Abstracte achtergrond
Porphyromonas gingivalis
is betrokken als een belangrijke ziekteverwekker in de ontwikkeling en progressie van chronische parodontitis. P. gingivalis
biofilmvorming in de subgingivale spleet speelt een belangrijke rol in het vermogen van de bacteriën om stress signalen buiten de cytoplasmatische membraan verdraagt. Sommige bacteriën gebruiken een duidelijke onderfamilie van sigma factoren om hun extracytoplasmic functies (de ECF onderfamilie) te reguleren. Het doel van dit onderzoek was om te bepalen of P. gingivalis
ECF sigma factoren van invloed op P. gingivalis
biofilmvorming.
Methoden
Om de rol van ECF sigma factoren in P. helderen gingivalis
chromosomale mutanten die een verstoring van elk ECF sigma-factor coderende gen werden geconstrueerd. Bacteriële groeicurven werden gemeten door de troebelheid van bacterieculturen. De hoeveelheid biofilm groeien op platen werd geëvalueerd door kristalviolet kleuring.
Resultaten
Vergelijking van de groeicurves van wild-type P. gingivalis
stam 33.277 en de ECF mutanten aangegeven dat de groei van de mutanten was iets lager dan die van de wildtype stam. De PGN_0274- en PGN_1740 defectieve mutanten hadden biofilmvorming in vergelijking met het wild-type (0,001 p
& lt) verhoogd; Echter, de andere ECF sigma factor mutanten of aangevuld stammen niet verbeteren biofilmvorming.
Conclusie
Deze resultaten suggereren dat PGN_0274 en PGN_1740 een belangrijke rol in de vorming van biofilm van P. gingivalis
spelen.
trefwoorden
Extracytoplasmic functie sigma factor biofilm Porphyromonas gingivalis
Parodontitis Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-15-4) bevat aanvullend materiaal, dat is beschikbaar voor geautoriseerde gebruikers. achtergrond
de anaërobe Gram-negatieve bacterie Porphyromonas gingivalis
wordt beschouwd als een van de belangrijke etiologische agenten van parodontitis [1]. Te koloniseren en te overleven in de gingivale spleet, P. gingivalis
moet kunnen aftasten en reageren op de heersende omgevingscondities, met inbegrip van temperatuurschommelingen, zuurstofspanning, pH, beschikbaarheid van voedingsstoffen en de aanwezigheid van andere bacteriële cellen. P. gingivalis
bezit transcriptiefactoren die bescherming tegen hitteschok stress of oxidatieve stress, zijn betrokken zoals RprY [2, 3] en OxyR [4]. Daarnaast is deze bacterie en andere bacteriën vormen biofilms bescherming tegen omgevingsstress [5]. Tandplak, een multispecies biofilm, georganiseerd op het tandoppervlak en periodontale weefsels van de menselijke mondholte [6]. Orale bacteriën in de biofilms overleven in de gingivale spleet gedurende langere tijd, waardoor gingivitis die uiteindelijk kan evolueren in parodontitis. Begrijpen hoe bacteriën ontsnappen omgevingsstress is zeer belangrijk voor het voorkomen van parodontitis.
Extracytoplasmic functie (ECF) sigmafactoren dienen bacteriële transcriptionele regulatoren in reactie op verschillende belastingen. De wild-type P. gingivalis
33.277 genoom codeert voor zes ECF sigma factoren (PGN_0274, PGN_0319, PGN_0450, PGN_0970, PGN_1108 en PGN_1740; GenBank: AP009380) [7]. PGN_1108 (W83 ORF nummer: PG1318) speelt een rol in de regulering van de mutatie frequentie in de bacterie [8]. PGN_0274 (W83 ORF nummer: PG0162) en PGN_0450 (W83 ORF nummer: PG1660) kan worden betrokken bij de post-transcriptionele regulatie van gingipain [9], en PGN_1740 (W83 ORF nummer: PG1827) is vereist voor het overleven van de bacterie in de aanwezigheid van zuurstof en oxidatieve stress, hemine opname en virulentie [9, 10].
in deze studie, de rol van ECF sigmafactoren in P. gingivalis
biofilmvorming analyseren verstoring van de ECF sigmafactoren, behalve PGN_1108 werd uitgevoerd. De PGN_1108-mutant kan een mutator fenotype hebben, en we uitgesloten derhalve Aanbevolen experimenten in dit onderzoek [8]. De PGN_0274 en PGN_1740-defecte mutanten vertoonden verbeterde biofilm formatie, maar de aangevuld stammen niet. Deze resultaten suggereren dat de PGN_0274 en PGN_1740 ECF sigma factoren zijn betrokken bij de regulatie van biofilmvorming in de bacterie.
