Abstracte achtergrond
In recente studies, parodontale gezondheid is gekoppeld aan overgewicht en /of obesitas. Onder gemeenschappelijke orale bacteriën, Selenomonas noxia
is betrokken bij het omzetten van parodontale ziekten gezondheid en Selenomonas
soorten zijn ook gevonden in maagzweren. Het doel van deze studie was het ontwikkelen en valideren van een kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) assay voor de specifieke en snelle detectie van S. noxia
.
Methods
Twee oligonucleotide primerparen en een probe werden ontworpen en getest om een optimale versterking signaal vast te stellen met drie stammen van S. noxia
. De PCR-test werd getest tegen veertien niet-doelwitorganismen, inclusief nauw verwant orale Selenomonads, een fylogenetisch nauw verwante bacterie, en twee meest geïsoleerde bacteriën in de mond.
Resultaten
Eén van de primer sets was gevoeliger bij het opsporen van de doelgroep organisme en werd geselecteerd voor optimalisatie en validatie experimenten. De ontworpen primers en probe versterkt het doelorganisme met 100% specificiteit. PCR remming werd waargenomen met een interne positieve controle en remming werd opgelost door verdunning van de DNA-extract.
Conclusies
qPCR assay gemaakt in dit onderzoek kan worden gebruikt om specifiek detecteren S. noxia
in de klinische setting en in de toekomst onderzoek met de verbeterde detectie van S. noxia
. De test kan ook worden gebruikt in epidemiologische studies voor het begrijpen van de rol van S. noxia
van ziekteprocessen waaronder, maar niet beperkt tot, orale gezondheid en obesitas van infectieuze oorsprong.
Sleutelwoorden
Bacteriën Periodontal gezondheid en ziekte Selenomonas noxia
PCR Achtergrond
Het geslacht Selenomonas
voor het eerst in 1683 werd beschreven door Antony van Leeuwenhoek als een halvemaanvormige bacterie uit een orale monster [1]. Selenomonas noxia
is een bacterie die de menselijke mondholte koloniseert en is herhaaldelijk geassocieerd met parodontitis [2-4]. Deze soort bestaat uit obligaat anaërobe, beweeglijk, niet-sporenvormende, gramnegatieve staafjes [5]. S. noxia
was een van de vijf nieuwe soorten van het geslacht Selenomonas
, Phylum Firmicutes, gekenmerkt voor het eerst door Moore et al
. in 1987 [5]. Parodontale aandoeningen zijn waarschijnlijk een van de meest voorkomende bacteriële infecties bij de mens. Slechts enkele honderden soorten micro-organismen die zijn geïdentificeerd in de gingivale spleet en de periodontale pocket worden gedacht een belangrijke rol bij de initiatie en progressie van de ziekte [6], en S. noxia
behoorde tot de nieuwe organismen toegevoegd als een vermeende parodontale pathogeen [7]. Zeer weinig literatuur beschikbaar over de pathogene S. noxia
, maar het geslacht Selenomonas
gevonden in hogere hoeveelheden in vergelijking met andere orale bacteriën in gevallen van gegeneraliseerde agressieve parodontitis (GAP). Bovendien, S. noxia
werd gedetecteerd met behulp cultuur en DNA-gebaseerde technieken in zowel chronische periodontitis (CP) en GAP laesies [8, 9]. In een studie van Kumar et al.
[10], ziekte-geassocieerde monsters werden verzameld uit de vier diepste plaatsen bij personen met gevestigde parodontitis, en de meest talrijke soorten door 16S klonale analyse behoorden tot de geslachten Selenomonas
, Streptococcus
, Veillonella
, Campylobacter
en Peptostreptococcus
. Terwijl Selenomonas
mondelinge klonen niet werden geassocieerd met de ziekte van [8], hebben andere studies gesuggereerd dat S. noxia
is een van de belangrijkste soorten in verband met het omzetten van websites parodontale gezondheid van parodontitis [3, 11]. Bovendien is in een recent rapport van Andersen et al.
