Abstracte achtergrond
Een aantal orale ziekten, met inbegrip van parodontitis, afkomstig van microbiële biofilms en zijn geassocieerd met verhoogde antimicrobiële resistentie. Ondanks het wijdverspreide gebruik van mondspoelingen gebruikt als aanvullende maatregelen om deze biofilms beheersen, is het langdurig gebruik niet aanbevolen vanwege verschillende bijwerkingen. Daarom zijn alternatieve breedspectrum antibiotica dat deze effecten te minimaliseren zeer gewild. Koolhydraat afgeleide fulvinezuur (CHD-FA) een organisch zuur dat eerder aangetoond microbiocide tegen Candida albicans
biofilms zijn derhalve het doel van deze studie was om de antibacteriële activiteit van CHD-FA onderzoeken tegen oraal verkregen biofilms en om adjunctieve biologische effecten te onderzoeken.
Methods
Minimum remmende concentraties werden geëvalueerd voor CHD-FA en chloorhexidine (CHX) tegen een reeks van bacteriën in de mond met behulp van gestandaardiseerde microdilutie testen op planktonische en sessiele. Scanning elektronenmicroscopie werd gebruikt om veranderingen in orale biofilms na antibioticabehandeling visualiseren. Cytotoxiciteit van deze verbindingen werd getoetst orale epitheelcellen, en het effect van CHD-FA op host inflammatoire markers werd bepaald door het meten van mRNA en eiwitexpressie.
Resultaten
CHD-FA was zeer actief tegen alle orale bacteriën getest, waaronder Porphyromonas gingivalis
met een vastzittende minimale remmende concentratie van 0,5%. Deze concentratie bleek meerdere soorten biofilms te doden met ongeveer 90%, die vergelijkbaar is met die van chloorhexidine (CHX). In een zoogdiercel cultuurmodel, voorbehandeling van epitheelcellen met gebufferde CHD-FA bleek significant neerwaarts reguleren toets ontstekingsmediatoren, waaronder interleukine-8 (IL-8), na stimulatie met meerdere soorten biofilm.
Conclusies
algemeen CHD-FA bleek breedspectrum antibacteriële activiteit bezitten, met een extra functie te kunnen neerwaarts reguleren van ontsteking. Deze eigenschappen bieden een aantrekkelijk spectrum van de functie van een natuurlijk afgeleide verbinding, die kan worden gebruikt als een alternatieve topische behandelingsstrategie orale biofilm ziekten. Verdere studies in vitro en in vivo
zijn nodig om de precieze mechanisme waardoor CHD-FA moduleert de gastheer immuunreactie te bepalen.
Sleutelwoorden
Fulvinezuur chloorhexidine biofilm Antibacteriële Parodontitis Ontsteking Elektronische aanvullend materiaal
de online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-47). bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is achtergrond
Dental cariës, gingivitis en parodontitis zijn de meest voorkomende microbiële ziekten van de mondholte, waarbij het merendeel geassocieerd met een polymicrobiële biofilm [1, 2]. Biofilms zijn een verzameling van multicellulaire organismen aan elkaar bevestigd of op een oppervlak, en worden ingesloten door een beschermende laag van extracellulaire matrix (ECM) [3]. Biofilms zijn van meer klinisch belang dan hun vrij zwevende planktonische tegenhangers vanwege hun aangeboren vermogen om antimicrobiële therapie en gastheer afweer weerstaan. Dit komt door de uitgebreide ECM productie en andere factoren zoals verhoogde extrusie van antimicrobiële middelen door meer efflux pomp activiteit [3, 4].