Werkwijzen Bacteriële stammen en celkweekcondities
Al bacteriestammen en plasmiden gebruikt in de onderhavige studie in Tabel 1. P. gingivalis
cellen genoteerd werden anaëroob gegroeid (10% CO
2, 10% H 2 en 80% N 2) in verrijkte hersenen het hart infusie (BHI) bouillon en verrijkte op tryptische soja (TS) agar [11]. Voor agarplaten werd laked gedefibrineerd schapenbloed toegevoegd aan TS agar verrijkt 5%. Voor selectie en instandhouding van antibioticaresistente P. gingivalis
stammen werden de volgende antibiotica toegevoegd aan het medium: 15 ug /ml erythromycine (Em), en 0,7 ug /ml tetracycline (Tc) .table 1 Bacteriële stammen en plasmiden die in deze studie
Strain of plasmide
Beschrijving
Reference of bron
E. coli
stam
DH5a
Algemene doel gastheerstam voor het klonen van
Invitrogen
P. gingivalis
stam
33.277
wild type
ATCC
KDP314
PGN_0274 :: ERMF ermAM,
EMR
Deze studie
KDP315
PGN_0319 :: ERMF ermAM,
EMR
Deze studie
KDP316
PGN_0450 :: ERMF ermAM,
EMR
Deze studie
KDP317
PGN_0970 :: ERMF ermAM,
EMR
Deze studie
KDP319
PGN_1740 :: ERMF ermAM,
EMR
Deze studie
KDP314C
KDP314 /pKD828,
EMR Tcr
Deze studie
KDP319C
KDP319 /pKD829,
EMR Tcr
Deze studie
E. coli
plasmide
pGEM-T Gemakkelijk
april, plasmidevector voor TA klonen
Promega
pKD355
april,
bevat de ERMF ermAM
DNA-cassette tussen Eco
RI en Bam
HI van pUC18
12
pKD814
april, bevat de 1,0-kb PCR-geamplificeerde fragment (PGN_0450 regio) in pGEM -T Makkelijk
Deze studie
pKD817
april, bevat de 1,5-kb PCR-geamplificeerde fragment (PGN_0274 regio) in pGEM-T Gemakkelijk
Inloggen Deze studie
pKD818
april, bevat de 2,0-kb PCR-geamplificeerde fragment (PGN_0319 regio) in pGEM-T Gemakkelijk Gids Deze studie
pKD819
april, bevat de 2,0-kb PCR-geamplificeerde fragment (PGN_0970 regio) in pGEM-T Gemakkelijk
Deze studie
pKD821
april, bevat de 2,0-kb PCR-geamplificeerde fragment (PGN_1740 regio) in pGEM-T Gemakkelijk Gids Deze studie
pKD822
april EMR, bevat de ERMF ermAM
DNA-cassette bij Bam
-plaats binnen PGN_0274 van pKD817 Gids Deze studie
pKD823
april EMR, bevat de ERMF ermAM
DNA-cassette bij Bam
-plaats binnen PGN_0319 van pKD818 Gids Deze studie
pKD824
april EMR, bevat de ERMF ermAM
DNA-cassette bij Bam
-plaats binnen PGN_0450 van pKD814 Gids Deze studie
pKD825
april EMR, bevat de ERMF ermAM
DNA-cassette bij Bgl
II plaats binnen PGN_0970 van pKD819 Gids Deze studie
pKD827
april EMR, bevat de ERMF ermAM
DNA-cassette bij Bam
-plaats binnen PGN_1740 van pKD821 Gids Deze studie
P. gingivalis
plasmide
pT-COW
april TCR E. coli-P. gingivalis
shuttle plasmide
14
pKD828
april TCR PT-koe- PGN_0274 +
Deze studie
pKD829
april TCR pT-koe- PGN_1740 +
Deze studie
bouw van ECF sigma factor mutanten en aangevuld mutante stammen
Om de ECF sigma factor genen verstoren, PGN_0274-, PGN_0319-, PGN_0450-, PGN_0970- en PGN_1740-coderende genen werden PCR-geamplificeerd van het chromosomale DNA van P. gingivalis