[12], een Helicobacter
-Net als organisme (HLO) in de histologische deel van een menselijk maagzweer bleek een Selenomonas
soort. In de literatuur en de studies tot op heden geen precieze gegevens te geven over de totale prevalentie van S. noxia
bij gezonde personen.
Moleculaire technieken hebben een goede basis bij het identificeren van de rol van Selenomonas
soorten als parodontale gezondheid indicatoren [8, 13]. In een onderzoek naar het gebruik van oligonucleotide probes gericht op de meerderheid van alle mondelinge isolaten om de ruimtelijke verdeling van Selenomonas
soorten in subgingivale biofilms te verkennen, een relatief lage prevalentie van Selenomonas
werd getoond in GAP en CP patiënten. Niettemin een fluorescentie in situ
hybridisatie (FISH) analyse van dezelfde biofilm gebleken dat Selenomonas
heeft een relevante bijdrage aan de structurele organisatie van de biofilms [9].
Naast de rol van S . noxia
in mondgezondheid, een studie van Goodson et al.
[14] hield in dat S. noxia
kan worden geassocieerd met obesitas. De studie toonde aan dat 98,4% van de mensen met overgewicht correct werden geïdentificeerd door de aanwezigheid van de één bacterie, S. noxia
. Deze bevinding leverde een aanwijzing voor een beter begrip van de vereniging en /of de aanwezigheid van S. noxia
in de mondholte en de ontwikkeling van obesitas. Onlangs, is er steeds meer belangstelling voor het begrijpen van de relatie tussen menselijke microbiële diversiteit en overgewicht of obesitas. Gezien de kans dat parodontitis kan bijdragen aan de ontwikkeling van obesitas is de rol van de orale microbiome van obesitas is steeds meer aandacht [14]. Het mechanisme waardoor mondbacteriën bijdragen tot de ontwikkeling van obesitas wordt in ten minste drie manieren: het verhogen metabole efficiëntie, het verhogen van de eetlust en /of omleiden energiemetabolisme [14] Ondernemingen De toenemende klinische en epidemiologische belang van S. noxia.
vereist de ontwikkeling van een snelle detectiemethode. Tot nu toe detectiemethoden voor S. noxia
beperkt zijn gebleven tot cultuur en DNA-hybridisatie testen. Cultuur analyse van Selenomonas
spp. is niet gebruikelijk in de klinische microbiologische laboratoria en kan duren omdat het een veeleisende obligaat anaërobe bacterie. Met de anaërobe kweek techniek is het verschil tussen speeksel herstel en subgingivale aanwezigheid aanzienlijk geweest, die deze benadering niet geschikt voor gebruik in de microbiële diagnose van periodontitis patiënten [15] maakt. Toepassing van de polymerase kettingreactie (PCR) detectietechniek met soorten oligonucleotideprimers en probes kunnen snelle detectie van S. noxia
verbeteren. De kwantitatieve methode PCR (qPCR) combineert PCR chemie met fluorescente probe detectie van geamplificeerd product in hetzelfde reactievat en twee uur of minder voltooid. Het doel van dit onderzoek was het ontwikkelen en valideren van een qPCR assay voor de specifieke detectie van S. noxia
. Verbeterde detectie van Selenomonas noxia
in de orale microflora is de eerste stap in het ophelderen van haar betrokkenheid bij obesitas en ziekten bij de mens.
