Abstracte achtergrond
Debridement en ontsmetting van het wortelkanaal systeem is een cruciale stap in endodontische procedures. De doeltreffendheid van irrigatie zich tegelijkertijd de mechanische spoelende werking en het vermogen van irrigants weefsel lossen en bacteriën te doden. Het doel van deze studie is het evalueren en vergelijken van de cytotoxiciteit van QMix ™ wortelkanaal irrigatie oplossing vereeuwigd menselijke beenmerg mesenchymale stamcellen (hTERT-MSC-C1) en te vergelijken met die van natriumhypochloriet (NaOCl).
Methods
Onsterfelijk menselijk beenmerg mesenchymale stamcellen (hTERT-MSC's) werden blootgesteld aan QMix ™ en NaOCl. Levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) en AlamarBlue assays. De celmorfologie werd bestudeerd na twee uur blootstelling aan QMix ™ en NaOCl. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) analyses werden uitgevoerd na 2 en 4 uur incubatieperiode. Tenslotte werd ethidiumbromide /acridine oranje (EB /AO) fluorescentiekleurstof bij de cellen in de 8-chamber slides nadat ze werden geïncubeerd met de testen middelen voor 2 uur levende en dode cellen te detecteren. De waarnemingen werden getabelleerd en statistisch geanalyseerd.
Resultaten
QMix ™ blootstelling leidde tot een significant hoger percentage levensvatbaarheid van de cellen dan NaOCl in de MTT en AlamarBlue assays op drie tijdstippen vergeleken met de controle. De SEM-analyse toonde minimale morfologische veranderingen geassocieerd met cellen die werden blootgesteld aan de QMix ™ oplossing, met weinig krimp en fragmentatie van de celwand. Het levende /dode analyse bleek dat het aantal levende cellen na blootstelling aan QMix ™ was vergelijkbaar met die van de onbehandelde controle. Geen celstructuur kon worden waargenomen met de NaOCl groep, met vermelding van cellysis.
Conclusie
Zowel de QMix ™ en NaOCl oplossingen giftig voor de menselijke beenmerg MSC's waren. Elke oplossing kan celdood geïnduceerd op een andere wijze, zoals blijkt uit de cellevensvatbaarheid, SEM en fluorescerende studies. Hoe langzamer celdood geïnduceerd door QMix ™ zou daarom minder agressief en meer aanvaardbaar voor levende weefsels zijn.
Sleutelwoorden
cytotoxiciteit natriumhypochloriet QMix ™ mesenchymale stamcellen wortelkanaalbehandeling irrigants Electronic aanvullend materiaal
de online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-27) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is achtergrond
het succes van endodontische behandeling is afhankelijk van de uitroeiing van de microben uit het wortelkanaal. systeem en de daarop volgende preventie van herinfectie. Wortelkanaalbehandeling irrigatie heeft een belangrijke rol in het succes van de endodontische behandeling. Tijdens en na instrumentatie, irrigants de verwijdering van micro-organismen, weefsel resten en dentine chips van het wortelkanaal door een spoeling vergemakkelijken [1, 2].
Een ideale wortelkanaal irrigatievloeistof oplossing moet niet-toxisch zijn, met een breed antimicrobieel spectrum en het vermogen om necrotische pulpa, inactiveren endotoxinen lossen, en ofwel de vorming van een smeerlaag of ontbinden [3, 4]. Nog geen enkele oplossing kan deze doelen te bereiken, en de gecombineerde, gelijktijdige of achtereenvolgende toepassing van twee of meer irrigatie oplossingen is dus geboden [5]. Natriumhypochloriet (NaOCl) en chloorhexidine digluconaat (CHX) worden twee veel voorkomende antibacteriële middelen gebruikt als een wortelkanaalbehandeling irrigants [5-7].