Antimicrobiële mondspoelingen zijn een van de belangrijkste therapie en preventie momenteel gebruikt bij de behandeling van orale biofilm ziekten, waarvan chloorhexidine (CHX) op grote schaal als de 'gouden standaard' wordt aanvaard [5]. Deze antiseptisch middel heeft een superieure activiteit om de comparators, en is zowel cide en statische tegen micro-organismen aanwezig in orale biofilms met rollen in de pathogenese van orale ziekten. Bovendien zijn substantiviteit geeft langere activiteit door haar vermogen tot adsorptie op het vlies gevonden emailoppervlakken tanden [6]. Desondanks hebben verschillende studies aangetoond gebruik van CHX langdurig kan niet praktisch omdat het wordt geassocieerd met kleuring van de tanden en smaakveranderingen [7, 8]. Bovendien hebben recente meldingen van bijwerkingen, waaronder anafylactische reacties, om deze verbinding is beschreven [9]. Ook is onlangs aangetoond effectief tegen biofilms gekweekt uit klinische isolaten [10] is. Ondernemingen De preventie en behandeling van orale biofilm ziektes zoals periodontale ziektes en mucosale infecties, in aanmerking voor een verbinding die de potentie van CHX heeft met minimale bijwerkingen, maar ook opwekt bijkomende biologische eigenschappen, zoals verandering van ontstekingsreacties, die duidelijk betrokken in de pathogenese van orale biofilm ziekte [11, 12]. Een eerdere studie toonde CHX kan neerwaarts reguleren van ontstekingsmediatoren bij provocatie met een bacteriële stimuli [13], maar toxicologische aspecten van CHX de reden voor de verminderde expressie kan worden. We hebben ook aangetoond dat het voordeel van natuurlijke middelen in de behandeling van orale infecties, waarbij theeboomolie (TTO) was niet alleen niet-toxisch, maar kon de gastheer immuunreactie tegen een schimmel stimulus [14] temperen. Verder hebben onze fractie toe werd de antiseptische activiteit van koolhydraat afgeleide fulvinezuur (CHD-FA), waarin werd aangetoond dat de verbinding even effectief tegen Candida albicans
planktonische en biofilm cellen was. Mechanistisch deze werd geïdentificeerd als een membraan verstoring proces dat niet werd beïnvloed door vaste biofilm adaptieve resistentiemechanismen [15]. CHD-FA is een colloïdaal organisch zuur, dat een hoofdbestanddeel van humuszuren. Een gezuiverde vorm van CHD-FA is onlangs door een geoctrooieerde werkwijze, waarvan is aangetoond dat niet-toxisch in een rat wondmodel zijn, met suggesties anti-inflammatoire activiteit [16]. Bovendien is een recente gerandomiseerde, dubbelblinde, gecontroleerde trial aangegeven dat het goed verdragen in een klinische studie van eczeem [17].
Het doel van dit onderzoek was om te onderzoeken of CHD-FA heeft een breed spectrum van de activiteit tegen microbiële biofilms oraal belang om te bepalen of het kan worden gebruikt als alternatief voor gebaseerde mondspoelingen, die bijwerkingen van langdurig gebruik geweten chx. Het tweede doel van het onderzoek was te bepalen of de concentratie van antibacteriële CHD-FA had geen bijkomende immunomodulerende eigenschappen, zoals elders [16] beschreven. Wij rapporteren dat CHD-FA geeft snelle microbiocide activiteit tegen oraal relevante biofilms, en dat is ook in staat om neerwaarts reguleren van de expressie van pro-inflammatoire moleculen oraal relevante epitheelcellen.
Methods
kweekomstandigheden en normalisatie
Een selectie van laboratoriumstammen van commensale en pathogene bacteriën geassocieerd met orale biofilms ziekte werden in dit onderzoek, waaronder Porphyromonas gingivalis
ATCC 33.277 en Fusobacterium nucleatum
ATCC 10596, die op veeleisende anaëroob bij 37 ° C werden gehandhaafd agar (FAA [Lab M, Lancashire, UK]) onder anaerobe omstandigheden (85% N
2, 10% CO 2 en 5% H 2, [Don Whitley Wetenschappelijke Limited, Shipley, UK] ). Streptococcus mutans
10449, Streptococcus mitis
NCTC 12261, actinobacillus actinomycetemcomitans
OSM 1123 en Enterococcus faecalis
NCTC 5957 werden gekweekt en gehandhaafd op 37 ° C over Colombia agar (CBA [Oxoid, Hampshire, Groot-Brittannië ] in 5% CO 2. Alle isolaten werden voor onbepaalde tijd opgeslagen in Microbank® flesjes (Pro-Lab Diagnostics, Cheshire, UK) bij -80 ° C.
P. gingivalis Kopen en F. nucleatum
werden gekweekt in 10 ml Schaedler's anaërobe bouillon (Oxoid), S. mitis Kopen en A. actinomycetemcomitans
werden gekweekt in 10 ml Tryptic Soy bouillon (TSB [Sigma-Aldrich, Dorset, UK]) aangevuld met 0,6% gistextract en 0,8% glucose. E. faecalis
werd gekweekt in TSB met 0,25% glucose, en S. mutans
werd gekweekt in 10 ml brain Heart infusie (BHI [Sigma-Aldrich]), alle bij 37 ° C en bij geschikte weersomstandigheden. overnacht kweken werden gewassen door centrifugeren (1000 xg
) en geresuspendeerd in 10 ml PBS. Alle bacteriën werden vervolgens gestandaardiseerd en ingesteld op een uiteindelijke werking concentratie van 5 x 10 4 en 1 × 10 7 cellen /ml voor planktonische en sessiele gevoeligheidstesten, respectievelijk.
