Abstracte achtergrond
Een belangrijk element voor de lange termijn succes van tandheelkundige implantaten is de integratie van het implantaat oppervlak met de omliggende weefsels gastheer. Wijziging van titanium implantaat oppervlakken kunnen osteoblasten activiteit te verhogen, maar de effecten ervan op de weke delen cellen zijn onduidelijk. Hechting van menselijke keratinocyten en gingivale fibroblasten om commercieel puur titanium (CpTI) en twee oppervlakken die anodeoxydatie werd daarom onderzocht te controleren. Aangezien botver- blootgesteld aan een bacterie-rijke omgeving in vivo
, werd het effect van orale bacteriën op keratinocyten hechting geëvalueerd.
Methods Ondernemingen De oppervlakken werden gekarakteriseerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Het aantal aan elkaar hechtende cellen en bindingssterkte, en vitaliteit van fibroblasten en keratinocyten werden geëvalueerd met behulp van confocale scanning laser microscopie na kleuring met Live /Dead Bac
licht. Om het effect van de bacteriën op de naleving en de vitaliteit te evalueren, werden keratinocyten samen gekweekt met een vier-species streptokokken consortium.
Resultaten
SEM-analyse toonde de twee anodisch geoxideerde oppervlakken nano-gestructureerd met verschillende graden van pore- zijn dichtheid. Dan 24 uur, zowel fibroblasten en keratinocyten hechtte goed aan de nanogestructureerde oppervlakken, zij het in iets mindere mate dan CpTI (bereik 42-89% van de niveaus CpTI). De kracht van keratinocyten hechting was groter dan die van de fibroblasten maar geen verschillen in hechtsterkte kan worden waargenomen tussen de twee nanogestructureerde oppervlakken en CpTI. Het consortium van commensal streptokokken duidelijk verminderd keratinocyten hechting op alle oppervlakken evenals afbreuk te doen aan het membraan integriteit van de aangehechte cellen.
Conclusie
Zowel de vitaliteit en het niveau van de hechting van de weke delen cellen aan de nano-gestructureerde oppervlakken was vergelijkbaar met die op CPTI. Co-kweek met streptokokken verminderde het aantal keratinocyten op alle oppervlakken tot ongeveer hetzelfde niveau veroorzaakt celbeschadiging, wat suggereert dat commensale bacteriën kunnen beïnvloeden hechting van zacht weefsel cellen steunvlakken in vivo
.
Sleutelwoorden
Oral keratinocyten Gingival fibroblasten Cell attachment Implantaatoplossingen Surface modificatie Orale bacteriën Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-75) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers. achtergrond
Door hun over het algemeen goede klinische resultaten, tandheelkundige implantaten zijn nu een gemeenschappelijke behandeling voor de vervanging van verloren of ontbrekende tanden. De belangrijkste elementen voor het lange termijn succes van dergelijke implantaten zijn de vorming van een stabiele verbinding tussen de gastheer botweefsel en de armatuur oppervlak (osseointegratie) en integratie van de component transmucosale of aanslag, waarbij de zachte weefsels. Eerder is veel onderzoek gericht op het optimaliseren van osseointegratie maar meer recentelijk de aandacht verschoven naar de ontwikkeling van biomaterialen die de vorming van een peri-implantaat zacht-weefselbarrière verbeteren omvatten. In de mondholte worden implantaatabutments uitsteken door het slijmvlies blootgesteld aan een complexe omgeving speeksel en gingivale exsudaat, en micro-organismen. De microbiële belasting in de mondholte is zeer hoog en maximaal 700 verschillende soorten worden [1]. Na plaatsing, het aanligoppervlak sterk wordt gekoloniseerd door orale bacteriën die kunnen concurreren met epitheel en bindweefselcellen voor binding aan het oppervlak (voor een overzicht zie [2]). Typische voorbeelden van de vroege kolonisten op zowel harde als zachte weefsels in de mondholte zijn streptokokken, met inbegrip van Streptococcus gordonii
, Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis Kopen en Streptococcus sanguinis
, evenals soorten zoals Actinomyces naeslundii
[3, 4]. Hechting van deze micro-organismen aan het steunoppervlak kan bindingsplaatsen voor een nieuwe set kolonisators uiteindelijk leidend tot de vorming van rijpe plaque [5, 6].