Momenteel natriumhypochloriet (NaOCl) (0,5-6,15%) en EDTA (15-17% ) zijn de twee meest gebruikte wortelkanaal irrigants [5, 8]. Hoewel natriumhypochloriet heeft de meeste van de gewenste eigenschappen, kan ook cytotoxiciteit en ernstige ontstekingsreacties [9, 10] produceren. Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) is effectief voor het verwijderen van de anorganische component van de smeerlaag [11].
Vanwege ongewenste resultaten, een combinatie van deze irrigants wordt ontraden [12-15]. Vandaar dat de sequentiële gebruik van EDTA, CHX en NaOCl werd bepleit door veel onderzoekers om een optimale wortelkanaalbehandeling irrigatie resultaten [16-18] te produceren. Het is noodzakelijk dat het wortelkanaal irrigants het genezingsproces van het apicale gebied niet mag belemmeren. De biologische compatibiliteit van deze materialen is belangrijk, omdat zij in contact komen met de peri-radiculaire weefsels komen.
QMix ™ is een 2-in-1 oplossing die een bisbiguanide antimicrobieel middel (2% CHX) en polyaminocarbonzuren zuur calcium-chelerende middel (17% EDTA) [19]. QMix ™ bleek effectief in het verwijderen van de smeerlaag te zijn en heeft ook aanzienlijke antimicrobiële eigenschappen [19-22]. Echter, gegevens betreffende de cytotoxiciteit van deze stof zijn niet beschikbaar. Daarom werd deze studie uitgevoerd om te evalueren en vergelijken van de cytotoxiciteit van de QMix ™ irrigatie oplossing vereeuwigd menselijke beenmerg mesenchymale stamcellen (hTERT-MSC-C1) met behulp van levensvatbaarheid van de cellen assays, celmorfologie evaluatie, en fluorescentie microscopie licht; 5,2% NaOCl werd gebruikt voor de vergelijking.
Methods
De studie werd door het faculteitsbestuur review board van College of Dentistry Research Centre, koning Saud University, Riyadh. Electronics Test oplossingen goedgekeurd
QMix ™ 2-in -1 (Dentsply Tulsa Dental, OK, USA) en 5,25% NaOCl (Clorox Co., Oakland, CA, USA) werden gebruikt in deze studie.
Celkweek
geïmmortaliseerde humane beenmerg mesenchymale stamcellen (hTERT- MSC-C1), in het 25
e passage, werden gebruikt voor alle experimenten in deze studie. Het protocol van Simbula et al. [23] werd gebruikt in deze studie, met enkele wijzigingen. Het menselijk beenmerg mesenchymale stamcellen werden verstrekt door professor Moustapha Kassem aan de Odense University Hospital, Denemarken [24]. De gecryopreserveerde cellen werden snel ontdooid, overgebracht in een T-75 kolf (BD Falcon ™, NJ, USA) en gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (Gibco®), dat werd aangevuld met glutamine (Gibco®), 1% penicilline-streptomycine (Gibco®), 10% foetaal runderserum (FBS Gibco®), en 1% niet-essentiële aminozuren (HyClone®), in een vochtige atmosfeer van 5% CO 2/95% O 2 bij 37 ° C. Bij 70% confluentie werd het medium afgezogen en de cellen werden gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Drie ml voorverwarmde 0,05% trypsine /EDTA (Gibco®) werd aan de kolf toegevoegd en de cellen werden gedurende 1 minuut. Na zachtjes te tikken, werd cel detachement gecontroleerd onder een omgekeerde lichtmicroscoop (Observer A1, Zeiss®, Göttingen, Duitsland), en 12 ml van de cultuur media werd vervolgens toegevoegd aan de kolf met het enzymatische effect van trypsine te neutraliseren. Voor celtelling werden twee monsters (10 ui) uit de celsuspensie na passende mengen. De monsters werden geplaatst in de bovenste en onderste kamers van een Neubauer telkamer hemocytometer (Paul Marienfeld GmbH & amp; Co. KG, Lauda-Königshofen, Duitsland), en de cellen werden handmatig geteld onder een omgekeerde microscoop (10x vergroting). De cellen werden gezaaid op verschillende platen en dia, zoals hieronder wordt besproken, voor elk deel van de studie. Alle procedures werden uitgevoerd in het kader van een klasse II laminaire stroming kap (LabGard ES 425 bioveiligheidskast, NuAire®).