Antibacteriële gevoeligheid testen van planktonische en biofilm cellen
In de loop van deze studie twee actieve stoffen uit de producten voor mondhygiëne Dentracine (Fulhold Ltd, Cape Town, Zuid-Afrika) en Corsodyl (GlaxoSmithKline Consumer Health Care, UK) werden getest, namelijk CHD-FA en CHX, respectievelijk.
antimicrobiële tests om vast te stellen minimale remmende concentraties (MIC) van planktonische cellen (PMIC) werd uitgevoerd met behulp de CLSI M11-A8 bouillon microverdunningsplaten methode voor anaërobe bacteriën [18] en CLSI M7-A9 voor bacteriën gekweekt in 5% CO 2 [19]. Minimaal bacteriedodende concentraties (MBC) werden ook bepaald door standaard plating methoden.
Voor biofilm testen gestandaardiseerd P. gingivalis
, F. nucleatum, S. mitis Kopen en A. actinomycetemcomitans
werden gekweekt gedurende 72 uur en E. faecalis
gedurende 24 uur in hun respectieve media en atmosferische omstandigheden, met uitzondering van S. mutans
die werd gekweekt in BHI gesupplementeerd met 2% sucrose gedurende 48 uur. Biofilms werden statisch gekweekt in commercieel verkrijgbaar 96-well platte bodem microtiter platen (Corning Incorporated, NY, USA) en sessiele gevoeligheidstests werd uitgevoerd zoals elders [20] beschreven. Na antimicrobiële behandeling werden biofilms tweemaal met PBS gewassen en 10% alamarBlue® (Invitrogen, Paisley, UK) werd aan de biofilms toegevoegd voorafgaand aan incubatie gedurende 4 uur in het donker [21]. Sessiele minimale remmende concentraties (SMICs) visueel gelezen en geen verandering in kleur werd gedefinieerd als SMIC. Het testen van alle planktonische en sessiele isolaten werd uitgevoerd in viervoud op twee verschillende gelegenheden.
Antibacteriële gevoeligheid testen van een multi-species parodontale biofilm
Een multi-species parodontale biofilm model bestaande uit P. gingivalis
, F. nucleatum, S. mitis Kopen en A. actinomycetemcomitans
is ontwikkeld voor antimicrobiële testen. Alle bacteriële soorten werden genormaliseerd tot 1 x 10 7 cfu /ml in kunstmatige speeksel (AS) zoals eerder beschreven [22]. Deze bestond uit varkens maag mucinen (0,25% w /v), natriumchloride (0,35 w /v), kaliumchloride (0,02 w /v) calciumchloride dihydraat (0,02 w /v) gistextract (0,2 w /v ), laboratorium Lemco poeder (0,1 w /v), proteosepepton (0,5 w /v) in DDH 2O. Ureum werd verdund in PBS (40% w /v) en toegevoegd aan een eindconcentratie van 0,05% (v /v) in AS. Biofilms werden bereid in 24 putjes (Corning, NY, USA) die aangepast Thermanox ™ dekglaasjes (13 mm diameter, Fisher Scientific). Voor het toevoegen van elke bacteriële soort tot de biofilm een gestandaardiseerde bacteriesuspensie werd bereid in 500 ui AS. Aanvankelijk werden S. mitis
biofilms gekweekt gedurende 24 uur. Medium werd vervolgens verwijderd en gestandaardiseerde F. nucleatum
toegevoegd anaeroob werd gedurende een verdere 24 uur. Het supernatant werd weer verwijderd en gestandaardiseerde P. gingivalis
en A. actinomycetemcomitans
in AS toegevoegd aan de biofilm. Dit werd vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C in een anaerobe kamer gedurende nog 4 dagen; elke dag supernatanten werden vervangen door vers AS. Als CHD-FA actief bleek bij 0,5% v /v tegen alle bacteriële biofilms getest in deze studie was, werd deze concentratie gebruikt in aanvulling op 0,2% v /v CHX behandelen multispecies biofilms gedurende 30 minuten voordat voorzichtig gewassen met PBS en biofilm levensvatbaarheid bepaald met alamarBlue®. De absorptie werd afgelezen bij 570 nm en de referentie golflengte bij 600 nm. De procentuele verlaging in levensvatbaarheid biofilm werd berekend volgens de instructies van de fabrikant. Deze studie werd uitgevoerd bij drie verschillende gelegenheden in drievoud.