33.277 behulp Takara Ex Taq (Takara Bio, Otsu, Japan) en genspecifieke primers vermeld in Tabel 2. het geamplificeerde gebied was een DNA fragment met deel van het 5 'uiteinde van elk ECF sigma factor gen en het stroomopwaartse gebied van het ATG initiatiecodon en een DNA-fragment dat het 3 'uiteinde van elke sigma factor gen en het stroomafwaartse gebied van het stopcodon. Beide fragmenten werden vervolgens geligeerd in de meervoudige kloneringsplaats van T-vector (pGEM-T Easy-vector, Promega, Tokyo, Japan). Een Bam-HI
SacI-fragment (
Bgl II-SacI-fragment van
PGN_0970) met het 3 'uiteinde van elke sigma factor gen werd van het resulterende plasmide geëxtraheerd en geligeerd in de BamHI
HI-Sac I-plaats
(
Bgl II-SacI-fragment
voor PGN_0970) van het plasmide dat het 5 'uiteinde van de overeenkomstige ECF gen. De ERMF
-ermAM
cassette van pKD355 [12] werd in de Bam
-plaats binnen PGN_0274 van pKD817, PGN_0319 van pKD818, PGN_0450 van pKD814 en PGN_1740 van pKD821 of de Bgl
II gestoken plaats binnen PGN_0970 van pKD819 te geven pKD822, pKD823, pKD824, pKD827 en pKD825, respectievelijk. Deze plasmiden werden gelineariseerd door Not
I vertering en geïntroduceerd in P. gingivalis
33.277 cellen door elektroporatie zoals eerder beschreven [13], wat resulteert in KDP314 (PGN_0274 :: ERMF ermAM
), KDP315 (PGN_0319 :: ERMF ermAM
), KDP316 (PGN_0450 :: ERMF ermAM
), KDP317 (PGN_0970 :: ERMF ermAM
) en KDP319 (PGN_1740 :: ERMF ermAM
). Juiste genvervanging van deze stammen, die gegenereerd waren door dubbele crossover recombinatie gebeurtenissen, werd geverifieerd door PCR en Southern blot analyse (gegevens niet getoond) .table 2 Primers gebruikt in deze studie Mijn Naam
nucleotidesequentie (5′-3′)
PGN0274-U-F
TCGACAGTTGATTGCCGAT
PGN0274-U-R-Bam
HI
GGGATCCCCATCGAAAGACTGCAATCTGG
PGN0274-D-F-Bam
HI
GGGATCCCATGACGACGCCGCTCCTGTCGAAA
PGN0274-D-R
TGTGCAAAAAAGGAAACAGC
PGN0319-U-F
GCTGCCGCTCCTTCTTCAT
PGN0319-U-R-Bam
HI
GGGATCCCAAAGGCAGATCGTCCGGTA
PGN0319-D-F-Bam
HI
GGGATCCCCTCCGATCATGCCCCTA
PGN0319-D-R
TCAGGCTCTTGTACAGATGGA
PGN0450-U-F
GGGATGTGGAGAAAAAGGAA
PGN0450-D-R
ATGACCACGGACAGGAAGAT
PGN0970-U-F
ACCGGGAAATAATTCTCAAGC
PGN0970-U-R-Bgl
II
AAGATCTTCCAAAGAGGTCGGATAAGGA
PGN0970-D-F- Bgl
II
AAGATCTTAGGCTGCCGAGGTACAGGA
PGN0970-D-R
ACACAAGCTACAGCCCCGTA
PGN1740-U-F
GAGGATCTCCCTGCCAATAAT
PGN1740-U-R-Bam
HI
GGGATCCCACCCAGCCTTTGAAGTTGACA
PGN1740-D-F-Bam
HI
GGGATCCCGCTCACTGTCATGCGAAAT
PGN1740-D-R
CCAACGGCTATTTAGCATCC
PGN0274-COMP-U-F-Pst
I
CCTGCAGGCTGCTACTGTCTCGGACGTG
PGN0274-COMP-D-R-Bam
HI
GGGATCCCGTTTGTGTTTGAGGCTGCAT
PGN1740-COMP-U-F-Bam
HI
CGGGATCCCGAGTGCGATATCGGGAATCAG
PGN1740-COMP-D-R-Bam
HI
CGGGATCCCGAGTTGATACGGCTGCTATGC
Restrictieplaatsen opgenomen in oligonucleotides voor subklonering zijn vet.