MTT cellevensvatbaarheid-assay
cellen in 96-well platen (helder, vlakke bodem, polystyreen TC werden gezaaid behandelde 96-putjes) bij een concentratie van 1 x 10 4 cellen /putje en werden vervolgens gedurende 24 uur om celhechting aan de bodem van de putten toelaten. Kweekmedia werden vervolgens uit elk putje afgezogen en vervangen door 150 ul steriele oplossing (QMix ™ of NaOCl). Acht putjes werden als replica voor elke groep
Elke subgroep werd gedurende de volgende periode. 2, 4 of 24 uur. Vervolgens werd 10 ul van de MTT reagens (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) aan elk putje toegevoegd. Daarna werden 96-well platen verder geïncubeerd gedurende 3 uur bij 37 ° C. Tenslotte de oplossing uit elk putje afgezogen en 150 ui oplossend middel toegevoegd aan de formazan precipitaat op te lossen. De absorptie van elk monster werd gemeten met een microplaat reader (Epoch microplaat spectrofotometer, BioTek®) bij een golflengte van 570 nm. De gegevens werden verzameld met behulp van Gen5 Data Analyse Software (BioTek®, USA). Het experiment werd tweemaal herhaald voor elke groep in elk interval.
AlamarBlue (AB) cellevensvatbaarheid test
Dezelfde groepen die werden gebruikt voor de MTT assay (zie hierboven) werden voor de AB test met dezelfde intervallen. De testmiddelen werden toegevoegd aan elk putje. Na 2, 4 en 24 uur incubatietijd, 10% AB reagens (Serotec®, Oxford, UK) werd aan elk putje toegevoegd. Nadat de platen werden verder geïncubeerd gedurende 4 uur werd de fluorescentie van elk putje gemeten bij golflengten van 530/25 en 590/35 nm excitatie /emissie met een fluorescentie reader (BioTek®). De gegevens werden verzameld met behulp van de Gen5 Data Analyse Software (BioTek®, USA). Het experiment werd tweemaal herhaald voor elke groep in elk interval.
Celmorfologie beoordeling
Celmorfologie werd geëvalueerd met SEM na 2 en 4 uur na blootstelling aan de testoplossingen. Kort samengevat, 8 x 10 4 cellen /putje werden geënt op glazen dekglaasjes (1 x 1,5 cm) in 6-well platen (CellStar®, Carrollton, TX) gedurende de nacht. De volgende dag werden de cellen blootgesteld aan de testoplossingen. Twee ml van elke steriele irrigatie-oplossing werd op de objectglaasjes toegevoegd aan elk putje. Onbehandelde cellen werden in kweekmedium gehandhaafd. Direct na de testoplossingen werden toegevoegd, werden de cellen onder een omgekeerde LM (10x vergroting) bestudeerd. Aan het einde van de incubatietijd (2 en 4 uur), werden de oplossingen in elk putje afgezogen. De objectglaasjes werden gewassen met PBS en werden vervolgens gefixeerd met 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M Na cacodylaatbuffer (pH 7,2) bij kamertemperatuur. Daarna werden de monsters gewassen met 0,1 M natriumcacodylaat (pH 7,2).
Na fixatie werden de monsters behandeld met 1% osmiumtetroxide gedurende 1 uur. Vervolgens werden zij gewassen met gedestilleerd water en gedehydrateerd middels Graded ethylalcohol, in concentraties van 50%, 70%, 80%, 90% (5 minuten), 95% (tweemaal, 15 minuten) en tenslotte 100% absolute alcohol (tweemaal 30 minuten). De monsters werden gedroogd met behulp van een kritisch punt droger met CO 2 (Sadri-PVT-3B). Glaasjes werden gemonteerd op koper stompjes met dubbele plakband en werden vervolgens goud sputteren bekleed tot een dikte van 5-7 urn. De monsters werden vervolgens waargenomen en gefotografeerd met behulp van een JSM-6360 LV scanning elektronenmicroscoop.