Methods Electronics Test organismen
Drie verschillende stammen van S. noxia
werden verkregen van de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) en gebruikt om de PCR-protocol ontworpen (tabel 1) te evalueren. Veertien non-target-organismen, met inbegrip van andere nauw verwante orale Selenomonads, een fylogenetisch nauw verwante bacterie, en twee vaak gevonden bacteriën in de mond,
werden verkregen van ATCC en gebruikt om de specificiteit van de ontworpen primers en sonde (tabel 1) te testen. tabel 1 Test organismen
Bacteriële soorten
ATCC #
Bacillus cereus
14.579
Candida albicans
14053
Centipeda periodontii
35.019
Klebsiella pneumoniae
4352
Lactobacillus acidophilus
3456
Pectinatus cervisiiphilus
29.359
Pseudomonas aeruginosa
27.853
Selenomonas artemidis
43.528
Selenomonas dianae
43.527
Selenomonas flueggei
43.531
Selenomonas infelix
43.532
Selenomonas noxia
43.541
Selenomonas noxia
51.893
Selenomonas noxia
700.225
Selenomonas sputigena
35.185
Staphylococcus aureus
25923
Streptococcus mutans
25175
DNA-extractie
Microbial DNA werd geëxtraheerd met behulp van de QIAamp® DNA Mini Kit ( Qiagen, Valencia, CA) volgens de instructies van de fabrikant met de volgende wijzigingen; 100 pl monstervolume gebruikt voor de extractie en de uiteindelijke elutievolume was 200 pl. Geselecteerde monsters werden geëxtraheerd met UltraClean® Soil DNA Isolation Kit (Mobio, Carlsbad, CA). De DNA-fragmenten werden opgeslagen bij -70 ° C tot gebruik. Ondernemingen De aanwezigheid en hoeveelheid DNA in elk monster werd gemeten met een Spectronic ™ GENESYS 10 Bio UV-Visible spectrofotometer de NANOCELL accessory-0,2 mm weglengte (Thermo Electron Corporation, Madison, WI) om sub-microliter DNA-monsters te analyseren oplossing. De bepaling werd uitgevoerd met 1,5 pl monster, na nulpunt met TRIS-EDTA (TE) buffer (pH 7,4). DNA /eiwitconcentratie modus (absorptie bij 260 en 280 nm met 320 nm correctie) werd gebruikt voor de meting. De DNA concentraties in S. noxia
(ATCC 43541, ATCC 700.225 en ATCC 51.893) tussen 4,2 en 11,7 ng /ul. Concentraties varieerden 4,2-150,8 ng /ul in het non-target monsters (gegevens niet getoond). DNA template concentraties gebruikt voor PCR gevarieerd, maar waren voldoende om een positief resultaat te verkrijgen aanwezigheid /afwezigheid testen, gebaseerd op de gevoeligheid van de test (583 fg /reactie).
Primer en probe ontwerp
nucleotide coderende regio sequentie en volledige genoom sequentie gegevens van S. noxia
werden opgehaald uit het National Center for Biotechnology Information, NCBI (http:.... //www NCBI NLM nih gov /Genomen /) . Sequence assemblage en uitlijning werden vergeleken in-silico
tegen alle beschikbare sequenties on-line met de Basic Local Alignment Search Tool algoritme (BLAST, NCBI). Ondernemingen De 16S ribosomaal RNA (1491 baseparen) van S. noxia
(ATCC 43541) werd gekozen om specifieke primers en probes te ontwerpen door vergelijking van de regio V8 van het gen (tabel 2). Deze regio is sterk geconserveerd onder de leden van de Selenomonas
geslacht, maar meer variatie onder Selenomonas
soorten. TaqMan® primers en probes werden ontworpen en geanalyseerd met behulp van de Primer Express software versie 3 (Life Technologies [Applied Biosystems], Foster City, CA). Geselecteerde primers werden gescreend tegen de vorming van secundaire structuren, met inbegrip van de vorming van haarspeld structuren, en zelf-en cross-dimeren. De primer lengte, de smelttemperatuur (T
m), G-C-verhouding en andere factoren werden als standaard op de Primer Express software.Table 2 Meerdere uitlijningen van V8 gebieden van het 16S rRNA gen van Selenomonas
species. Nummering gebruikt volgens de Escherichia coli
16S rRNA-gen [31]
Species
ATCC #
V8 regio (bp 1268-1296)
S. noxia
43.541
CAGAGGGCAGCGAGAGA-GTGATCTTAAGC
S. artemidis
43.528
..... Een .........-. CCC.C..GGGC ....
S. flueggei
43.531
....... Een .......- .. GC.C..G.CGG ...
S. infelix
43.532
..... Een .........-. CCC.C..GGGC ....