Na de antimicrobiële behandeling biofilms zijn bewaard en gebruikt om het aantal van elke bacteriële species gevonden na CHD-FA en CHX behandeling vergeleken met de onbehandelde controle kwantificeren. In het kort werden gesonificeerd biofilms in 1 ml PBS gedurende 10 minuten en het DNA geëxtraheerd met behulp van de MasterPure Gram positieve DNA Purificiation Kit (Epicentre®, Cambridge, UK), volgens instructies van de fabrikant. 1 pi van geëxtraheerde DNA werd een mastermix die 12,5 ul SYBR® groener ™, 9,5 ul UV-behandeld RNase-free water en 1 pi van 10 uM vooruit /achteruit primers voor elke bacteriesoorten toegevoegd. De gebruikte primers waren als volgt:
A. actinomycetemcomitans
F - 5'GAACCTTACCTACTCTTGACATCCGAA3 ', A. actinomycetemcomitans
R - 5'TGCAGCACCTGTCTCAAAGC3', F. nucleatum
F - 5'GGATTTATTGGGCGTAAAGC3 ', F . nucleatum
R - 5'GGCATTCCTACAAATATCTACGAA3 ', P. gingivalis
F - 5'GCGCTCAACGTTCAGCC3', P. gingivalis
R - 5'CACGAATTCGCCTGC3 ', S. mitis
F - 5'GATACATAGCCGACCTGAG3' , S. mitis
R -. 5'CCATTGCCGAAGATTCC3 '
Drie onafhankelijke replicaten van elke parameter werden geanalyseerd in drievoud met behulp MxProP kwantitatieve PCR machine en MxProP 3000 software (Stratagene, Amsterdam, Nederland). De monsters werden gekwantificeerd op basis van een vooraf vastgestelde norm curve samengesteld uit bekende bacteriële tellingen.
Ultrastructurele veranderingen van bacteriële biofilms
Scanning elektronenmicroscopie (SEM) werd uitgevoerd op S. mutans
, E. faecalis
en de multispecies biofilms. Cellen werden gestandaardiseerd in geschikte media, zoals hierboven beschreven, en direct gekweekt op Thermanox ™ dekglaasjes (Nunc, Roskilde, Denemarken) tot biofilmvorming toelaten. Na rijping biofilms werden zorgvuldig gewassen met PBS voordat hun behandeling. Biofilms werden vervolgens voorzichtig tweemaal met PBS gewassen en vervolgens in 2% paraformaldehyde, 2% gluteraldehyde en 0,15 M natriumcacodylaat vaste en 0,15% w /v Alcian Blue, pH 7,4, en bewerkt voor SEM zoals eerder beschreven [23]. De monsters werden sputter-bekleed met goud en bekeken onder een JEOL JSM-6400 scanning elektronenmicroscoop. Beelden werden geassembleerd met behulp van Photoshop-software (Adobe, San Jose, CA, USA).
Toxiciteit van CHD-FA na een orale epitheliale cellijn
OKF6 /TERT2 cellen (geschonken door de Rheinwald laboratorium, Brigham en Ziekenhuis van de vrouw, Boston, USA), een geïmmortaliseerde humane orale keratinocyten cellijn, werden gebruikt om de cytotoxiciteit van CHD-FA. Cellen werden gekweekt tot 90% confluentie in keratinocyt serum-vrij medium (KSFM) bij 37 ° C in 5% CO 2 en geënt bij een dichtheid van 1 x 10 5 cellen /ml in een 24 wells plaat. Zodra de cellen confluentie bereikten 80-90% werden de cellen voorzichtig gewassen met PBS voorafgaand aan behandeling met 0,5% (v /v) CHD-FA in de natieve pH 2,0 en een neutrale pH van 7,0 en 0,2% (v /v) CHX gedurende 30 min. Na 30 minuten werden de verbindingen verwijderd en de cellen voorzichtig gewassen met PBS om resterende actieve verwijderen. Cellen werden geïncubeerd in KSFM voor 4 en 24 uur voor cellulaire levensvatbaarheid werd vastgesteld met behulp van alamarBlue® assay, zoals hierboven beschreven. Levensvatbaarheid studies werden uitgevoerd in drievoud bij drie verschillende gelegenheden uitgevoerd.