Twee beoordelaars beoordeelden de microfoto. De celmorfologie werd beschreven volgens de volgende criteria: de vorm van de cel (normaal of abnormaal vergeleken met de controle), bevestiging aan de ondergrond, hechting aan andere cellen, cytoplasmatische oppervlak extensies (blebs of microvilli) en celwand integriteit. Ronding van de cellen, de aanwezigheid van blebs of losraken van de cellen aangegeven meer celschade [25, 26].
Live /dead analyse
Twee oplossingen werden geselecteerd voor de live /dead analyse. Een gemodificeerd Eagle's medium (MEM) zonder fenolrood (Gibco®, Gaithersburg, MD) werd gebruikt voor dit experiment. In het kort werden cellen uitgezaaid in drie 8-kamer objectglaasjes (Lab-Tek®) bij een concentratie van 1,5 x 10 4 cellen /putje en werden vervolgens gedurende 24 uur om celadhesie optreedt. Het kweekmedium elk putje werd vervangen door 300 ul van elke oplossing en daarna gedurende 2 uur. Tenslotte 10 pl EB /AO fluorescente kleurstof werd toegevoegd aan elke kamer, en de fluorescentie van de cellen werd geanalyseerd onder een tl omgekeerde microscoop (ECLIPSE Ti, Nikon, Tokyo, Japan), met 10X vergroting. Beelden werden vastgelegd met imaging software (NIS-elementen, Nikon, Tokyo, Japan). De EB /AO fluorescente kleurstof werd bereid door 15 mg acridine oranje met 50 mg ethidiumbromide poeder dat eerst werd opgelost in 1 ml 95% ethanol en vervolgens opgelost in 49 ml gedestilleerd water (dH 2O).
de beelden werden beoordeeld door twee beoordelaars volgens eerder beschreven criteria. Onder de groene filter, een intacte groene kern, vergelijkbaar met de controle geeft een levensvatbare cel, terwijl een groene gefragmenteerde kern geeft vroege apoptose. Een rode kern geeft een gebroken celwand, terwijl een rode intacte kern geeft necrose en een gefragmenteerde rode kern geeft late apoptose onder roodfilter [27, 28].
Data en statistische analyse
De resultaten van de MTT en AlamarBlue proeven werden berekend als percentages ten opzichte van de controle (100% = geen toxiciteit). De gegevens werden geanalyseerd met behulp van SPSS PC + versie 21.0 statistische software. Beschrijvende statistiek (gemiddelde en standaarddeviatie) werden gebruikt om continue uitkomstvariabelen te beschrijven. Student's t-test voor onafhankelijke
monsters werd gebruikt om de gemiddelde waarden te vergelijken van twee groepen. Een enkele variantieanalyse gevolgd door een meervoudige vergelijkingstest Tukey, werd gebruikt om de gemiddelde waarden van de drie groepen te vergelijken. Een p-waarde van & lt; = 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
MTT
MTT-assay werd uitgevoerd op drie groepen (QMix ™ groep NaOCl groep en controlegroep) met gekweekte hTERT-MSC in 96-putjesplaten . Elke groep werd gedurende 2, 4 en 24 uur. De cellevensvatbaarheid voor elke groep wordt weergegeven als percentage van de controlegroep op elk tijdstip. Het percentage levensvatbare cellen van elke oplossing is weergegeven in figuur 1. Wanneer de cellen werden blootgesteld aan de oplossing van 2, 4 en 24 uur, de levensvatbaarheid van de cellen verminderde in de tijd. De levensvatbaarheid van cellen blootgesteld NaOCl was significant lager dan die van cellen blootgesteld aan QMix ™ helemaal tijdsintervallen (P & lt; 0,05). Figuur 1 De cellevensvatbaarheid percentage NaOCl en QMix oplossingen op 2, 4 en 24 uur na blootstelling door MTT assay.