Natuurlijke tanden bacteriële invasie in de periodontale zachte weefsels beperkt fysiek door de gingivale mucosa, waarbij een afdichting rond de nek van de tand vormt. Het epitheel fungeert ook als een fysiologische barrière door het vrijkomen van moleculen betrokken bij aangeboren immuniteit, waaronder antimicrobiële peptiden en cytokines, evenals de inleiding van ontstekingsreacties [7]. Bij tandheelkundige implantaten de natuurlijke barrière bestaande uit junctionele epitheel en de periodontale ligament ontbreekt, waardoor de betekenis van een zacht weefsel manchet van epitheelcellen en fibroblasten stevig aan de aanslag. Studies in honden hebben gesuggereerd de peri-implantaat mucosa kan een afdichting door een manchet van verhoornde slijmvlies vorm hebben analoog aan de omringende natuurlijke tanden [8] en lagen van epitheelcellen vastgesteld in nauwe samenwerking titanium oppervlakken geïmplanteerd in de orale mucosa [9]. Bovendien histologische studies tonen aan dat epitheelcellen kunnen hechten aan titanium oppervlakken door middel van hemi-desmosomen lijken op die in de interne basale lamina [10]. De opstelling van zacht weefsel in de mucosale interface is aangetoond beïnvloed door modificatie van titanium implantaat oppervlaktetopografie met oxidatie of etsen, alsook chemische modificatie met laminine 5 [11, 12]. Onlangs is de rol van nanostructuren op titanium implantaat oppervlakken weefselgenezing een belangrijke focus van belang geworden. Nanostructuren zoals nanoporiën en nanotubues kan worden door anodische oxidatie, een elektrochemische werkwijze waarbij variabelen zoals spanning, elektrolytconcentraties en tijd kan worden gevarieerd om verschillende nanotopographies maken. Hoewel effecten van modificaties op de nanometer niveau osteoblasten zijn uitvoerig bestudeerd [13, 14], kennis over nanostructuren beïnvloeden peri-implantaat zacht weefsel genezen is momenteel beperkt. De weinige
in vivo studies die bij ratten [15], honden [16] of mens [17] (Wennerberg et al.
) Hebben uitgevoerd suggereren dat het gebruik van nanogestructureerde titanium steunoppervlakken zacht weefsel kan verbeteren genezing. Een in vitro
studie van Zile et al
. [18] blijkt dat de dichtheid van de keratinocyten op Nanotubular en nanorough oppervlakken verhoogd vergeleken met die van conventionele titanium oppervlakken dat voor fibroblasten, zijn dergelijke studies shown verhoogde celadhesie aan nanogestructureerde oppervlakken die anodische oxidatie [19] maar daalde naleving nano-gestructureerde titanium coatings op siliconen [20]. Hoewel deze in vitro studies
gebleken werpen op mogelijke positieve effecten van dergelijke oppervlakken, in vivo
er gedurende de eerste stadia van genezing is veel complexer, waarbij celhechting plaatsvindt in aanwezigheid van vroege kolonisatie mondbacteriën zoals orale streptokokken. Derhalve in deze studie hebben we de hechting van menselijke keratinocyten en gingivale fibroblasten onderzocht nanostructuur titanium oppervlakken en tevens de werking van een bacterieel consortium met Streptococcus gordonii
, Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis Kopen en Streptococcus sanguis
van adhesie van keratinocyten aan de oppervlakken.