Voor complementatie van PGN_0274 en PGN_1740, de hele ECF sigma factor-gen regio met zijn upstream en downstream flankerende gebieden (0,5 kb) werd PCR-geamplificeerd van het chromosomale DNA met behulp van Takara Ex Taq de bovenste en onderste primers (Tabel 2). De geamplificeerde DNA-fragmenten werden geligeerd in de meervoudige kloneringsplaats van pGEM-T Easy-vector. Het Sph I-Bam
-fragment van PGN_0274 of
BamHI-fragment van PGN_1740 werden uit het resulterende plasmide en geligeerd in de Sph
I-Bam HI
of Bam
HI plaats van pT-COW [14], die vriendelijk verzocht werd verzorgd door prof NB Shoemaker (Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign, USA). De resulterende plasmiden, pKD828 en pKD829, werden in KDP314 of KDP319 geïntroduceerd door elektroporatie, waardoor KDP314C en KDP319C respectievelijk na 7 dagen incubatie op verrijkte TS agar bevattende 0,7 ug /ml tetracycline. De aanwezigheid van pT-koe-afgeleide plasmide werd geverifieerd door PCR en herstel van het mRNA van het gemuteerde gen werd vastgesteld door RT-PCR (gegevens niet getoond).
Evaluatie van biofilmvorming vermogen
Biofilmvorming werd onderzocht door het gewijzigde protocol van Saito [15]. In het kort werden P. gingivalis
cellen geënt in BHI bouillon, en voorgekweekt anaëroob bij 37 ° C gedurende 2 d. Volgroeide kweken van P. gingivalis stammen
troebelheid was ingesteld op OD 660 = 0,1 met vers medium, en vervolgens werden 1,5-ml aliquots geënt in collageen type-I-gecoate 12-well platbodem microtiterplaten ( Iwaki Glass Co., Funabashi, Japan) en gekweekt anaëroob bij 37 ° C gedurende 2 d. Het kweekmedium werd daarna uit elk putje verwijderd en 0,5 ml 0,1% kristalviolet oplossing toegevoegd. Na 15 minuten werden de putjes driemaal gewassen met PBS en aan de lucht gedroogd. Het kristal nog in de biofilm violet werd opgelost met 0,5 ml 1% SDS en absorptie werd gemeten bij A 600 met behulp van een microplaat-afleesinrichting (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Biofilm massa werd bepaald door kristalviolet kleuring en aangepast voor groei (A 600 eenheden per OD 660 eenheid).
Statistische analyse
De one-way ANOVA Test /Dunnett's meervoudige vergelijking Test werd gebruikt om vergelijk de verschillen tussen 33.277 en ECF mutanten behulp van GraphPad Prism versie 6.0 voor Windows (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). De gegevens werden significant als p Restaurant & lt beschouwd; 0,05.
Resultaten
groei en biofilmvorming vermogen van de P. gingivalis
ECF sigmafactor mutanten
Al vijf ECF mutanten groeiden langzamer dan de wild-type stam in exponentiële fase en uiteindelijke opbrengsten aan de ECF mutanten waren minder dan die van het wild-type na een 48-uur incubatie onder anaërobe omstandigheden (figuur 1). De PGN_1740 mutant toonde opmerkelijk trage groei in vergelijking met wild-type en andere ECF mutanten. De relatie tussen de activiteit en biofilmvorming ECF sigmafactoren evalueren, werd de biofilmvorming onderzocht op de wild-type en vijf ECF mutanten. Na kristalviolet kleuring van de biofilm, werd eerst oplosbaar gemaakt met ethanol. Het kristal nog in het wild-type violet, PGN_0319, PGN_0450, PGN_0970 en PGN_1740 mutant biofilm werd oplosbaar en gewonnen, maar in de PGN_0274 mutant, oplosbaar en extractie niet volledig waren (zie Aanvullende bestandsinformatie 1). Dus de biofilm massa van alle geteste stammen werd opgelost met SDS en gemeten. Onder de ECF mutanten, de biofilm massa van de PGN_0274 en PGN_1740 mutanten hoger dan het wild-type (Figuur 2). Collageen type I bevestigen invloed biofilmvorming, onderzochten we de biofilm met een niet-beklede plaat. De resultaten waren vrijwel gelijk (zie aanvullende bestand 2), de PGN_0274 mutant meer biofilm dan het wild-type geproduceerd. De wildtype en mutante PGN_1740 waren niet statistisch verschillend. Dit resultaat stelde de vorming van biofilm door de PGN_1740 mutant werd beïnvloed door het milieu, zoals de aanwezigheid van collageen type-I. Figuur 1 Groei van P. gingivalis 33.277 en ECF sigmafactor mutanten. Groeicurves van P. gingivalis
33.277 (wild-type, cirkel), PGN_0274 mutant (KDP314, open rechthoek), PGN_0319 mutant (KDP315; gesloten rechthoek), PGN_0450 mutant (KDP316; diamant), PGN_0970 mutant (KDP317; driehoek ), PGN_1740 mutant (KDP319; kruis) in verrijkte BHI bouillon. De getoonde gegevens zijn gemiddelden ± SD van drievoudige experimenten.