AlamarBlue assay
AB assay werd uitgevoerd voor de QMix ™, NaOCl en controlegroepen met gekweekte hTERT-MSC in 96-well platen. De cellevensvatbaarheid voor elke groep wordt weergegeven als het percentage van de controlegroep. De cellevensvatbaarheid percentage van elke oplossing is weergegeven in figuur 2. Wanneer de cellen werden gedurende 2 of 4 uur, de cellevensvatbaarheid van de NaOCl was significant lager dan die van de QMix ™ (P & lt; 0,05). Figuur 2 de cellevensvatbaarheid zowel NaOCl en QMix ™ oplossingen met AlamarBlue assay op 2, 4 en 24 uur blootstelling.
Celmorfologie
Onbehandelde negatieve controle cellen vertoonden variabele vormen, waaronder ruitvormig, driehoekig, ovaal en spil vormen, zoals geïllustreerd door lichtmicroscopie LM (figuur 3) Cellen werden aan elkaar en aan het substraat. De celwand leek glad en intact, met enkele microvilli en oppervlak extensies. Volgens de LM onderzoek, het toxische effect van de testoplossingen werd onmiddellijk na de toepassing ervan op de gekweekte humane beenmerg MSCs, en de normale celmorfologie anders werd veranderd in elke groep (figuur 3). Een hoge concentratie (0,5 mg /ml) NaOCl veroorzaakt de vacuolisatie van het cytoplasma (figuur 3B), terwijl QMix ™ bij dezelfde concentratie geproduceerde enkele veranderingen in de celwand en geen vacuolisatie (Figuur 3C). Figuur 3 Human beenmerg hTERT-MSC's in het kader van omgekeerde LM na het toevoegen van het testen middelen (X10). A- Onbehandelde cellen, B - cellen blootgesteld aan (0,5) Qmix ™ -oplossing (de cel vorm werd onderhouden met enkele wijzigingen), C- cellen blootgesteld aan (0,5) NaOCl; vacuolisatie was duidelijk in het cytoplasma.
Volgens de SEM-analyse, het aantal cellen verlaagd vergeleken met de controle na 2 uur blootstelling aan 0,5 mg /ml NaOCl. De resterende cellen werden kleiner, met een draadvormig of ronde vorm (figuur 4). Cellen werden losgemaakt van de ondergrond en cel tot cel bijlagen verloren. Lysosomale afscheidingen die uit de cel werden waargenomen, en de kern werd geëxtrudeerd door de gescheurde celwand. Figuur 4 Human beenmerg hTERT-MSC's blootgesteld gedurende 2 uur aan QMix en NaOCl. A - QMix ™ (X100), B - QMix ™ (x1000), C - NaOCl (X100, let op de ronde of thread-achtige vorm van het overblijfsel cellen), D- NaOCl (x1000, de gescheurde celwand en het geëxtrudeerde kern ).
