Abstracte achtergrond
mucosale oppervlakken zijn bekleed met lagen van slijm gel die de onderliggende weefsels te beschermen en te bevorderen kolonisatie door leden van de commensale microflora. Lactobacillus fermentum
een gemeenschappelijke bewoner van de mondholte, maag- en voortplantingsstelsel en is een van de belangrijkste melkzuurbacteriën bijdragen tot de vorming van een gezonde intestinale microflora. We hebben de proteolytische activiteit onderzocht in L. fermentum
als reactie op interactie met de MUC5B mucine, wat een belangrijke component van slijm gels op plaatsen gekoloniseerd door dit micro-organisme.
Werkwijzen
biofilm van Lactobacillus fermentum
zijn opgericht in mini-flow cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van humaan speeksel MUC5B. De proteolytische activiteit van biofilm cellen in een confocale laser scanning microscoop met een fluorescent protease substraat onderzocht. Afbraak van MUC5B van L. fermentum
werd geanalyseerd met SDS-PAGE gevolgd door Western blotting met antisera opgewekt tegen het peptide MUC5B. Celoppervlakeiwitten differentialy expressie gebracht in een MUC5B-rijke omgeving werden geïdentificeerd met behulp van vergelijkende tweedimensionale elektroforese gevolgd door LC-MS /MS.
Resultaten
Lactobacillus fermentum
hechtte goed aan oppervlakken bekleed met MUC5B mucine en biofilms van L. fermentum
gevormd in een MUC5B omgeving, het aandeel van proteolytisch-actieve cellen (47 ± 0,6% van de bevolking), zoals door splitsing van een fluorescent caseïne substraat, significant groter (p & lt; 0,01 ) dan die in biofilms gevormd in voedingsbouillon (0,4 ± 0,04% van de bevolking). Aldus vormt de aanwezigheid van mucinen MUC5B verhoogde bacteriële proteaseactiviteit. Dit effect was vooral toe te schrijven aan contact op te nemen met het oppervlak geassocieerde mucinen in plaats van die aanwezig is in de vloeibare fase. Biofilms van L. fermentum
kunnen afbreken MUC5B mucinen suggereert dat dit complex glycoproteïne kan worden benut als een bron van voedingsstoffen door de bacteriën waren.
Vergelijking van het oppervlak proteomen van biofilm cellen van L. fermentum
in een MUC5B omgeving met die in voedingsbouillon met twee-dimensionale elektroforese en massaspectroscopie toonde aan dat de verhoogde proteolytische activiteit werd geassocieerd met verhoogde expressie van een glycoprotease; O-
sialoglycoproteïne endopeptidase, alsmede chaperone eiwitten zoals DnaK en uitlokkende factor.
Conclusies
Hechting aan mucine-gecoate oppervlakken leidt tot een verschuiving naar een protease-actieve fenotype in L. fermentum
biofilms en proteasen geproduceerd binnen de biofilms kan MUC5B mucinen degraderen. De verhoogde proteolytische activiteit werd geassocieerd met een toename van O-
sialoglycoproteïne endopeptidase op het celoppervlak. Wij stellen de opregulatie van chaperone eiwitten in het mucine omgeving kan bijdragen tot de protease-actieve fenotype door stimulatie van glycopeptidase. Dit zou een manier te vertegenwoordigen voor commensal lactobacillen bijv. L. fermentum
om complexe substraten in hun lokale omgeving te benutten om te overleven op mucosale oppervlakken
Sleutelwoorden
Lactobacilli Proteolytische activiteit Proteolyse Slijm glycoproteïne Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi.: 10. 1186 /1472-6831-13-43) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is. achtergrond
mucosale oppervlakken van het lichaam worden gekoloniseerd door een groot aantal commensal bacteriesoorten die naast elkaar bestaan in een mutualistische relatie met hun menselijke gastheer. Deze microbiële gemeenschappen of biofilms, worden verondersteld om de eerste lijn van verdediging tegen infectie vormen door een competitieve remming van niet-inheemse organismen die ziekte kan veroorzaken. In de darm, is de commensale flora voorgesteld om een belangrijke invloed op de ontwikkeling, immuniteit en voeding hebben (zie voor [1-3]). Ondanks het belang verrassend weinig bekend over hoe de leden van deze gemeenschappen overleven in de mucosale milieu en met elkaar, en de gastheer, een dynamische ecosysteem vormen. Lactobacillus
vertegenwoordigt de meest talrijke en diverse groep onder melkzuurbacteriën die mucosale oppervlakken wonen in mensen, waaronder het maagdarmkanaal [4], vrouwelijke voortplantingssysteem [5] en de mondholte [6]. Lactobacilli zijn over het algemeen gezien als het verlenen van gunstige biologische effecten voor de gastheer. Bijvoorbeeld in het maagdarmkanaal, lactobacilli bevorderen immuunstimulatie en versterking van mucosale afweer [7]. Onder de lactobacilli, Lactobacillus fermentum
een gemeenschappelijke bewoner van het maagdarmkanaal [8], met inbegrip van de mondholte [9, 10]. In tegenstelling tot de positieve rol in de darm, worden Lactobacilli in de mondholte vaak geassocieerd met carieuze ziekten [6] en Lactobacillus fermentum
vaak geïsoleerd uit dentine cariës bij kinderen, wat een rol in de cariësproces [11] .
