankelijk hetzij als er zowel vlakke mucosa en tonsil weefsel, waardoor het risico verhogen van vals negatieven [5]. We kozen voor een mondspoeling techniek voor monstername gebruiken aangezien het niet-invasief, snel en eenvoudig voor de patiënt.
Analyseren p16 expressie is gebruikt als een biomarker voor HPV-geassocieerde OSCC /OPSCC, maar studies hebben gemeld dat p16 overexpressie is niet altijd aanwezig in gevallen waarbij oncogene HPVs [6-9]. Een recente studie concludeerde dat p16 niet worden gebruikt als een surrogaat marker voor HPV-infectie bij mondkanker gevolg van slechte overeenkomst tussen de twee [10]. Voorafgaand aan deze, Pannone et al. verklaarde ook dat p16 immunohistochemie (IHC) alleen niet blijken te zijn een betrouwbare methode in HPV-detectie voor OSCC /OPSCC gevallen [11] zijn. In onze studie, verkregen we informatie p16 testen om te zien of HPV onze gegevens waren in overeenstemming.
OPSCC incidentie in ontwikkelde landen is aanzienlijk toegenomen en HPV-infectie wordt voorgesteld de belangrijkste factor [12] zijn. Risicofactoren voor orale HPV-infectie omvatten bepaalde seksuele praktijken [13-16]; aantal van de levensduur van partners en het aantal recente sekspartners, oudere leeftijd, zijn mannelijk, en de huidige roken van sigaretten [17, 18]. De meest voorkomende HPV-type geassocieerd met orale infectie Type 16 [17, 19], die is aangetoond oncogeen te zijn HNSCCs [20]. Een wereldwijde systematische review van HNSCC biopten aangetoond HPV16 in 31% van de gevallen OPSCC; 16% van de gevallen OSCC; en 17% van de laryngeale SCC gevallen [21]. HPV-type 18 lijkt ook een belangrijke rol spelen bij carcinogenese, vooral in de orofarynx [22, 23].
Met de opkomst van OPSCCs is het noodzakelijk om een gouden standaard techniek voor orale HPV detectie hebben. Monsters uit de mondholte en oropharynx voor de detectie van orale HPVs moet snel, niet-invasief, goedkoop en voldoende HPV DNA collectie. In onze studie onderzochten wij mondspoeling monsters in combinatie met real-time PCR Taqman assays voor het detecteren van HPV typen 16 en 18, die gevoelig en specifiek. Detecteren van een groot aantal HPVs, we voorkeur versterkt de mondspoeling monsters van kankergevallen en gebruikte fluorescerende willekeurig geprimede (FAP) PCR, een algemene PCR onder toepassing van gedegenereerde primers HPV.
Onderzoekspopulatie
tussen 2011 en 2013, we geworven 76 OPSCC en 24 non-OPSCC patiënten uit de Seattle Cancer Care Alliance (Seattle, WA), en 110 gezonde proefpersonen van de Universiteit van Washington Dental Clinic (Seattle, WA). Non-OPSCC gevallen opgenomen patiënten met OSCC, larynx, sinus en supraglottis kankers. We gescreend de lijsten van vijf oncologen in aanmerking te komen kankerpatiënten te identificeren, en besproken onze studie aan hun benoeming. Eén patiënt gedaald als gevolg van de mond zweren en gevoeligheid. 21/100 kankerpatiënten was al begonnen behandeling en van deze 21 patiënten: 18 patiënten hadden een behandeling die minder dan 21 dagen voor de bemonstering, de twee hadden meer dan 30 dagen van de behandeling, en één patiënt had de behandeling van 7 maanden. Gezonde proefpersonen werden willekeurig gekozen binnen de student tandheelkundige kliniek, één patiënt weigerde aan het onderzoek te nemen. Inclusion eisen voor de gezonde bevolking opgenomen zijn: vrij van kanker, niet zwanger, HIV-vrij, en over de leeftijd van 16. Elke patiënt ondertekende schriftelijke toestemming formulieren om deel te nemen aan het onderzoek (IRB # 7490 goedgekeurd 9 april 2014), en antwoordde een eenvoudige gezondheid vragenlijst. Geslacht, leeftijd, geslacht, roken, alcohol en marihuana geschiedenis werden opgenomen voor alle vakken. Charts een subset van onze patiënten werden beoordeeld voor p16 immunohistochemie (IHC) en HPV-testen
Methods
Collectie & amp.; DNA-zuiveringsmethoden
Voor monstername, alle patiënten gespoeld en gargled gedurende 30 s met originele Mint Scope® mondspoeling (Procter & Gamble). Vier normale gezonde individuen verzocht Crest® Alcoholvrij mondwater gebruiken vanwege een geschiedenis van alcoholisme. Mondspoeling monsters werden gedurende 15 min. bij 4 ° C een pellet werd het supernatant verwijderd en de pellet werd bij -80 ° C geplaatst totdat zij worden verwerkt. De Puregene® DNA Purification Kit werd gebruikt om genoom-DNA te isoleren uit de buccale celpellet binnen de mondspoeling monsters (Qiagen artikel # 158467, protocol van de fabrikant werd gevolgd).