S. sputigena
35.185
..... Een ................-. C ..........
S. dianae
43.527
..... Een .........-. CCC.C .. GGGC ....
Twee primerparen en één probe werden geselecteerd voor het testen; i) Primer Set 1: Forward primer- SNF1, TCTGGGCTACACACGTACTACAATG (25 bp) en Reverse primer- SNR1, GCCTGCAATCCGAACTGAGA (20 bp), ii) Primer set 2: Forward primer- SNF2, GCATGTAAAGATGGGCACTCAA (22 bp) en Reverse primer- SNr2, CCGAACTGAGAAACGGTTTTTG (22 bp); amplicon met een lengte van 97 en 175, respectievelijk. De probe (SnP) geselecteerd voor beide primersets werd gelabeld aan het 5'-uiteinde met de reporterkleurstof 6-carboxyfluoresceïne (FAM) en het 3'-uiteinde met de reporter kleurstof tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA), SnP [ ,,,0],6 ~ FAM] CAGAGGGCAGCGAGAGAGTGATCTTAAGC [TAMRA]. De ontworpen primers en probe werden verkregen van Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL). Beide primer sets werden getest met DNA van twee S. noxia
referentie stammen (ATCC 43.541 en 51.893) om de optimale versterking signaal te bepalen.
Primer selectie en PCR-optimalisatie
Negen verschillende combinaties, tussen 0,2 en 0,9 uM uM, van de voorwaartse en achterwaartse primers en vijf verschillende concentraties probe variërend van 0,05 uM tot 0,25 uM werden getest met DNA (600 pg) van S. noxia
referentiestam ATCC 51.893 de optimale amplificatiesignaal bepalen. De PCR cyclusparameters waren als volgt: initiële incubatie stap van 50 ° C gedurende 2 min, denaturatie van het template DNA bij 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli bij 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min . PCR-omstandigheden waren: 1X TaqMan universele PCR master mix met AmpErase® UNG (uracil-N-glycosylase), AmpliTaq Gold DNA polymerase, deoxynucleosidetrifosfaten, passieve interne referentie [ROX ™ kleurstof], en geoptimaliseerde buffer componenten (Applied Biosystems), primers ( SNF1 en SNR1or SNF2 en SNr2) tot een uiteindelijke concentratie van 0,9 uM, sonde tot een eindconcentratie van 0,2 uM en 5 pl matrijs-DNA. Steriele nuclease-vrij water (Promega, Madison, WI) werd gebruikt om het volume van elke reactie passen aan 25 pl. De analyses werden uitgevoerd in 96-well platen met een 7900HT snelle real-time PCR systeem instrument (Applied Biosystems) op standaard wijze. Negatieve controles die 5 pl nuclease-vrij water in plaats van DNA werden in elke run één DNA kruisbesmetting te detecteren. DNA geëxtraheerd uit S. noxia
diende als positieve controle in elke PCR run
interne amplificatiecontrole
een commercieel TaqMan exogene interne positieve controle. (IPC; Applied Biosystems) werd gebruikt om PCR remming te detecteren. Het reagens meegeleverd 10X exogene IPC Primer en Probe (VIC ™ Probe) mix, 10X exogene IPC Blocking Reagent, en 50X exogene IPC DNA. De qPCR assay werd geoptimaliseerd om omstandigheden die geschikt zijn voor de detectie van zowel het doelorganisme en de interne positieve controle; dus afwezigheid of vermindering van amplificatie van het DNA in elk IPC multiplex PCR reactie gaf de aanwezigheid van PCR remmers. Verschillende verdunningen (d.w.z. 10 -1 tot 10 -6) van elk DNA-monster werd getest om te bepalen en te elimineren potentiële PCR remmers. Spectrofotometer met NANOCELL accessoire werd gebruikt zoals hierboven beschreven om de aanwezigheid van DNA in negatieve doelsoort PCR monsters Gegevensanalyse
.