mucosale oppervlakken worden beschermd door een slijmlaag gel afgeleid van mucine producerende cellen in de onderliggende epitheel. Slijm gels bestaan uit grote, polymere gelvormende glycoproteïnen die tot mucine eiwitfamilie en mucine soort waartoe deze gelen op verschillende mucosale oppervlakken kunnen variëren. Bijvoorbeeld, MUC5B is een overheersende mucine in de mondholte, vrouwelijke voortplantingssysteem en luchtwegen [12], terwijl MUC5AC, MUC6 en MUC2 zijn te vinden op verschillende locaties in het maagdarmkanaal [13]. De grote polymere mucinen zijn samengesteld uit subeenheden verbonden door disulfidebindingen, en binnen elke subeenheid stukken naakte eiwitskelet afgewisseld met zeer geglycosyleerde gebieden met grote aantallen oligosaccharide zijketens [14]. Lactobacilli binden aan zowel maag- en mucinen [15] en een mucine bindingsproteïne (32-Mmubp), dat een component van het ABC-transporter systeem, geïdentificeerd in L. fermentum
[16]. Interacties met mucinen waarschijnlijk toe lactobacilli in de slijmlaag waar ze bijdragen aan de vorming van multi-species biofilms te behouden.
Moment de mechanismen reguleren overleving en groei van lactobacilli aan mucosale oppervlakken grotendeels onopgelost. Aangezien melkzuurbacteriën kunnen alleen nemen korte peptiden via transportsystemen, die specifiek zijn voor Oligopeptiden (Opp) en di-tripeptiden (DTPT) [17], groei en overleving van biofilms in mucus omgevingen zal waarschijnlijk afhangen het vermogen van de bacteriën om complexe substraten afgebroken zoals mucinen. Het vermogen van bacteriën om mucinen gebruiken als enige voedingsbron is aangetoond voor Akkermansia muciniphilia
dat werd geïsoleerd uit een fecale monster van een gezonde volwassene [18]. Bioinformatica studies blijkt dat het genoom van L. fermentum stam 28-3
-CHN codeert voor ten minste 10 proteases. Hiervan zijn verschillende voorspeld extracellulair zijn en derhalve het potentieel een rol bij het genereren van voedingsstoffen spelen van mucinen op mucosale oppervlakken. In deze studie wordt nagegaan hoe proteolytische activiteit in biofilms van L. fermentum
is gerelateerd aan de omgeving van de bacteriën; een mucine-rijke omgeving of eiwitrijke voedingsbouillon medium, en of grote gelvormende mucinen kunnen worden afgebroken door L. fermentum
als potentiële bron van nutriënten. Bovendien, veranderingen in celoppervlak eiwitexpressie geassocieerd met versterking van proteolytische activiteit werden onderzocht.
Methods
Bacteriestam
Om de natuurlijk voorkomende interacties tussen MUC5B en Lactobacillus fermentum onderzoeken
klinische stam is in staat om te overleven en te groeien in een mucus-rijke omgeving werd geïsoleerd van tandaanslag. De stam, die afkomstig is van approximaal supra-tandvlees plaque van een gezonde 30-jarige man, werd
geïdentificeerd door selectieve groei in Rogosa medium en fermentatie testen met behulp van de API-50 CHL systeem (BioMerieux, Marcy l'Etoile, Frankrijk ). Identificatie als L. fermentum
werd bevestigd door sequentiebepaling van het PHES
gen [19]. Bacteriën werden bewaard bij -80 ° Cen-sub tweemaal gekweekt op agar in een atmosfeer van 5% CO
2 in lucht bij 37 ° C gedurende 48 uur voor gebruik.
Isolatie van menselijk speeksel MUC5B
menselijke speeksel mucine MUC5B werd geïsoleerd zoals eerder beschreven [20]. Speeksel werd verzameld op ijs van acht vrijwilligers verzameld en vervolgens gemengd met een gelijk volume van 0,2 M NaCl en gedurende de nacht geroerd bij 4 ° C. Na voorzichtig centrifugeren (4400 g gedurende 30 minuten bij 4 ° C), werd de bovenstaande vloeistof onderworpen aan isopycnische dichtheidsgradiënt centrifugatie in CsCI /0,1 M NaCl (Beckman Optima LE-80 K, rotor 50.2Ti, 36.000 rpm, 96 h, 15 ° C, start dichtheid 1,45 g /ml, Beckman, Fullerton, CA, USA) en 22 fracties werden opgevangen. De MUC5B-bevattende fracties werden samengevoegd, gedialyseerd tegen PBS (0,15 M NaCl, 5 mM NaH 2PO 4, pH 7) en bewaard bij -20 ° C tot gebruik. Om de concentratie van MUC5B bepalen werden porties van de MUC5B-bevattende fracties werden samengevoegd, gedialyseerd tegen water, gevriesdroogd en gewogen (0,3 mg ml -1). De pool van MUC5B werd onderworpen aan natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE), te onderzoeken of laag molecuulgewicht eiwitten geassocieerd met het gelnetwerk verontreinigde het preparaat.