Na 2 uur blootstelling aan QMix ™, het aantal cellen en celvorm waren vergelijkbaar met die van de controlegroep, met uitzondering van de aanwezigheid van een vage cel omtrek. Echter werden de cellen nog steeds gebonden aan naburige cellen en het substraat (figuur 4). In sommige gebieden, werden resten van celprocessen waargenomen. De belangrijkste dramatische verandering in de celmorfologie werd in de celwand, die een maas-achtige verschijning (figuur 4B) had, wat aangeeft desintegratie. Na 4 uur, de verandering van celmorfologie belangrijker was: de zeefvormige uiterlijk van de cellen werd intenser, met een slecht gedefinieerde vorm en een fading overzicht, en gebroken cel tot cel bijlagen waargenomen. De hechting aan het substraat werd gehandhaafd door sommige cellen (Figuur 5). Figuur 5 Human beenmerg hTERT-MSC's blootgesteld gedurende 4 uur tot QMix ™ en NaOCl. A- QMix ™ (X100), B-QMix ™ (x1000), C - NaOCl (X100), D- NaOCl (x1000)
Live /dead-analyse met EB /AO kleuring
gekweekte menselijke beenmerg hTERT. -MSCs werden blootgesteld aan 0,5 mg /ml QMix ™ en NaOCl voor 2 uur. De EB /AO kleuring werd toegepast om de cellen, die vervolgens onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop onderzocht. De beelden voor elke groep weer te geven levende cellen in het groen en dode cellen in het rood. De behandelde cellen hadden intacte, goed gedefinieerde kernen, die groen onder de groene filter zijn, zie figuur 6A. Onder de rode filter, alleen het celoppervlak toonden rode fluorescentie, niet de kern, die een intacte celwand (figuur 6B) aangegeven. Wanneer de cellen werden blootgesteld aan QMix ™, het aantal cellen was vergelijkbaar met die van de controlegroep en de kernen werden groene, die vergelijkbaar zijn met het uiterlijk van de controlecellen was. Het enige verschil was dat sommige van deze cellen had gecondenseerd chromatine, die onder de rode filter (Figuur 6C, D) duidelijk was. Wanneer de cellen werden blootgesteld aan NaOCl, geen celstructuren, zoals de kern of celmembraan, waargenomen; cellysis was duidelijk, en het overige materiaal was positief voor zowel de groene en rode fluorescentie (figuur 6E, F). Figuur 6 Levende /dode analyse humaan beenmerg hTERT-MSC's onder een fluorescentiemicroscoop (X10). 6A, 6B - onbehandelde cellen met de groene filter, de kern wordt intact, dat een levensvatbare cel aangeeft. 6B-met de rode filter, de kern verschenen donker en alleen het uitwendige oppervlak van de cellen was rood, wat aangeeft dat de celwand intact. 6C, 6D- behandeld met QMix ™ onder een fluorescentiemicroscoop (X10), 6E, 6F- behandeld met NaOCl onder een fluorescentiemicroscoop (X10).
Discussie
Deze in vitro
verricht om het beoordelen cytotoxiciteit van de QMix ™ irrigatie-oplossing op de menselijke beenmerg MSC's. MSC's zijn voorgesteld als een goed model voor toxicologische testen [29]. De MSC's die werden gebruikt in deze studie werden onsterfelijk gemaakt door de ectopische expressie van humaan telomerase reverse transcriptase (TERT-h), waarbij de levensduur van de cellen [24] vergroot en behielden hun stam-achtige eigenschappen [30]. Eerdere studies hebben gemeld dat geïmmortaliseerde cellen kunnen worden gebruikt als testmodel voor tandheelkundige materialen [31]. Ondernemingen De opmerkingen van de studie toonde aan dat beide oplossingen (QMix ™ en NaOCl) toxisch zijn voor menselijke beenmerg MSCs en veroorzaken celbeschadiging . Dit is consistent met de resultaten van eerdere studies die gerapporteerd NaOCl toxiciteit [23, 32, 33]. NaOCl toxiciteit kan worden toegeschreven aan de hoge pH (hydroxylion actie), die interfereert met cytoplasmatisch membraan integriteit [34]. Bovendien zijn onze resultaten zijn in overeenstemming met die van een eerder in vivo
studie, waaruit bleek dat QMix ™ giftig en kan een ontstekingsreactie [35] induceren. CHX is een toxisch middel dat bindt aan de cel plasmamembraan en verhoogt de permeabiliteit, waardoor de lekkage van lysosomale enzymen [36]. EDTA, dat de tweede component QMix ™, ook bekend cytotoxisch, misschien vanwege zijn chelaatvormende effect en versterkt daling van de pH die veroorzaakt [11].