Repliceren PCR amplificaties werden uitgevoerd tonen (n = 4). Zodra amplificatie werd voltooid, werden de gegevens geanalyseerd en uitgezet (fluorescentie vs het aantal cycli) met behulp van de software die bij het instrument 7900HT PCR. Het niveau van de amplificatie werd gemeld door de software als de gemiddelde cyclus drempelwaarde (Ct) waarde van identieke monsters. Ct verwijst naar de PCR cyclus waarbij fluorescentie (d.w.z. amplificatieproduct) eerst gedetecteerd, en is omgekeerd evenredig met de oorspronkelijke DNA template concentraties. Een CT-waarde van 40 vertegenwoordigt geen doelwit DNA aanwezig.
Resultaten
Primer en probe ontwerp
De resultaten van de Protein Family Sorter (PFS) met behulp van PATRIC toonde 14 unieke eiwitten voor S. noxia
, maar de eiwit BLAST heeft een betrouwbare output naar de primer /probe set in deze regio te ontwerpen niet vinden. Daarom werden de primersets ontworpen met de 16S rRNA sequentie [GenBank: AF287799]. Beide primer sets, primer set 1 (SNF1, SNR1) en primer set 2 (SNF2, SNr2) versterkt het doelorganisme. Primer set 1 bleek de laagste Ct waarden te produceren, wat aangeeft dat het gevoeliger bij het opsporen van het doelorganisme (tabel 3). Daarom werd deze primer set geselecteerd voor bijkomende optimalisatie en validatie experiments.Table 3 kwantitatieve PCR resultaten voor S. noxia
detectie
Target organisme
Primer set
Verdunningsfactor
100
10-1
10-2
Mean cyclus drempelwaarde (Ct) waarde ± SE (N = 2)
S. noxia
(ATCC 43.541)
1
11,68 (0,56)
14,99 (0,42 )
17,97 (0,02)
2
13,55 (0,95)
15,51 (1,12)
18,21 (0,16 )
S. noxia
(ATCC 51.893)
1
9,39 (0,10)
13,56 (0,08)
16,91 (0,11)
2
11,66 (0,44)
13,35 (0,28)
17,23 (0,11)
PCR optimalisatie
de negen verschillende combinaties van primer geteste concentraties geproduceerd optimale versterking signaal in vijf van de negen combinaties, variërend tussen 19-20 Ct-waarden voor de 0,2 um /0,9 uM, 0,5 /0,5 urn, 0,5 /0,9 uM, 0,9 /0,5 uM en 0,9 /0,9 pM forward en reverse primer concentraties, respectievelijk (data niet getoond). Probe optimalisatie resultaten toonden aan dat drie van de vijf verschillende concentraties (d.w.z., 0,15 pM, 0,2 pM, 0,25 pM en) die de laagste Ct-waarden (& lt; 20) (gegevens niet getoond). Zoals aanbevolen door het instrument en softwarefabrikant, 0,9 uM voorwaartse en achterwaartse primer concentraties, en 0,2 uM probe concentratie werden geselecteerd voor het testen van de specificiteit. De onderste detectiegrens van de Selenomonas noxia
PCR-test (met behulp van S. noxia
ATCC 51.893 als de test organisme) was 583 fg /reactie.