Alle proefpersonen IRB protocollen en voorschriften werden gevolgd in het kader van het Fred Hutchinson Cancer . Research Center richtlijnen (IRB # 7490 goedgekeurd 9 april 2014)
HPV & amp; analysemethoden
Taqman real-time PCR assays werden gebruikt voor detectie op de ABI Prism 7900 Sequence Detection System met 40 cycli bij reactie (denaturatie bij 95 ° C, annealing en verlenging bij 60 ° C). Absolute kwantificatie werd gebruikt om HPV16 en 18 virusdeeltjes en totaal humaan genomisch DNA te bepalen in het monster werd bepaald op Alu sequenties. Seriële verdunningen van menselijk genoom DNA en de volledige lengte HPV16 en 18 plasmiden, van bekende concentraties, werden gebruikt als standaard curves
HPV16 E7 Primers
Forward:. CGGACAGAGCCCATTACAATATT
Keerzijde: CGCACAACCGAAGCGTAGA
HPV16 E7 Probe: TAACCTT (T /C) TGTTGCAAGTGT
HPV18 E7 Primers:
Forward: CCGACGAGCCGAACCA
Keerzijde: TGGCTTCACACTTACAACACATACA
HPV18 E7 Probe: AACGTCACACAATGTT
met het oog op de efficiëntie van HPV-detectie te verhogen, gebruikten we de vermenigvuldigen-primer rollend-cirkelvormige amplificatie techniek (MP-RCA) om bij voorkeur versterken onbekende, ronde HPV DNA. MP-RCA is aangetoond circulair DNA templates tot amplificeren 107-voudige [24]. De TempliPhi 100 Amplification Kit (Amersham Biosciences) protocol werd gevolgd. Ondernemingen De FAP gepubliceerde PCR protocol werd gevolgd voor het detecteren van een groot aantal HPV types waarbij primers werden ontwikkeld op basis van geconserveerde gebieden L1 [25]. We voerden in deze techniek op de kankergeval monsters (fig. 1). Fig. 1 FAP PCR resultaten op een elektroforese gel. Een verwachte band van ~ 480 bp duidt op een HPV-positief monster
We gecategoriseerd roken geschiedenis als volgt: niet-roker (0 packs); Lichte roker (& lt; 1pack /week); matige roker (≥1pack /week ≤1 pack /dag); zware roker (≥1pack /dag). Voor degenen die sigaren gerookt of gekauwd tabak berekende we tot het equivalent van pakjes sigaretten gerookt. Alcohol geschiedenis werd als volgt ingedeeld: geen (nog nooit drinkt); zelden /incidenteel (1 drankje om de 1-2 maanden); licht (1-6 drankjes /week voor vrouwen, 1-13 drankjes /week voor mannen); matig (7 drankjes /week voor vrouwen, 14 drankjes /week voor mannen); zware (& gt; 7drinks /week voor vrouwen, & gt; 14 drankjes /week voor mannen)..