Methods
Titanium oppervlakken
titanium schijven (8 mm in diameter en 2 mm dikte) met drie verschillende oppervlakken werden gebruikt in deze studie. Commercieel zuiver titaan discs (CpTI) werden gebruikt als controles (C) en twee anodisch geoxideerde oppervlakken (N1 en N2) werden als testoppervlakken. N1 werd bereid door anodeoxydatie op commercieel zuiver titanium terwijl N2 werd bereid door anodeoxydatie op titaanlegering (Ti
6V 4). Auger elektronen spectroscopie analyse onthulde de oxidelaag op de N1 en N2 oppervlakken groter dan 100 nm dik en de gemiddelde contactdruk hoeken voor de controle zijn N1 en N2 oppervlakken toonden geen significante verschillen (51 ° ± 2, 42 ° ± 1 ° , 38 ° ± 0,3 °, respectievelijk) [21]. Profilometrie metingen van de gemiddelde ruwheid (Sa) blijkt dat alle oppervlakken glad van topografie met Sa van 0,18 urn voor het stuurvlak en 0,17 urn en 0,21 urn respectievelijk de N1 en N2 oppervlakken [21]. Vóór gebruik werden titanium schijven gereinigd ultrasoon behandeling bij 70% PRO-analys ethanol gedurende 2 x 10 minuten, gevolgd door wassen met steriel ultrazuiver water gedurende nog eens 2 x 10 minuten.
Scanning elektronenmicroscopie
oppervlaktemorfologie van het titanium schijven werd onderzocht met een Zeiss Ultra 55 scanning elektronenmicroscoop. Beelden werden bij 8000 x vergroting genomen met een secundaire elektronen detector met behulp van een 10 kV versnellende spanning en een objectief diafragma van 30 micrometer.
Menselijke gingivale fibroblasten
Human tandvlees fibroblast kweken werden vastgesteld op basis van tandvlees biopten verkregen uit twee gezonde proefpersonen (leeftijd 11-13 jaar) met geen klinische verschijnselen van parodontitis. De Zweedse centrale Ethical Review Board, Stockholm ingestemd met de collectie van biopten en de oprichting van de fibroblast cellijnen (register nummer 377/98). Gehakte stukken tandvlees werden geëxplanteerd op 25 cm 2 weefselkweek kolven (Falcon) met 5 ml DMEM aangevuld met penicilline (50 eenheden /ml), streptomycine (50 ug /ml) en 5% foetaal kalfsserum (FCS ) (Invitrogen Life Technologies, Schotland, UK). Gingivale fibroblasten verkregen door trypsinisatie van de primaire cel uitgroei werden bij 37 ° C met 5% CO 2 en routinematig gepasseerd met behulp 0,025% trypsine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 0,02% EDTA bij 90% confluentie. Human gingivale fibroblasten tussen de 9e en 14e passages werden gebruikt in deze studie.
Menselijke orale keratinocyten
Onsterfelijk normale menselijke orale keratinocyten (OKF6 /tert-2) [22], verkregen van Dr James Rheinwald (Brigham and Women's Hospital, Boston, USA) werden uitgezaaid in kweekschalen in serumvrij keratinocyt medium (Gibco) aangevuld met 0,2 ng ml -1 humane recombinante epidermale groeifactor, 25 ug ml runder-extract -1 en 0,3 mM CaCl 2 met 1 IU penicilline ml -1 en 1 ug streptomycine ml -1 (DF-K medium) en gekweekt in 5% CO 2 in lucht bij 37 ° C. Het medium werd vervangen na 1 dag en elke daaropvolgende 2-3 dagen tot de cellen 30-50% confluentie bereikten. Cellen werden gepasseerd via 0,05% trypsine-EDTA (Gibco).
Celadhesietest
Titanium schijven werden in 24-well weefselkweekplaten (Becton Dickinson), geënt met hetzij keratinocyten of gingivale fibroblasten (1 x 10 5 cellen in 1 ml DF-K medium of DMEM aangevuld met penicilline (50 eenheden /ml), streptomycine (50 ug /ml) en 5% foetaal kalfsserum, respectievelijk) en geïncubeerd in 5% CO 2 in lucht bij 37 ° C gedurende 24 uur. Dit tijdstip werd gekozen, omdat een voldoende aantal cellen om had gehecht de resultaten zijn betrouwbaar weinig celdeling had plaatsgevonden. De schijven werden voorzichtig gewassen met PBS om niet-ingeschreven cellen te verwijderen en gekleurd met Live /Dead Bac
Licht kleuring kit (Molecular Probes). Hechtende cellen werden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Weten hoe goed de cellen werden vastgemaakt aan de ondergrond werd een standaard wasprocedure die losjes gehecht cellen [23] te verwijderen. Note in kweekschalen met 1 ml PBS werden geschud bij 100 rpm gedurende 2 x 5 minuten (IKA Vibrax rondschudapparaat, GMBH & amp; Co., Duitsland). Cellen die overblijven na deze procedure werden met de hand geteld na kleuren met Live /Dead Bac
Licht kleuring kit en beeld vast te leggen met behulp van fluorescentie microscopie. Het aantal cellen die overblijven na het wassen werd uitgedrukt als een verhouding van controle (aantal cellen aanwezig voor het wassen).