Specificiteit Testing
kwantitatieve PCR-amplificatie van het doelwit organisme met behulp van de primers en probes, reactieomstandigheden en cyclusparameters beschreven resulteerde in amplificatie van het verwachte 97-bp fragment uit de drie S. noxia
geteste stammen (Tabel 4). De non-target Selenomonas
spp. getest niet amplificeren met de ontworpen primers en probe. De overige niet-doelwitorganismen werden ook niet versterkt met de 16S qPCR assay ontwikkeld (tabel 4) .table 4 specificiteit testen van S. noxia
qPCR assay Electronics Test organisme
ATCC #
PCR resulteert
Bacillus cereus
14.579
Negatief
Candida albicans
14053
Negatief
Centipeda periodontii
35.019
Negatief
Klebsiella pneumoniae
4352
Negatief
Lactobacillus acidophilus
3456
Negatief
Pectinatus cervisiiphilus
29.359
Negatief
Pseudomonas aeruginosa
27.853
negatieve
Selenomonas artemidis
43.528
negatieve
Selenomonas dianae
43527
Negatieve
Selenomonas flueggei
43.531
Negatief
Selenomonas infelix
43.532
Negatief
Selenomonas noxia
43.541
Positieve
Selenomonas noxia
51.893
Positieve
Selenomonas noxia
700.225
Positieve
Selenomonas sputigena
35.185
Negatief
Staphylococcus aureus
25923
Negatieve
Streptococcus mutans
25175
Negatief
PCR remming
Het doelwit-gen werd geamplificeerd in alle concentraties van DNA getest drie S. noxia
stammen. De IPC PCR toonde de aanwezigheid van PCR remming en deze DNA fragmenten noodzakelijk verdunning (10 -4 tot 10 -5) naar de remmers (Tabel 5) .table 5 PCR resultaten tonen remming in S verwijderen . noxia
monsters
PCR-resultaten (Ct-waarden)
Proef
Verwatering
Sample
IPC
S. noxia
(ATCC 43.541)
100
14.60
15.01
40.00
40.00
01/10
17,76
17.94
40.00
40.00
02/10
21,30
21.23
40.00
40.00
03/10
24.79
24.71
40.00
31,21
10-4
28.13
28.01
28.08
28.11
S. noxia
( ATCC 51.893)
100
13.36
13.24
40.00
40.00
01/10
15.34
15,45
40.00
40.00
10-2
19,59
19.26
40.00
40.00
10-3
22.54
23,05
40.00
40.00
10-4
28.29
28.23
40.00
40.00
05/10
30.80
30.77
28.08
28.93
S. noxia
(ATCC 700225)
100
20.90
20.00
40.00
40.00
01/10
nd1
nd1
nd1
nd1
02/10
22.92
23,00
40.00
40.00
03/10
26.68
26.48
40.00
40.00
10-4
29.95
30,11
28,53
28.22
05/10
33,53
33,53
27,73
28.06
No template controle
40.00
40.00
28.40
28.12
1Not bepaald
verdunningen (10 -1 tot 10 -6) moet de remmers van niet-doel-DNA extracten (Tabel 6) te verwijderen waren. Bij gebrek aan inhibitie, de IPC DNA (d.w.z. geen template controle) geamplificeerd met een gemiddelde Ct-waarde van 29,4 ± 0,3 (standaardfout; S.E.). Het was noodzakelijk om alle monsters, doel- en niet-doel-DNA te verdunnen, om de remmers te verwijderen. Alle niet-doel DNA-extracten geproduceerd negatieve resultaten (Ct = 40) voor de S. noxia
PCR-test, zelfs wanneer PCR-remmers waren verwijderd door monster verdunning. Deze negatieve doelsoort PCR monsters bevatten DNA zoals spectrofotometrisch aangetoond met NANOCELL accessoire (gegevens niet getoond) .table 6 Gegevens tonen verdunning waarbij remming werd opgelost (n = 2 voor alle monsters, met uitzondering van die vet bestond uit vier herhalingen)
PCR-resultaten (Mean Ct-waarde)
Proef
Verwatering
IPC
Bacillus cereus
1,00E + 00
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E-04
40.00
1.00E-05
31.43
1,00E-06
29.48
Candida albicans
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
30.76
Centipeda periodontii
1,00E + 00
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
40.00
1,00E-04
29.01
Klebsiella pneumonia
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
30.42
Lactobacillus acidophilus
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
29,84
Pseudomonas aeruginosa
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
30.47
Pectinatus cerevisiiphilus
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
28.70
Staphylococcus aureus
1,00E + 00
40.00
1,00E-02
40.00
1.00E- 03
29.73
Selenomonas artemidis
1,00E + 00
40.00
1,00E -01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
28,72
Selenomonas dianae
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
40,00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
28.22
Selenomonas flueggeii
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
40.00
1,00E-03
28,82
Selenomonas infelix
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
40.00
1,00E-02
29.32
Streptococcus mutans
1,00E + 00
40.00
1,00E-01
< Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