Beoordelen van immunomodulerende eigenschappen van de CHD-FA
OKF6 /TERT2 cellen werden gekweekt tot 90% samenvloeiing in 24 well platen in toegezegde KSFM vervolgens voorbehandeld met 0,5 % CHD-FA (pH 7,0) gedurende 30 min. CHD-FA bij pH 2,0 was toxisch voor de cellijn die in deze studie en daarom kon niet toe om eventuele immuunmodulerende eigenschappen van deze verbinding te analyseren. Daarom CHD-FA gebufferd tot pH 7,0 werd gebruikt voor verdere biologische eigenschappen van de verbinding te beoordelen. 0,5% CHD-FA bij pH 2,0 en 0,2% CHX bleken toxisch epitheelcellen, dus werden niet verder onderzocht. Cellen werden gewassen met PBS om resten CHD-FA verwijderen. Als inflammatoire agonist we multispecies parodontale biofilm, zoals boven beschreven, dat aan de onderkant van het hangen celkweek insert (Millipore, Massachusetts, USA) gebruikt Vaseline, vervolgens gelegd naast de cel monolaag. De cellen werden geïncubeerd met de periodontale biofilm gedurende 4 en 24 uur bij 37 ° C in 5% CO 2. Cellen niet voorbehandeld met CHD-FA, indien uitgedaagd met biofilms, diende als passende controles. Na stimulatie, supernatanten en cellysaten werden behouden om de regulering van een panel van pro-inflammatoire mediatoren te beoordelen.
Initial genexpressie analyse werd uitgevoerd met behulp van een speciaal ontworpen RT 2 Profiler PCR Array (Qiagen, Crawley, UK ). RT 2 Profiler arrays zijn een SYBR® groener ™ op basis van real-time PCR die het mogelijk maken voor de detectie van meerdere genen van belang, tegelijk. Kort, 24 ui van een mastermix met SYBR ™ Greener, cDNA gesynthetiseerd met behulp van de RT 2 First Strand kit (Qiagen) en RNase-vrij water werd toegevoegd aan elk putje van de RT 2 Profiler plaat, die reeds bevatte de voorwaartse en achterwaartse primers voor genen (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF, CB 2., CSF3, IL-8, CXCL1, CXCL3, CXCL5, CCL1 en GAPDH). Twee herhalingen van elke conditie werden gebruikt in de RT 2 Profiler, die op twee verschillende gelegenheden werd uitgevoerd.
IL-8-genexpressie werd geanalyseerd met behulp van SYBR® Green gebaseerde qPCR (Invitrogen) met behulp GAPDH als een housekeeping gen. De gebruikte primers waren als volgt: IL-8 F 5'CAGAGACAGCAGAGCACACAA3, IL-8 R 5'TTAGCACTCCTTGGCAAAAC3 ', GAPDH F 5'CAAGGCTGAGAACGGGAAG3', GAPDH R 5'GGTGGTGAAGACGCCAGT3. In het kort werd RNA geëxtraheerd uit cellysaten (Qiagen, Crawley, UK) en 55 ng /ul cDNA gesynthetiseerd met behulp van de RT 2 First Strand cDNA synthese kit (Qiagen, Crawley, UK), volgens instructies van de fabrikant. 1 pl gesynthetiseerde cDNA werd toegevoegd aan een mastermix met 12,5 ui SYBR ™ Greener, 10,5 gl UV-behandelde RNase-vrij water en 0,5 pl voorwaartse /achterwaartse primers. Drie onafhankelijke herhalingen van elke parameter in duplo geanalyseerd middels MxProP kwantitatieve PCR machine en MxProP 3000 software (Stratagene, Amsterdam, Nederland) en genexpressie in dat van de housekeeping gen GAPDH volgens de 2 -ΔΔCT
methode [24 ].
interleukine 8 (IL-8) introductie in celcultuur supernatanten werd bepaald door ELISA (Invitrogen, Paisley, UK), volgens instructies van de fabrikant. Resultaten werden berekend onder toepassing van een 4-parameter fit curve, kwantificeren colometrische veranderingen bij 630 nm (BMG-Labtech, Ortenberg, Duitsland).
Statistische analyse
Grafiek productie, distributie en de statistische analyses werden uitgevoerd onder toepassing van GraphPad Prism (version 4, La Jolla, CA, USA). Na de voorwaarden gegevens gelijkvormig een normale verdeling van voor en na de data transformaties werden Enkele factoren variantieanalyse (ANOVA) en t-toetsen gebruikt om significante verschillen tussen onafhankelijke groepen gegevens die benadert een Gauss-verdeling te onderzoeken. Een Bonferroni-correctie werd aangebracht op de p-waarde rekenschap voor meerdere vergelijkingen van de gegevens. Niet-parametrische gegevens werden geanalyseerd met de Mann-Whitney U-test
de verschillen tussen twee onafhankelijke monstergroepen beoordelen. Student t-tests werden gebruikt om statistische verschillen tussen de Δ
Ct-waarden van de twee onafhankelijke groepen geëvalueerd genexpressiestudies meten, maar gegevens kunnen worden weergegeven als percentage of voudige verandering in de figuren. Statistische significantie werd bereikt als P & lt; 0.05
.