Bacteriële stammen
Klinische isolaten van S. gordonii
(HC7), S. mitis
(BA7), S. oralis
(89C) en S. sanguinis
(FC2) werden gebruikt in deze studie. S. gordonii
, S. mitis Kopen en S. sanguinis
werden verkregen uit approximaal tandplaque, terwijl S. oralis
werd geïsoleerd uit een peri-implantaat infectie. S. gordonii
werd geïdentificeerd door positieve fenotypische tests voor N
acetyl-glucosaminidase, N
-acetylgalactosaminidase, α-fucosidase en β-galactosidase terwijl identificatie van S. mitis
was gebaseerd op positieve fenotypische tests voor N
acetyl-galactosaminidase, N-acetyl
glucosaminidase, β-galactosidase en sialidase.
Identificatie van S. sanguinis
was gebaseerd op fenotypische testen negatief voor sialidase, arbinosidase, L- fucosidase, α-glucosidase en stevig vasthouden aan MSA agar en S. oralis
geïdentificeerd gebaseerd is op positieve fenotypische test op N
-acetylglucosaminidase en sialidase en een negatieve test voor D-fucosidase, naast sequentiebepaling van het GDH Kopen en ddl
genen [24]. Bacteriën werden gekweekt op agar in een atmosfeer van 5% CO 2 in lucht bij 37 ° C. Kolonies werden overgebracht naar Bacto Todd-Hewitt-bouillon (TH) (Becton Dickinson & amp; Co) en gedurende de nacht gekweekt in 5% CO 2 in lucht bij 37 ° C. De suspensies werden overgebracht naar verse TH medium en geïncubeerd bij 37 ° C tot het midden-exponentiële groeifase bereikt (A 600 ≈ 0,5), overeenkomend met 10 7 cellen /ml. Log fase kweken van elke stam werden daarna gemengd (1: 1: 1: 1) tot vier species consortium en gecentrifugeerd (4000 g
) werd verkregen voor 10 min. De pellets werden daarna opnieuw gesuspendeerd in serumvrij keratinocyt medium (Gibco) aangevuld met 0,2 ng ml -1 humane recombinante epidermale groeifactor, 25 ug ml runder-extract -1 en 0,3 mM CaCl 2 een eindconcentratie van 10 7 cellen /ml.
effect van orale bacteriën op keratinocyt hechting Belgique om het effect van orale bacteriën op keratinocyten hechting te bestuderen, werden schijven titanium geënt met 1 ml OKF6 /tert-2-cellen en deze liet men hechten gedurende 16 uur. Hierna 1 ml van de vier soorten bacterieel consortium bevattende 10 7 cellen in serumvrij keratinocyt medium zoals hierboven beschreven, werd toegevoegd en de schijven vervolgens geïncubeerd in 5% CO 2 in lucht bij 37 ° C gedurende nog eens 8 uur. Na een totale incubatietijd van 24 uur werden de schijven voorzichtig met serumvrij medium keratinocyt gewassen om niet-gehechte cellen en de resterende hechtende cellen gekleurd met Live verwijderen /Dead Bac
Light kleuringskit (Molecular Probes) voorafgaand aan visualisatie een fluorescentiemicroscoop. De sterkte van de hechting van bacteriën behandelde cellen aan het substraat te beoordelen, dezelfde gestandaardiseerde wasprocedure zoals hierboven beschreven werd gebruikt. Alternatief werden titanium schijven geënt met 1 ml van de vier soorten bacterieel consortium bevattende 10 7 cellen in serumvrij keratinocyt medium (5% CO 2 in lucht bij 37 ° C) gedurende 2 uur en gewassen drie maal met serumvrij medium keratinocyt vóór de toevoeging van 1 x 10 5 cellen in 1 ml serumvrij medium voor keratinocyt 22 uur.