Figuur 2 Biofilmvorming door homotypische P. gingivalis 33.277 of ECF sigma factor mutanten. De stammen werden gekweekt op BHI bouillon verrijkte anaëroob bij 37 ° C in collageen type-I-gecoate 12-well platbodem microtiterplaten. Na 48 uur van de teelt, werd de georganiseerde biofilm massa geëvalueerd door kleuring met kristalviolet. (A) De foto's zijn een representatieve steekproef van elke experimentele stam. (B) Biofilmvorming bepaald door kristalviolet kleuring en gecorrigeerd voor de groei (A600 eenheden per OD660 eenheid). De getoonde gegevens zijn gemiddelde ± SD van drievoudige experimenten. *** P
& lt; 0,001, met een one-way ANOVA Test /Dunnett's meervoudige vergelijking Test.
Complementatie van de PGN_0274- en PGN_1740-defecte mutanten
Om te bepalen of de verbeterde biofilm massa werd veroorzaakt door het schrappen van PGN_0274 en PGN_1740, we geconstrueerd stammen waar de PGN_0274 en PGN_1740 werden hersteld. De PGN_0274 en PGN_1740 aangevuld stammen werden geconstrueerd door introductie van de pT-COW bevattende het wildtype PGN_0274 en PGN_1740 in elk van de mutanten. Deze complementatie herstelde de biofilmvorming mogelijkheid om het wildtype niveaus (figuur 3). Deze resultaten ondersteunen het concept dat PGN_0274 en PGN_1740 een belangrijke rol speelt bij het beheersen P. gingivalis
biofilmvorming. Figuur 3 Biofilmvorming door homotypische P. gingivalis 33.277, ECF sigma factor mutant en aangevuld mutante stam. De stammen werden gekweekt op BHI bouillon verrijkte anaëroob bij 37 ° C in collageen type-I-gecoate 12-well platbodem microtiterplaten. Na 48 uur van de teelt, werd de georganiseerde biofilm massa geëvalueerd door kleuring met kristalviolet. (A) de vorming van de Biofilm 33.277, PGN_0274 mutant en de aangevuld mutante stam werden vergeleken. (B) de vorming van de Biofilm 33.277, PGN_1740 mutant en de aangevuld mutante stam werden vergeleken. Biofilmvorming bepaald door kristalviolet kleuring en gecorrigeerd voor de groei (A600 eenheden per OD660 eenheid). De getoonde gegevens zijn gemiddelde ± SD van drievoudige experimenten. *, P
& lt; 0,05, en ***, blz Restaurant & lt; 0,001, met een one-way ANOVA Test /Dunnett's meervoudige vergelijking Test.