Resultaten
CHD-FA heeft een snelle en breed-spectrum antibacteriële activiteit
Corsodyl® (0,2% CHX) en Dentracine (0,8% CHD-FA) zijn orale formuleringen die de werkzame bestanddelen CHX en CHD-FA, respectievelijk. Beide middelen werden zeer actief tegen alle planktonische en sessiele orale bacteriën getest worden (gegevens niet getoond). De studies in dit manuscript gericht op de actieve bestanddelen CHX en CHD-FA en beide bleken zeer efficiënt bij het remmen en het doden van alle geteste isolaten orale wanneer geteeld planktonically en biofilms (tabel 1) zijn. PMICs voor de orale isolaten varieerde van 0,0625% tot 0,25% voor de CHD-FA en naar & lt; 0,00039% tot 0,00078% voor CHX. De PMBC /PMIC ratio voor CHD-FA en CHX waren ≤4, met vermelding van beide verbindingen weergegeven bacteriedodende werking. Geen van de geteste bacteriële species waren opvallend gevoeliger of bestand tegen een van de verbindingen. Beide CHD-FA en CHX vertoonde activiteit tegen volwassen biofilms, met SMICs van 0,5% voor de CHD-FA en van 0,003% tot 0,025% voor CHX. Interessant, hoewel CHX was effectief bij lagere concentraties, de vouw verandering van PMIC naar SMIC varieerde van slechts 2-8 voor CHD-FA, terwijl voor CHX dit varieerde van 2 tot 64. Kortom, P. gingivalis
was de meest gevoelige organisme met het antimicrobiële therapieën getest, met name voor planktonische cellen. Bovendien zijn alle bacteriële biofilms waren even gevoelig voor CHD-FA met een SMIC van 0,5% .table 1 Gevoeligheid profiel van klinisch relevante bacteriën in de mond tot vier antimicrobiële middelen
MIC (%)
CHD-FA
CHX
Organism
PMIC
MBC
SMIC
Fold veranderen
PMIC
MBC
SMIC
Vouw verandering
(SMIC /PMIC)
(SMIC /PMIC)
A. een *
0.25
0.25
0.5
2
0.00078
0.00313
0.025
32
S. mitis
0.0625
0.125
0.5
8
0.00078
0.00156
0.0125
16
S. mutans
0.25
0.25
0.5
2
0.00039
0.00078
0.025
64
E. faecalis
0.125
0.25
0.5
4
0.00156
0.025
0.003
2
F. nucleatum
0.125
0.5
0.5
4
0.00039
0.00078
0.195
32
P. gingivalis
0.0625
0.5
0.5
8
≤0.00039
0.00078
0.0625
≥16
*EEN. . Actinomycetemcomitans
CHD-FA - (Fulhold Ltd, Zuid-Afrika), CHX -. (GlaxoSmithKline Consumer Health Care, UK)
Nadere analyse van de impact van de CHD-FA op het fysieke cellulaire structuur werd beoordeeld door SEM voor representatieve biofilms. CHD-FA reduceerde de totale hoeveelheid van S. mutans
ECM (Figuur 1B) en veroorzaakte verstoring van de celmembraan, zoals blijkt uit de lekke verschijnen van E. faecalis
(figuur 1D). Figuur 1 CHD-FA vermindert de ECM en compromissen celmembraan structuur. S. mutans
(x2000) en E. faecalis
(X5000) biofilms waren ofwel onbehandeld (A en C, respectievelijk) of behandeld met 0,5% (v /v) CHD-FA (B en D respectievelijk) gedurende 24 uur op Thermanox ™ dekglaasjes. Deze werden vervolgens verwerkt en bekeken op een JEOL JSM-6400 scanning elektronenmicroscoop en afbeeldingen geassembleerd met behulp van Photoshop-software. Let op de reductie van extracellulaire matrix (B) en verstoring van de bacteriële celmembranen (D), aangegeven met pijlen op sessiele cellen.