Beeldanalyse en statistieken
Experimenten werden uitgevoerd driemaal met gebruikmaking onafhankelijke cel en bacterieculturen. Voor alle experimenten werden opnamen met dezelfde gestandaardiseerde twintig punten op de oppervlakken, het vermijden van de middelpunt en het buitenste randen van de schijven. De resultaten van de test oppervlakken werden vergeleken met controle met ANOVA met Bonferroni post-test en p-waarden beneden 0,05 werden significant beschouwd.
Resultaten
oppervlakte morfologie
oppervlak SEM microfoto van de controle en CpTI anodisch geoxideerde oppervlakken worden getoond in figuur 1. het oppervlak van de CpTI regelschijf heeft een anisotrope topografie vergelijkbaar met die van de bewerkte commerciële implantaten. Zowel het anodisch geoxideerde oppervlakken (N1 en N2) had poriën in het 50 nm. Op het oppervlak N1, de porie dichtheid is hoog en de poriën zijn gelijkmatig verdeeld over het oppervlak dat op de N2 oppervlakken, de poriën dunner verdeeld en gegroepeerd, waardoor er grotere porie-gebieden. Figuur 1 SEM afbeeldingen CpTI en anodisch geoxideerde oppervlakken. Representatieve beelden van de controle (CpTI) (C) en anodisch geoxideerde oppervlakken (N1 en N2). De schaal bar vertegenwoordigt 1 micrometer.
Attachment van menselijke gingivale fibroblasten om nano-gestructureerde titanium oppervlakken
Therapietrouw van de menselijke gingivale fibroblasten om de drie vlakken, CpTI controle, N1 en N2 werd onderzocht. De cellen werden toegestaan te hechten gedurende 24 uur, voorafgaand aan de kleuring met Bac
licht Levend /Dood en visualisatie in een fluorescentiemicroscoop. Beeldanalyse toonde de cellen een langwerpige morfologie kenmerk van fibroblasten (Figuur 2a) hebben. Op het CpTI stuurvlak, de celdichtheid relatief hoog (figuur 2a), wat overeenkomt met ongeveer 781 ± 87 cellen mm -2 (Figuur 2b). Niveaus van de dekking voor de N2 oppervlakte waren (669 ± 26 cellen mm -2), wat overeenkomt met 85% van de controle, terwijl de dekking op de N1 oppervlak (328 ± 84 cellen mm -2) kwam overeen met 42% controle (Figuur 2a, b). De verlaging van de N1 oppervlak was significant op het 5% -niveau vergelijking met de controle. Dus de gingivale fibroblasten vertoonden een iets lagere capaciteit te houden aan de N1 dan de controle en N2 oppervlakken. Figuur 2 Hechting van humane gingivale fibroblasten CpTI control (C) en nanostructuren (N1 en N2) oppervlakken. (A) verkleefd cellen werden gekleurd met Live /Dead Bac
Licht en bekeken in een fluorescentiemicroscoop. De schaal balk geeft 50 micrometer. (B) grafieken die gemiddelde aantal aan elkaar hechtende cellen ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. Gegevens werden geanalyseerd met ANOVA met Bonferroni post-test (* p & lt; 0,05).
Een assay op basis van het aantal cellen verwijderd met een standaard wasprocedure werd toegepast om de hechtingssterkte van de fibroblasten op de bepaling drie vlakken. Het aantal hechtende cellen die overblijven na de behandeling werd gekwantificeerd en berekend als een percentage van het initiële aantal cellen op hetzelfde oppervlak. Hieruit bleek dat het CpTI stuurvlak, 33 ± 0,7% van de cellen bleef na het wassen terwijl voor de N1 en N2 oppervlakken, de overeenkomstige cijfers waren respectievelijk 44 ± 6,8% en 23 ± 2,7%. Deze gegevens geven aan dat er geen verschil tussen de hechtsterkte van de gingivale fibroblasten CpTI de controle en de nanogestructureerde oppervlakken.