Cellevensvatbaarheid significant af wanneer de cellen werden blootgesteld aan NaOCl voor alle perioden onderzocht. Cellevensvatbaarheid aanzienlijk afgenomen na blootstelling aan de QMix ™ oplossing gedurende 2 of 4 uur. Bovendien, na 24 uur, cellevensvatbaarheid werd significant verlaagd vergeleken met 2 en 4 uur blootstelling. Deze bevindingen tonen aan dat het toxische effect van een middel geleidelijk toe met de tijd. Deze waarneming is in overeenstemming met die van eerdere studies, waaruit blijkt dat toxiciteit tijdsafhankelijke [37]. In tegenstelling, de MTT assay resultaten toonden een significante afname in de cel levensvatbaarheid van cellen die werden blootgesteld aan NaOCl helemaal tijdsperiode,. Vergeleken met QMix ™ -exposed cellen, NaOCl verminderde levensvatbaarheid op 2 en 4 uur.
Eerdere studies hebben gemeld dat de AB assay iets gevoeliger dan de MTT-bepaling. Zowel assays afhankelijk enzymatische metabolisme, wat kan worden geremd of geïnduceerd door het testen middel, waardoor een vals-positieve of vals-negatief resultaat. Daarom wordt een zorgvuldige interpretatie van de resultaten altijd aanbevolen [38]. Onze waarnemingen suggereren dat de AB test is een betere keuze voor cellevensvatbaarheid testen omdat het gemakkelijk is uit te voeren en consistenter dan de MTT-bepaling, en aanbevolen door eerdere studies [38, 39]. Het is echter altijd aanbevolen om meer dan één test gebruikt om de cytotoxiciteit te beoordelen. Daarom eerdere studies die uitsluitend gebaseerd op de MTT-test opnieuw moet worden geëvalueerd en geïnterpreteerd.
Microscopisch morfologisch onderzoek zijn nodig om cellulaire toxiciteit [40] bevestigen. Dit komt omdat een celtoxische veranderingen, zoals loslating kunnen ondergaan, terwijl blijven metaboliseren MTT tot formazan, wat resulteert in een overschatting van cellevensvatbaarheid in de MTT-bepaling in vergelijking met de AB-assay [38]. Daarom werden cellulaire morfologische kenmerken onderzocht voor beide oplossingen.
Cellen die werden blootgesteld aan QMix ™ weergegeven minder morfologische veranderingen. Deze waarneming is in overeenstemming met Faria et al., Die meldde dat hogere concentraties van CHX de vorm van de L929 cellen [41] zou behouden als gevolg van de cel fixatie-effect [42]. Ondernemingen De SEM beelden voor het QMix ™ groep toonden cytoplasmatische krimp met gedeeltelijk gefragmenteerde maar intacte celwanden. Deze eigenschappen zijn typerend voor apoptose, zoals eerder [40] beschreven. Daarnaast is de EB /AO kleuring toonde heldergroen gefragmenteerde kernen, met vermelding van het begin van apoptose [27]. De cellen blootgesteld aan NaOCl had cytoplasmatische krimp of gebroken vliezen, allemaal kenmerken van necrose [43] zijn. De EB /AO kleuring van de NaOCl groep weergegeven rood en groen, reflecterend restplaten dat het gevolg van cellysis kan zijn en geen celstructuur worden waargenomen. De algemene analyse van deze resultaten blijkt dat de cellen in de QMix ™ groepen zijn in de vroege stadia van apoptose, maar zijn nog niet dood, in tegenstelling tot de NaOCl groep. Zowel NaOCl en QMix ™ zijn cytotoxische; lijkt het echter dat hun wijze van celdoding verschilt als gevolg van hun verschillende samenstellingen. Volgens Galluzzi et al. [44], kan celdood worden ingedeeld in vier types op basis van de morfologische kenmerken van de stervende cellen: apoptose (type 1), autophagy (type 2), necrose (oncosis, type 3) en mitotische catastrofe. Elke modus van celdood heeft zijn eigen functie; necrose induceert een ontstekingsreactie wanneer het nodig is, terwijl apoptotische cellen in vivo
snel worden gefagocytoseerd zonder induceren van een ontstekingsreactie, die als mechanisme voor het vermijden immuunactivatie. Volgens onze bevindingen kan deze wijze van celdood zijn geassocieerd met een hoge concentratie blootstelling aan NaOCl.