CHD-FA is effectief tegen multispeciesbasis parodontale biofilm
Aangezien biofilms van de orale holte zijn polymicrobiële in de natuur, ontwikkelden we een eenvoudige en reproduceerbare multi-species model vertegenwoordiger van subgingivale plaque om CHD-FA (Figuur 2A) te testen. De antimicrobiële activiteit van CHD-FA bij 1 x SMIC bleek aanzienlijke vermindering cellevensvatbaarheid tot minder dan 10% (p & lt; 0,0001), die vergelijkbaar zijn met de CHX, die ook cellevensvatbaarheid aanzienlijk verminderd tot 8% (p & lt was; 0,0001). Echter, na de behandeling het aantal van elke soort in de biofilms waren gekwantificeerd en toonde geen significante vermindering van biomassa na CHD-FA of behandeling CHX, vergeleken met de onbehandelde controle (Figuur 2B). Figuur 2 CHD-FA doodt en verstoort meerdere soorten parodontale biofilms. Multispecifieke parodontale biofilms werden gekweekt op Thermanox ™ dekglaasjes in 24 well platen voor een totaal van 5 dagen, met as media elke dag verschoond. Bij biofilm ontwikkeling werden de cellen behandeld met 0,5% (v /v) CHD-FA en 0,2% (v /v) CHX gedurende 24 uur alvorens te worden gewassen met PBS. Reductie in metabole activiteit werd gemeten met de alamarBlue® assay (A). Alle monsters werden geanalyseerd in drievoud, driemaal. Gegevens vertegenwoordigt gemiddelde ± SD (*** p & lt; 0,0001). Biofilms werden behouden na behandeling met CHD-FA of CHX en DNA voor kwantificatie van elke soort gebruik SYBR® groener ™ gebaseerde qPCR (B) werd geëxtraheerd. Biofilms werden ook geanalyseerd met SEM op ofwel 2000x (C, E, G) en 5000x (D, F, H). Deze werden verwerkt en bekeken op een JEOL JSM-6400 scanning elektronenmicroscoop en afbeeldingen geassembleerd met behulp van Photoshop-software. Onbehandelde multispecies biofilms werden eerst vergeleken bij een lage vergroting (C) om biofilms behandeld met 0,2% (v /v) CHX (E) en 0,5% (v /v) CHD-FA (G) gedurende 24 uur en er werd aangetoond dat biofilm behandelingen veroorzaakt disaggregatie. Bij een grotere vergroting van de biofilms behandeld met 0,5% (v /v) CHD-FA gedurende 24 uur resulteerde in een vezelig ECM, zoals aangegeven met pijlen (H), vergeleken met de controle (D) en CHX (F).
SEM analyse van deze biofilms werd dan uitgevoerd om enig effect op de biofilm architectuur (figuur 2C-H) evalueren. Bij lage vergroting (x2000) zowel CHX en CHD-FA bleken biofilm architectuur (Figuur 2E en G) verstoren in vergelijking met de onbehandelde controle (figuur 2C), zoals getoond door delen van schaarse uitgesplitste biofilms. Bovendien bij een sterke vergroting (X5000) CHD-FA bleek ook het algehele uiterlijk van de biofilm matrix met grotere hoeveelheden vezelachtige ECM waargenomen zoals aangegeven met de pijlen (figuur 2H) veranderen, vergeleken met de controle en CHX (figuur 2D en F).
CHD-FA verandert de expressie van pro-inflammatoire mediatoren
CHD-FA toxiciteit werd beoordeeld met behulp van een oraal relevant epitheliale cellijn om te bepalen of er schadelijke effecten van het getest voorafgaand aan immunomodulerende verbindingen onderzoeken. Zowel CHX en CHD-FA, met zijn oorspronkelijke pH van 2,0, werden zeer giftig jegens epitheelcellen, waardoor de levensvatbaarheid tot minder dan 10% na 30 min blootstelling (figuur 3) zijn. Wanneer echter CHD-FA werd gebufferd tot een neutrale pH van 7,0, geen significante afname in cellevensvatbaarheid waargenomen. Figuur 3 CHD-FA niet-toxisch voor een orale epitheel cellijn. Een oraal relevante epitheliale cellijn (OKF6 /TERT2) werd gegroeid tot 90% samenvloeiing in 24 well platen voor toxicologisch onderzoek. Cellen werden behandeld met 0,5% (v /v) CHD-FA bij pH 2,0 en 7,0 en met 0,2% CHX gedurende 30 min. Na behandeling werden de cellen voorzichtig gewassen met PBS en cellulaire levensvatbaarheid vastgesteld met behulp alamarBlue® assay met absorptie afgelezen bij 570 en 600 nm. Alle monsters werden geanalyseerd in drievoud op drie onafhankelijke gevallen. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SD (*** p & lt; 0,0001).