Hechting van orale keratinocyes titanium oppervlakken Ondernemingen De ander zacht weefsel cellen van belang integratie van tandheelkundige implantaten zijn orale keratinocyten, en daarmee de hechting van deze cellen om de drie vlakken werd ook getest. Na 24 uur, de keratinocyten waren levensvatbaar en bleken als clusters van cellen met een typische morfologie veelhoekige, gelijkmatig verdeeld over het oppervlak van de titanium schijven (figuur 3a). Op het CpTI stuurvlak, het gemiddelde aantal cellen was 470 ± 73 mm -2. Het gemiddelde aantal cellen op de N1 oppervlak (419 ± 107 mm -2) was vergelijkbaar met die op de CpTI dat deze op de N2 oppervlak enigszins lager (284 ± 27 mm -2). Deze waarden komen overeen met 89% en 60%, respectievelijk, van het niveau op het stuurvlak. Geen van deze verschillen was significant op het 5% -niveau (figuur 3b). De kleefkracht van de keratinocyten op het oppervlak werd onderzocht met het wassen assay. Soortgelijke verhoudingen van de gehechte cellen bleef drie oppervlakken na het wassen, wat suggereert dat de adhesiesterkte van de keratinocyten werd niet beïnvloed door de aanwezigheid van nanostructuren (linker kolom, tabel 1). Figuur 3 Hechting van menselijke orale keratinocyten te CpTI control (C) en nanostructuren (N1 en N2) oppervlakken. (A) verkleefd cellen werden gekleurd met Live /Dead Bac
Licht en bekeken in een fluorescentiemicroscoop. De schaal balk geeft 50 micrometer. (B) grafieken die gemiddelde aantal aan elkaar hechtende cellen ± SEM van drie onafhankelijke experimenten
Tabel 1 op keratinocyten CpTI (C) en nanogestructureerde oppervlakken (N1 & amp; N2). Na een gestandaardiseerd wassen, uitgedrukt als percentage van de voorwas niveaus voor hetzelfde oppervlak
keratinocyten nog op oppervlakken na het wassen
Surface
- Bacteriën
+ Bacteriën
C
83 ± 5,5%
96 ± 0,3%
N1
75 ± 1,4%
83 ± 3,5%
N2
94 ± 1,5%
87 ± 4,6%
invloed van orale streptokokken op de binding van keratinocyten
in het gebied waar de aanslag komt langs orale epitheel, keratinocyten verbonden aan het aanslagvlak worden blootgesteld aan de mondelinge microbiota. Daarom is de invloed van een consortium van de vroege kolonisten op keratinocyten therapietrouw werd onderzocht. De aanwezigheid van bacteriën tijdens de laatste 8 uur van de hechting periode veroorzaakte een aanzienlijke daling van het aantal keratinocyten vinden op alle oppervlakken ten opzichte van het peil van de afwezigheid van bacteriën (figuur 3b), maar dit verschil was niet significant bij de 5% -niveau (figuur 4a, b). Kleine aantallen bacteriën werden gevonden als clusters geassocieerd met zowel het titanium oppervlak en de hechtende keratinocyten. Deze gegevens suggereren dus dat de aanwezigheid van bacteriën ofwel het vermogen van de keratinocyten te binden aan het oppervlak of veroorzaakt loslaten aan elkaar hechtende cellen verminderd. Interessant is dat de kern van de keratinocyten blootgesteld aan de bacteriën gedurende 8 uur toonde rood of oranje kleuring met het Bac
licht Levend /Dead vlek die niet werd waargenomen in de onbelichte keratinocyten (figuur 5). Dit geeft aan dat propidium iodide de cellen was getreden en illustreert beschadiging van de celmembraan. De aanwezigheid van de bacteriën dus niet alleen bleek een vermindering van het netto aantal cellen hechten aan het substraat na 24 uur veroorzaken, maar ook beïnvloed cellevensvatbaarheid. Om het effect van bacteriën op adhesiekracht van keratinocyten te onderzoeken, werd het wassen assay ook toegepast op cellen die hiervoor zijn blootgesteld aan de bacteriën. Na deze behandeling werd geen significante afname in het aantal cellen op het oppervlak tegenover de voorwas niveaus die voor een van de oppervlakken (rechter kolom, tabel 1). Deze resultaten suggereren derhalve bacteriën beïnvloedde de sterkte van de hechting van de keratinocyten op de verschillende oppervlakken. De hechting van de keratinocyten aan oppervlakken reeds door het consortium van orale streptokokken gekoloniseerd werd ook onderzocht. Na 2 uur, oppervlaktebedekking door het consortium was ongeveer 50% en 20 uur na de toevoeging, slechts sporadisch hechting van keratinocyten waargenomen (gegevens niet getoond). Dus de aanwezigheid van vroege kolonisatie van bacteriën op het titanium oppervlak duidelijk geremd latere hechting van keratinocyten. Figuur 4 Hechting van menselijke orale keratinocyten te CpTI control (C) en nanostructuren (N1 en N2) oppervlakken geïncubeerd met een combinatie van orale streptococci. (A) verkleefd cellen werden gekleurd met Live /Dead Bac
Licht en bekeken in een fluorescentiemicroscoop. De schaal balk geeft 50 micrometer. (B) grafieken die gemiddelde aantal aangehouden cellen ± SEM van drie onafhankelijke experimenten.