Discussie
Bacteriën soms tegenkomt een omgeving die ongunstig zijn voor hun overleving. De menselijke mondelinge microbiota wordt ook vaak beïnvloed door verschillende spanningen; Daarom moet het de mogelijkheid hebben om zichzelf te verdedigen hebben. Twee belangrijke regulatiemechanismen interactie met cytoplasmatische en extracytoplasmic regio's via alternatieve ECF sigmafactoren en fosforylatie-afhankelijke respons regulatoren (tweecomponentensystemen, TCS) [16, 17]. ECF sigmafactoren is aangetoond dat celenvelop processen (met behoud van de membraan /periplasmatische architectuur), zoals secretie, synthese exopolysacchariden, ijzer uitvoer en efflux synthese van extracellulaire proteasen [18] te reguleren. Bacterieel RNA polymerase kern (samengesteld uit twee subeenheden α, β subeenheid en β-subeenheid) bindt sigmafactoren. Meerdere sigmafactoren de bacteriële transcriptie initiatie factoren die specifieke binding van RNA-polymerase in staat te genpromotors. Daarentegen TCS typisch uit een membraangebonden histidine kinase dat een specifieke omgevingsprikkel en een overeenkomstige reactie regulator dat de cellulaire respons medieert, meestal door differentiële expressie van doelwitgenen [19] waarneemt. Interessant is dat een transcriptie regulator in Methylobacterium extorquens
, PhyR, geïdentificeerd en vastbesloten om domeinen combineren van beide systemen [20]. Tezamen ECF sigma factoren en TCS zijn essentiële factoren die bacteriën uit druk op het milieu te beschermen.
Verschillende P. gingivalis
ECF sigma factoren zijn eerder beschreven. Er is echter geen informatie over de ECF sigmafactoren die kunnen opereren in deze bacterie in reactie op biofilmvorming. In Bacillus subtilis
en Pseudomonas aeruginosa
worden ECF sigma factoren die betrokken zijn bij het reguleren van biofilm ontwikkeling [21, 22]. In deze studie hebben we onderzocht of de vorming van biofilm van P. gingivalis
wordt gereguleerd door ECF sigma factoren. Deze studie toonde aan dat PGN_0274 en PGN_1740 mutanten leverden hogere biofilmvorming dan die verkregen met het wild-type of andere ECF sigmafactor mutanten. De inactivatie van PGN_1740 verhoogde ook de expressie van FIMS
op het transcriptieniveau [9]. Fimbriae en kleine fimbriae invloed monospecies biofilms [23]. De transcriptie niveau van fims
werd onderzocht met behulp van RT-PCR, waarbij de FIMS
expressie toonde werd neerwaarts gereguleerd (zie Extra file 3). De resultaten toonden aan fims mag niet betrokken zijn bij het beheersen van de vorming van biofilm. Verder onderzoek is nodig om dit punt te verduidelijken. Ondernemingen De biofilm test bleek dat ethanol de biofilm massa niet volledig heeft op te lossen en te extraheren het kristal violet vlek voor de PGN_0274 mutant biofilm (zie Extra file 1). Daarom opgeloste we de biofilm massa SDS en mat de resulterende kristalviolet in het monster. De behoefte aan een strengere oplosmiddel gesuggereerd dat de biofilm matrix rond de mutant bestaat gedeeltelijk uit een eiwitcomponent. De biofilm extracellulaire polymere stoffen (EPS), samengesteld exopolysacchariden, eiwitten, nucleïnezuren en lipiden, een rol spelen als een verdediging structuur, de bescherming van bacteriën uit de gastheer immuunsysteem en antimicrobiële therapie [24]. Eiwit is een belangrijke component van EPS [25]. Aangezien de metabole routes van de PGN_0274 mutant worden veranderd door het verlies van de PGN_0274 ECF sigma factor, de eiwitopbrengsten in de PGN_0274 mutant talrijker zijn dan in de wild-type en de andere mutanten. Daarom onderzochten we het eiwit profiel van de ECF sigma mutanten vergeleken met wild-type (zie aanvullende bestand 4). De afbraak van de 75-K-250-k Da eiwitten werden aangetoond in het wild-type, PGN_0319, PGN_0450, PGN_0970 en PGN_1740 mutanten, maar niet in het PGN_0274 mutant. Deze verandering werd niet waargenomen in aanwezigheid van proteïnase inhibitors TLCK en leupeptine. De eiwitprofielen van het wildtype en mutanten ECF sigma waren bijna identiek. Samengenomen suggereren deze resultaten blijkt dit verschil in oplosbaarheid kan worden verklaard door de daling van Kgp en Rgp activiteit in de mutante PGN_0274 [9]. Kgp onderdrukt biofilmvorming en Rgp controleert microkolonie morfologie [26]. De SinR
ortholoog PGN_0088, een transcriptie regulator, fungeert als een negatieve regulator van exopolysaccharide accumulatie in wild-type P. gingivalis
[27]. PGN_0274 kunnen verschillende metabole routes dan PGN_0088 en fungeren besturen als een negatieve regulator van proteïne accumulatie.