Alle data-analyse werd uitgevoerd met Stata MP 13.1 (StataCorp LP, Texas, USA)
Resultaten
Mondkanker proefpersonen met OPSCC en non-OPSCC hadden meer kans om mannelijke dan controlepersonen zonder kanker, zoals ten minste 83% van de personen in elk type kanker waren mannen, in vergelijking met slechts 46% van de controles (tabel 1; p
& lt; 0,001). Gevallen van kanker waren ook ouder dan controles, zoals & gt; 80% van de gevallen, ongeacht het type kanker, waren 50 jaar of ouder in vergelijking met slechts 63% van de controles (p Restaurant & lt; 0,001). Onderwerpen met OPSCC en non-OPSCC waren vergelijkbaar met patiënten zonder kanker met betrekking tot racen (p
= 0,30) en etniciteit (p
= 0,62) en waren voornamelijk niet-Spaanse blanken. Degenen die kanker (39% OPSCC, 54% niet-OPSCC; p Restaurant & lt; 0,001) hadden waren meer kans te zware rokers zijn in vergelijking met degenen die geen kanker (32%). Zware alcohol geschiedenis heerste in 33% van OPSCC en 33% van OSCC patiënten (p = 0,015
) vergeleken met slechts 12% van de niet-kankerpatiënten. Marihuanagebruik werd vooral waargenomen in gevallen van kanker (11% OPSCC, 4% OSCC; p
= 0,010) en zelden in de controlegroep (0,91%). Gevallen van beide soorten kanker (33% OPSCC, 33% niet-OPSCC; p Restaurant & lt; 0,001) hadden meer kans om detecteerbaar HPV dan gezonde controles (0,9%) hebben, en in het bijzonder type 16 (25% OPSCC, 17% non-OPSCC; p Restaurant & lt; 0,001) ontdekt in hun mondelinge spoeling monsters in vergelijking met controles. HPV18 detectie niet verschillen per studiegroep en werd ontdekt in een enkel monster van een controle-onderwerp (p
= 0,63), en niemand in de gevallen van kanker. Onze methode voor HPV-detectie had een gevoeligheid van 33% en een specificiteit van 99% (p Restaurant & lt; 0,001) .able 1 Demographics onder alle onderwerpen in niet-kanker en kanker gevallen
Geen kanker
OPSCC
Non-OPSCC
p
-waarde
n
= 110
n
= 76
n
= 24
Geslacht
Man
51 (46,36%)
63 (82,89%)
20 (83.33%)
& lt; 0,001
Female
59 (53.64%)
13 (17,11%)
4 (16,67%)
Gegroepeerd leeftijd
20-39
27 ( 24,55%)
1 (1,32%)
1 (4,17%)
40-49
13 (11,82% )
10 (13.16%) kopen van 2 (8,33%)
50-59
21 (19,09%)
29 (38.16%)
11 (45.83%)
& lt; 0,001
60-69
29 (26,36%)
30 (39,47%)
8 (33,33%)
70+
20 (18,18%)
6 (7,89%) kopen van 2 (8,3%)
Race
Aziatische
5 (5,55%)
Pagina 2 (2,63%)
1 (4.17)
Black
6 (5,45%)
1 ( 1,32%)
0
White
92 (83,64%)
65 (85,53%)
21 ( 87.50%)
0,30
Andere
7 (6,36%)
4 (5,26%)
1 ( 4,17%)
Unknown
0
4 (5,26%)
1 (4,17%)
Etnische afkomst (Hispanic /Latino)
Yes
4 (3,64%) kopen van 2 (2,63%)
0
0.62
Geen
106 (96,36%)
74 (97,37%)
24 (100%)
Smoking geschiedenis
Niet-roker
51 (46,36%)
21 (27,63%)
5 (20.83 %)
Lichte roker
1 (0,91%)
14 (18,42%) kopen van 2 (8,33%)
Restaurant & lt; 0,001
Matige roker
23 (20,91%)
11 (14,47%)
4 (16.67 %)
Zware roker
35 (31,82%)
30 (39,47%)
13 (54,17%)
Alcohol geschiedenis
Geen
24 (21,82%)
7 (9,21%)
3 (12,50%)
Zelden /af en toe
16 (14,55%)
14 (18,42%)
4 (16,67%)
Light
54 (49,09%)
27 (35,53%)
9 (37,50%)
0,015
Matige
3 (2,73%)
3 (3,95%)
0
Heavy
13 (11,82%)
25 (32,89%)
8 (33,33%)
Elke marihuanagebruik
Ja
1 (0,91%)
8 (10,53%)
1 (4,17%)
0.010
Geen
109 (99,09%)
68 (89,47%)
23 (95,83%)
Elke HPV
1 (0,91%)
25 (32,89%)
8 (33,33%)
& lt; 0,001
HPV 16 positieve
0
19 (25.00%)
4 (16,67%)
& lt; 0,001
HPV 18 positieve
1 (0,91%)
0
0
0,63
ADATA voor "No Cancer" wordt geassocieerd met gepubliceerde gegevens van De prevalentie van HPV-types 16 en 18 binnen een tandheelkundige kliniek student instelling
(J Dang et al.)