Figuur 5 Effecten van een consortium van orale streptokokken op keratinocyten. Humane orale keratinocyten werden gekweekt op stuurvlakken (C) in de afwezigheid (linker paneel) of aanwezigheid (rechter paneel) van een consortium van orale streptokokken. De schaal balk geeft 50 micrometer.
Discussie
Eerder veel werk is gericht op de wijziging van TiO 2 oppervlakken Osseo-integratie en studies te verbeteren zowel osteoblasten therapietrouw hebben onderzocht in vitro
[13, 14] en weefselintegratie in vivo
[25]. Echter, er nog steeds grote leemten in kennis omtrent de hechting en de functie van zacht weefsel cellen bij de aanslag slijmvliesgrensvlak. In deze studie, de hechting van fibroblasten en keratinocyten twee oppervlakken; één gevormd door anodische oxidatie op CpTI (N1) en de andere, gevormd door anodische oxidatie op een titaanlegering (N2), werd vergeleken met die bij een controle CPTI oppervlak. Zowel de gemodificeerde oppervlakken waren nanostructuren met poriën in de 50 nm over het gehele oppervlak. Echter, verschilden zij porie dichtheid, meer dun verspreid poriën met grotere poriën-gebieden op de N2 dan op het oppervlak N1. Naast nanoschaal modificatie kunnen anodische oxidatie veranderingen in het bulkmateriaal oppervlak veroorzaken en de TiO 2 oppervlaktelagen van N1 en N2 is aangetoond dat hogere kristallijne anatase dan CpTI control [21] bevatten. Hoewel cytotoxische effecten op bacteriën in aanwezigheid van UV-straling [26] is waargenomen, is weinig bekend over de effecten van oppervlakte-geassocieerde anataas op eukaryote cellen. In deze studie is echter de anataas-rijke N1 en N2 oppervlakken lieten geen cytotoxische effecten op hetzij fibroblasten of keratinocyten. Ondernemingen De bindingspatroon van humane gingivale fibroblasten enigszins verschillen van die van keratinocyten. Zowel fibroblasten en keratinocyten konden binden aan het CpTI controle en de nanogestructureerde oppervlakken. Hoewel het niveau van de hechting van fibroblasten aan de N2 oppervlakken vergelijkbaar met die op CpTI controle was, hechting aan het oppervlak N1 significant verlaagd. Voor keratinocyten, hoewel het aantal cellen was enigszins lager op de N2, waren er geen significante verschillen in de totale celdichtheid op het nanogestructureerde oppervlakken vergeleken met die op CPTI controle. De gegevens blijkt dus dat de aanwezigheid en de verdeling van de poriën geen invloed op de hechting van orale keratinocyten terwijl voor gingivale fibroblasten, een hoge porie dichtheid verminderde hechting had. Dit suggereert dat binding van gingiva fibroblasten werd beïnvloed door de aard van het substraat dat deze keratinocyten niet beïnvloed in dezelfde mate. In een onderzoek door Ma et al
., De aanwezigheid van nanotubules met een diameter van ongeveer 100 nm gereduceerd fibroblast hechting vergeleken met een gepolijste titanium control [27] terwijl Guida et al
. toonde verhoogde fibroblast naleving van geoxideerde nanogestructureerde oppervlakken tegenover gedraaid titanium controles [19]. Conclusies over de effecten van nano-structuren op fibroblast functie zijn dus moeilijk te trekken uit de huidige literatuur. Voor keratinocyten, data is beperkt, maar Zile et al