Apoptose is een actieve vorm van celdood bekend als geprogrammeerde celdood, en wordt gekenmerkt door celinkrimping en nucleair chromatine condensatie gevolgd door nucleaire fragmentatie, de normale morfologische verschijning van cytoplasmatische organellen en het behoud van een intact plasmamembraan [44]. Volgens onze bevindingen kan deze wijze van celdood worden geassocieerd met QMix ™ blootstelling. Maar verdere merkers zoals detectie van caspasen gesplitst substraten, regulatoren en remmers zijn nodig om staven deze wijze van celdood gespeculeerd QMix ™ [45]. Celdood tot apoptose kan optreden via twee primaire wegen: een extrinsieke route die dood receptoren omvat, en een intrinsieke route die wordt gemoduleerd door leden van de Bcl-2 familie [46], bestaande uit buitenste mitochondriale membraan componenten [47] . Daarom worden mitochondriën als belangrijke organellen in de paden celdood naast de normale metabole activiteit [48, 49]. Echter kunnen deze eiwitten ook functioneren in sommige normale metabole routes. Aldus mitochondriale metabole activiteit onderzoeken, zoals de MTT-bepaling, moeten deze overlappingen tussen pre-apoptotische cel activiteit en normale celstofwisseling [40] overwegen. Deze overlap zou de tegenstrijdige resultaten van de AB en MTT-tests uit te leggen.
In vitro
cytotoxiciteit onderzoeken gemeld dat CHX hadden een hogere toxiciteit in celkweken dan NaOCl [33, 41]. Echter, in vivo
studies suggereren dat CHX of QMix ™ is minder agressief dan NaOCl [35, 50]. Dit verschil kan worden toegeschreven aan afweermechanismen die actief zijn in de in vivo
omgeving hosten
Onze in vitro
studie heeft de volgende beperkingen:. Het werd uitgevoerd op gekweekte cellen, en de resultaten vormen slechts de reactie van deze cellen geïsoleerd, zonder rekening te houden met de afweer mechanisme voor detoxificatie. Verder in een klinische omgeving, de oplossingen altijd wortelkanalen, waar omheen dentine, en vervolgens geëxtrudeerd om het periapicale gebied opgeleverd. Eerdere studies hebben gemeld dat het cytotoxisch effect van irrigants kan worden geneutraliseerd door dentine [33, 51]. We maakten de oplossingen direct op de cellen, en er werden geen pogingen gedaan om deze oplossingen via wortelkanalen leveren aan het klinische scenario nabootsen.
Conclusies
Binnen de beperkingen van dit onderzoek kan worden geconcludeerd dat zowel de NaOCl en QMix ™ oplossingen zijn giftig voor de menselijke beenmerg MSC's. De QMix ™ oplossing, die langzaam celdood induceert, lijkt meer biocompatibel zijn dan de NaOCl oplossing te zijn. originele ingediende dossiers Vandaar dat op basis van deze observaties, kan worden geconcludeerd dat de QMix ™ is een relatief veiliger wortelkanaalbehandeling irrigant vergelijking met NaOCl.
verklaringen
Authors 'voor beelden
Hieronder staan de links naar de auteurs 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12903_2014_352_MOESM2_ESM.tif Authors' 12903_2014_352_MOESM1_ESM.tif Auteurs originele bestand voor 'originele bestand voor figuur 3 12903_2014_352_MOESM4_ESM.tif Authors' figuur 2 12903_2014_352_MOESM3_ESM.tif Auteurs originele bestand voor figuur 4 originele bestand 12903_2014_352_MOESM5_ESM.tif Authors 'voor figuur 5 12903_2014_352_MOESM6_ESM.tif Authors 'originele bestand voor figuur 6 concurrerende belangen Ondernemingen de auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.
auteurs bijdragen
AK, SMA, AM en MAE het onderzoek heeft uitgevoerd, laboratorium procedures en evaluatie van de resultaten. SA, AK en AMA betrokken bij de ontwikkeling van het concept, het ontwerp van de studie, herziening van het manuscript en statistische analyse. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