We vermeld naast bepalen of CHD-FA kon een biologische reactie van de epitheelcellen induceert, voornamelijk door het meten van veranderingen in immuunmediatoren. Deze werden in een vier-species biofilm model ontwikkeld, waarbij geen toxiciteit problemen waargenomen bij contact met de epitheliale cellijn 4 uur (gegevens niet getoond). Bovendien hebben we aangetoond dat CHD-FA behandelde cellen de afgifte van IL-8 niet significant veranderen na 4 uur en 24 uur (gegevens niet getoond). Initial gene expression studies op de RT 2 Profiler op epitheelcellen voorbehandeld met CHD-FA vóór biofilm challenge vertoonden een algemeen neerwaartse regulatie van pro-inflammatoire mediatoren (Figuur 4A). Significante neerwaarts gereguleerde genen inclusief IL-6 (8,5 voudige [p = 0,018]), IL-1β (7,05 voudige [p = 0,012]), TNFa (5,22 voudige [p = 0,013]) en IL-8 (4,24 voudige [ ,,,0],p = 0,021]). Figuur 4 CHD-FA moduleert key ontstekingsmediatoren in vitro. Oraal epitheel cellijn (OKF6) werd gekweekt tot 90% confluentie in platen met 24 putjes voor het effect van CHD-FA op de immuunrespons van de gastheer. De cellen werden voorbehandeld met 0,5% (v /v) CHD-FA pH 7,0 gedurende 30 minuten, gewassen met PBS en gestimuleerd met de multispecifieke periodontal biofilm gedurende 4 en 24 uur. Onbehandelde controles werden ook opgenomen. Monsters werden geanalyseerd in drievoud en driemaal. RNA werd geëxtraheerd uit de 4 h cellysaten, cDNA gesynthetiseerd en gebruikt in de RT2 Profiler om de expressie van een panel van pro-inflammatoire mediatoren (A) te analyseren. Duplicaatmonsters van twee onafhankelijke experimenten werden in de RT2 Profiler. Gegevens worden weergegeven door gemiddelde + 95% BI, ten opzichte van onbehandelde controle. De monsters werden ook geanalyseerd op IL-8 genexpressie middels SYBR ™ Greener gebaseerd qPCR (B). Expressie van IL-8 wordt vertegenwoordigd ten opzichte van het huishouden gen; GAPDH. Behield supernatanten werden gebruikt om IL-8-eiwit afgifte gemeten met ELISA (C). Alle monsters werden geanalyseerd in drievoud op drie onafhankelijke gevallen. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SD (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01)
wij vervolgens gericht op IL-8 expressie, een van de belangrijke genen betrokken en een belangrijke mediator van parodontitis.. Op mRNA niveau, IL-8 was significant omlaag gereguleerd in cellen voorbehandeld met CHD-FA na 4 uur, vergeleken met de onbehandelde controle (p = 0,0383) (Figuur 4B). Geen statistisch significant verschil werd waargenomen na 24 uur stimulatie (p = 0,1712). Bovendien op eiwitniveau, werd IL-8 afgifte aangetoond significant neerwaarts gereguleerd wanneer cellen werden voorbehandeld met CHD-FA, na 4 uur (p = 0,008) en 24 uur (p = 0,0037) biofilm stimulatie ( figuur 4C). .
CHD-FA alleen had geen effect op de orale epitheelcel IL-8 mRNA of eiwitexpressie (gegevens niet getoond) Bespreking
orale microbiële ziekten worden gewoonlijk gemedieerd door biofilms; gemeenschappen van microorganismen die samen aggregeren als kleverig en vasthoudend structuren en die gekenmerkt zijn toegenomen antibioticaresistentie [25]. We meldden onlangs dat mondspoelingen, waaronder CHX niet effectief tegen een reeks van klinische MRSA-stammen [10], wat suggereert dat andere antimicrobiële middelen moet worden onderzocht. Inderdaad, recente studies in C. albicans
gebleken dat het gebruik van natuurlijk afgeleide moleculen zijn effectief tegen zowel oraal en systemisch verkregen isolaten [14, 15]. Hier melden wij dat CHD-FA, een natuurlijk verkregen antiseptische molecule, toont snelle breed-spectrum antimicrobiële activiteit, en lokt ook immunomodulerende activiteit.
We hebben eerst over tot een vergelijkende beoordeling van de CHD-FA en CHX tegen een reeks van belangrijke bacteriën in verband met orale biofilm infecties.