Tweeëntwintig HPV-positieve monsters werden getest op p16 vóór de bemonstering, en slechts één negatief getest voor p16 . Echter, 26 monsters die negatief zijn voor HPV waren positief voor p16 (tabel 2). Opgemerkt wordt dat drie van de 26 patiënten (p = 0,085
) ondergingen behandeling (bijv. Chemotherapie, radiotherapie, excisie) vóór de bemonstering, want anders kan de aanwezigheid van HPV-infectie voorafgaande. HPV was marginaal geassocieerd met p16 detectie (p
= 0,076); van de patiënten die HPV-positief waren, 96% had een positieve p16-test; slechts één monster dat positief voor HPV was negatief getest op p16. Onder HPV negatieve patiënten, 79% waren p16 positief. Slechts twee case patiënten hadden HPV-screening voltooid voordat de bemonstering en beiden waren negatief voor HPV in onze tests en de screening.Table 2 p16 en alle HPV
Elke HPV
p16-test
p
-waarde
Positief
Negatief
0,076
n
= 48
n
= 8
Ja
22 (95,65%)
1 (4,35%)
No
26 (78,79%)
7 (21,21%)
Discussie
Patiënt monster collectie kan een moeilijke en tijdrovende taak zijn vooral wanneer de onderzoeker onderbreekt een afspraak. Ook veel individuen gevoelig gag reflexen, dus als een borsteltje of staafje techniek wordt gebruikt om de achterzijde van de keel schrapen, het verkrijgen van een monster heel moeilijk zonder de hulp van een plaatselijke verdoving. Daarom is het noodzakelijk om een sampling techniek plaats die niet-invasief en snel, maar voldoende voor detectie van HPV. Ons onderzoek heeft aangetoond dat orale spoeling monster collectie is een onopvallende methode om te gebruiken voor de detectie van mondelinge HPV. Dit is in overeenstemming met een studie ter vergelijking van orale spoeling en cytologie borstel sampling, waarin wordt geconcludeerd dat de mondelinge spoelingen waren de beste keuze voor het bemonsteren van de mondholte op te sporen voor HPV [26].
We gebruikten Scope® want het was waargenomen uitstekend behoud van hoge molecuulgewicht DNA kwaliteit, en het is beter verteerbaar dan de meeste andere media spoeling [27]. Vier controle patiënten gevraagd te spoelen met Crest Pro-Health® alcoholvrije mondwater. We hebben niet de verschillen in DNA hoeveelheid (gegevens niet getoond) te zien, maar meer onderzoek is nodig om te zien of er een verschil met de hoeveelheid en kwaliteit.