Tot slot hebben we vastgesteld dat PGN_0274 en PGN_1740 een belangrijke rol spelen bij het P. gingivalis
biofilmvorming. Deze resultaten tonen voor de eerste keer dat P. gingivalis
ECF sigma factoren zijn betrokken bij biofilmvorming. PGN_0274 is betrokken bij de post-transcriptionele regulatie van gingipains [8]. Gingipain is een belangrijke virulentie-factor P. gingivalis
omdat gingipains vernietigen periodontale weefsels, immunoglobulinen en complementfactoren [28, 29]. Als PGN_1740 speelt een belangrijke rol bij oxidatieve stress responsen in de bacterie [8, 9], het overleven van de PGN_1740 mutant werd gereduceerd in de aanwezigheid van gastheercellen [9]. We hebben ook waargenomen in deze Ca9-22 cellen (gegevens niet getoond). Samengenomen tonen deze resultaten dat ECF sigmafactoren PGN_0274 en PGN_1740 zijn betrokken bij de virulentie van P. gingivalis
. Nader onderzoek naar de rol van de P. gingivalis
ECF sigma factoren, PGN_0274 en PGN_1740, zal ons helpen begrijpen het vermogen van P. gingivalis
te koloniseren en te overleven in het tandvlees spleet, en dus fungeren als een menselijk pathogeen .
Conclusies
de massa van de biofilm van de PGN_0274 en PGN_1740 mutanten was hoger dan die in het wild-type, wat suggereert dat P. gingivalis
extracytoplasmic functie sigmafactoren PGN_0274 en PGN_1740 zijn betrokken bij de vorming van biofilm.
Afkortingen
ECF:
Extracytoplasmic functie
BHI:
Brain Heart Infusion
TS:
Tryptic soja
Em:
Erythromycin
Tc:
Tetracycline
PCR:
Polymerase kettingreactie
ANOVA:
variantieanalyse
TCS:
Twee- deelsystemen
SDS:
Natriumdodecylsulfaat
EPS:.
extracellulaire polymere stoffen
verklaringen
Dankwoord
Wij danken de leden van de afdeling Orale Microbiologie, Matsumoto Dental University, en Microbiologie, Tokyo Dental College, voor nuttige discussie. Deze studie werd ondersteund door een Grant-in-Aid (24792372) voor wetenschappelijk onderzoek van het ministerie van Onderwijs, Wetenschap, Sport, Cultuur en Technologie, Japan, en dit onderzoek werd ook gesteund door Oral Health Science Center Grant HRC8 van Tokyo Dental College , en door een Project voor particuliere universiteiten. matching fund subsidie van MEXT (Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie) van Japan, 2010-2012
Electronic aanvullend materiaal
12903_2014_492_MOESM1_ESM.pptx Extra file 1: vergelijkingen van biofilm behandeld met ethanol of SDS (PPTX 456 KB) 12903_2014_492_MOESM2_ESM.pptx Extra file 2:.. Biofilmvorming door homotypische P. gingivalis 33.277 of ECF sigma factor mutanten met behulp van niet-gecoate microplaat (PPTX 80 KB) 12903_2014_492_MOESM3_ESM.pptx Aanvullende bestandsinformatie 3:. Het RNA expressie van fims in P. gingivalis 33.277, PGN_1740 mutant en aangevuld mutante stam (PPTX 101 KB) 12903_2014_492_MOESM4_ESM.pptx Extra file. 4: Eiwit profiel op een SDS-PAGE gel (PPTX 343 KB) Competing belangen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen. bijdragen
Authors '
SO en YK eveneens bijgedragen aan dit werk. SO en YK geplande het onderzoek, voerde de experimenten en data-analyse, en schreef het manuscript. Koji Nakayama, NO en KI deelgenomen plannen en ontwerpen van de studie en in de data-analyse. MN en TI speelde het voortbestaan studie in gastheercellen en geholpen om het manuscript op te stellen. KS, EK en YS hielp met de microbiologie studies. Keisuke Nakano, TK en HH hielp met de microbiologie studies en begeleid schrijven van het manuscript. Alle auteurs hebben gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