. [18] blijkt dat nano-buizen titanium oppervlakken promoten hechting vergelijking met conventionele nano-gladde oppervlakken. In deze studie, het aantal keratinocyten vastzit aan de conventionele titanium oppervlak vergelijkbaar met die van de stuurvlakken in de studie, hoewel geen toename van de celdichtheid op het nanogestructureerde oppervlakken hier gebruikt werd waargenomen. Ondernemingen De vorming van een afdichting tussen het implantaat en het omringende zachte weefsel wordt geacht bij te dragen aan het behoud van gezonde weefsels rond een implantaat [28, 29]. Studies uitgevoerd bij honden hebben aangetoond dat sol-gel afgeleide nanoporeuze titanium oppervlakken de ontwikkeling van hemidesmosomal interacties tussen het mondslijmvlies en implantaatoppervlak [16] kan induceren. Ook bij de mens, contact tussen het mondslijmvlies en titanium implantaten werd versterkt in aanwezigheid van sol-gel afgeleide titanium oxide films [17]. Daarom is de kleefkracht van de keratinocyten en fibroblasten werd onderzocht onder toepassing van een procedure die zwak gehechte cellen verwijderd. Een soortgelijke werkwijze is eerder gebruikt om de hechting van epitheelcellen en fibroblasten titaan [23] onderzoeken. De resultaten van dit onderzoek lieten geen verschillen in hechtsterkte van keratinocyten of fibroblasten aan het anodisch geoxideerde oppervlakken tegenover CpTI controle suggereert dat de nanostructuren niet de sterkte van de hechting van beide typen cellen niet beïnvloedde.
Dit komt overeen met de bevindingen van een ander in vitro
studie waarin kleefkracht van fibroblasten niet werd beïnvloed door oppervlakte omstandigheden en materialen [30]. Maar fibroblasten werden verwijderd in grotere mate uit alle oppervlakken dan de keratinocyten, hetgeen een lagere totale hechtsterkte voor deze cellen.
Meeste in vitro
studies de invloed van implantaatoppervlak onroerend goed gastheercel hechting geweest uitgevoerd in bacteriën ruimten. Maar wanneer een aanslagoppervlak wordt in de mondholte, kan de capaciteit van zacht weefsel cellen, in het bijzonder keratinocyten, vasthouden beïnvloed door de aanwezigheid van micro-organismen in de orale omgeving. Het effect van een consortium van de vroege kolonisatie streptokokken op hechting en hechting sterkte van de keratinocyten werd daarom onderzocht. Keratinocyt hechting grotendeels geïnhibeerd als bacteriën reeds op de titanium oppervlakken suggereert dat zacht weefsel genezing sterk kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van microbiële biofilms op het aanligvlak waren. Blootstelling van het bevestigen keratinocyten dezelfde bacteriën verminderd celdichtheid ongeveer 50% en de integriteit van de celmembraan van de overblijvende cellen leek te worden aangetast. Terwijl de celschade waargenomen hier was enigszins verrassend omdat orale streptococci worden gewoonlijk niet beschouwd als pathogeen werden vergelijkbare resultaten verkregen in in vitro studies waarbij
osteoblasten werden blootgesteld aan de huid commensale, Staphylococcus epidermidis
[31, 32] . Het is bekend dat commensale streptokokken produceren een reeks van metabole eindproducten zoals lactaat, acetaat, ethanol en formiaat en enzymen (glycosidasen en proteasen) en bacteriële antigenen waaronder lipoteichoic acid (LTA), die mogelijke mechanismen voor de waargenomen kan worden beschouwd celbeschadiging [33, 34]. Terwijl keratinocyten kunnen reageren op LTA door middel van Toll-like receptoren [35], de effecten van andere stoffen op keratinocyten functie op dit moment niet goed begrepen. Alle auteurs hebben gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