Kwantificeren van de viral load kan van cruciaal belang zijn bij het bepalen of HPV-positief OPSCC /OSCCs zijn ongetwijfeld het gevolg van HPV-infectie [28]. De gouden standaard voor HPV viral load assessment is real-time PCR [29, 30]. Een studie toonde OPSCC een viral load van ~ 80.000 keer hoger dan OSCC en andere HNSCCs [29] hebben. Onze resultaten toonden geen significante verschillen tussen de twee groepen kanker (fig. 2). Ook kunnen verschillen in resultaten door de auteurs met verse ingevroren biopten waarbij slechts een klein gedeelte van de mondholte of orofarynx wordt bemonsterd. Mondspoeling monsters kunnen zorgen voor een meer doeltreffende inning van orale cellen voor HPV-detectie. Variatie in bevindingen warrants verder onderzoek van de viral load in samenwerking met subsets van HNSCC. Fig. 2 Vergelijking van HPV16 viral load (kopieën /ng DNA) tussen de twee groepen kanker. Er werd geen statistisch significant verschil waargenomen (p
= 0,40). De grijze dozen demonstreren bereik van lagere naar hogere kwartielen. De mediaan wordt vertegenwoordigd door een horizontale lijn. Maximale en minimale waarden worden aangeduid door de verticale lijnen. Viral load variatie tussen elke groep werd aangetoond. De gemiddelde virusbelasting in OPSCC iets hoger dan niet-OPSCC cases
één patiënt met OPSCC, die behandeling ondergingen 7 maanden vóór de bemonstering was positief voor HPV specifiek Typ 16. Dit geval is uniek ondergaan verscheidene maanden van de behandeling moet het virus uit te roeien, tenzij als de infectie was afgelopen. Opgemerkt wordt dat de patiënt een zwaar roken drinken en geschiedenis. Meer onderzoek naar de prevalentie van HPV-infectie na bestraling /chemotherapie gerechtvaardigd is.
Een belangrijke beperking is het ontbreken van DNA van tumorweefsel tot HPV-detectie te vergelijken. De weefselmonsters waren niet beschikbaar voor ons, maar zou hebben gehandeld als een gouden standaard binnen onze studie. Andere beperkingen ons onderzoek zijn: onze resultaten aantonen van een lage gevoeligheid voor HPV-detectie bij kankerpatiënten, maar met een zeer hoge specificiteit; we konden geen controle over hoe goed een patiënt zou gorgelen en spoel het mondwater, die een effect op de kwantiteit en kwaliteit van DNA verzameld zal hebben; Scope ® heeft een sterke mint smaak, die niet geschikt zijn voor mensen met een gevoelige monden kunnen zijn; klein formaat monster; niet detecteren van HPV RNA actieve-infectie; en FAP PCR is gevoelig genoeg te detecteren voor een groot aantal HPVs, maar sommige HPVs mogelijk niet opgemerkt door de algemeenheid van de ontworpen primers [25].
p16 test wordt meestal alleen uitgevoerd te worden wanneer zij niet passen de traditionele risicofactoren (bijv. significant tabak en alcohol gebruik geschiedenis) en HPV-testen wordt zelden gedaan. Dit is iets dat moet in de loop van de diagnose te worden gewijzigd als gevolg van de toename van de HPV-geassocieerde OPSCCs.
Conclusies
van onze resultaten hebben we aangetoond dat bij voorkeur versterkt mondspoeling monsters met HPV detectie van real-time PCR Taqman assays en FAP PCR, is een bruikbare methode algemeen, die bij een kliniek instelling kan worden gebruikt. Meer specifieke studies zullen moeten worden gedaan om te bepalen of de mond spoelen hoeft eigenlijk weerspiegelen, in de gevallen, het type HPV in verband met de kankercellen laesie
Afkortingen
OSCC:.
Oral plaveiselcelcarcinoom
OPSCC:
Orofaryngeale plaveiselcelcarcinoom
HNSCC:
Hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom
RT-PCR:
Real-time polymerase chain reaction
FAP PCR:
Fluorescent willekeurig gegronde polymerase chain reaction
MP-RCA:
Vermenigvuldig-primer rolling-cirkelvormige versterking
verklaringen
Dankwoord
Bron van de financiering van de Universiteit van Washington's Royalty Research Fund
Open. AccessThis artikel wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http:. //creativecommons org /licenties /door /4. 0 /), die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie toelaat in elke vorm, mits je de juiste krediet te geven aan de oorspronkelijke auteur (s) en de bron, een link naar de Creative Commons-licentie, en aangeven of wijzigingen zijn aangebracht. De Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http:. //Creativecommons org /publicdomain /zero /1 0 /) van toepassing op de ter beschikking gestelde in dit artikel, tenzij anders vermeld data
Competing. belangen
de auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.
auteurs bijdragen
JD voltooid alle experimenten, alle gegevens geanalyseerd, en schreef het manuscript. NBK en QF bedacht /ontworpen het onderzoek en beoordeeld /redacteur van het manuscript. KDE was de gezamenlijke oncoloog voor de studie die met monstername geholpen en bekijken /bewerken van het papier. HJ assisteerde bij monstername. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