Biofilmvorming
L. fermentum
kolonies van agar werden gesuspendeerd in nutriënt bouillon [Todd-Hewitt-bouillon (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)] of in een MUC5B oplossing in PBS te geven OD 600 waarden van 0,4 ± 0,01 (wat overeenkomt tot ongeveer 1 × 10 6 cellen ml -1). Biofilms werden mini-stroomcel ibidi μ-slides (Integrated Bio Diagnostics, Martinsried, Duitsland) door het enten 120 pi van de suspensie in de kanalen en het incuberen in bevochtigde 5% CO 2 in lucht bij 37 ° C gedurende 24 uur. De kanalen werden vervolgens gespoeld met PBS om niet-hechtende cellen te verwijderen. In sommige gevallen, de objectglaasjes werden vooraf geconditioneerd met 100 pi MUC5B + 10 ui 10 mM CaCh 2 overnacht in bevochtigde 5% CO 2 in lucht bij 37 ° C een MUC5B laag te verkrijgen. De objectglaasjes werden gewassen met PBS voorafgaand aan biofilmvorming. biofilmvorming werd bevestigd door kleuring met de BacLight ™ Live /DEAD kit (Molecular Probes Inc., OR, USA) en visualisatie met behulp van een Nikon Eclipse TE2000 omgekeerde confocale laser scanning microscoop (CSLM).
proteolytische activiteit Belgique Om te onderzoeken de proteolytische activiteit van planktonische cellen werden L. fermentum
cellen onderzocht met fluorescentie protease testkit QuantiCleave ™ (Pierce, Rockford, IL, USA) zoals eerder beschreven [21]. In het kort werden cellen geïncubeerd gedurende 1 uur bij 37 ° C met FITC gemerkte caseïne substraat bij een concentratie van 10 pg ml -1 in 25 mM Tris met 150 mM NaCl en ingesteld op pH 7,2. Hoeveelheden werden daarna in mini-flow-cell ibidi μ-objectglaasjes en tegengekleurd met de fluorescerende DNA-kleuring kleurstof SYTO62® (Molecular Probes Inc., OR, USA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voor biofilm cellen werden de fluorescerende substraat en tegenkleuring direct in de mini-flow cellen waarin de biofilms groeiden. Cellen werden vervolgens zichtbaar gemaakt CSLM en 20 willekeurige beelden van elke biofilm dia werden opgenomen met een gemotoriseerde station aangesloten op de Nikon software van de microscoop. Elk beeld bevatte meer dan 1000 bacteriële cellen en het percentage rode en groene cellen per slide biofilm, overeenkomend met ongeveer 20.000 cellen werd geanalyseerd met behulp van het softwarepakket bio
image_l [22]. Experimenten werden driemaal herhaald en het gemiddelde percentage voor proteolytisch actieve cellen werd berekend. De resultaten werden daarna verder geanalyseerd met de Mann-Whitney U Electronics Test en p-waarden van minder dan 5% werd als significant beschouwd.
Analyse van afbraak van MUC5B door L. fermentum
biofilms
Mini flow- kamers werden vooraf geconditioneerd met MUC5B en L. fermentum
cellen vervolgens geënt in nutriënt bouillon. Na 24 uur werd het medium verwijderd en MUC5B mucinen gesuspendeerd in PBS toegevoegd aan de biofilm gedurende nog 24 uur. Hierna werd de vloeistof in de stroming-cel verzameld met een pipet en gecentrifugeerd om bacteriële cellen te verwijderen (10.000 g, 5 min, 4 ° C). Het mucine supernatant, en een controle (MUC5B mucinen gedurende 24 uur bij 37 ° C maar niet blootgesteld aan L. fermentum
) werd geanalyseerd met SDS-PAGE onder denaturerende omstandigheden gevolgd door Western blotting. Monsters (15 pl van het supernatant) werden gemengd met 5 pl NuPAGE LDS monsterbuffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en uitgevoerd op NuPAGE 4-12% BisTris gels (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) bij 180 V gedurende 1 uur. De gelen werden elektrisch geblot op PVDF-membranen (Millipore, Immobilon-P, 0,45 mm, Bedford, MA, USA) gedurende de nacht met behulp van een Mini Trans-Blot elektroforetische transfercel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) en de membranen vervolgens geblokkeerd met 5% (w /v) melkpoeder in TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,05% Tween 20) gedurende 1 uur. MUC5B mucinen werden gedetecteerd met behulp van een antiserum (LUM5B-14), opgewekt tegen een synthetisch peptide met de sequentie CRAENYPEVSIDQVGQVL in de derde Cys domein van de MUC5B peptide, verdund 1: 1000 in 5% BSA /TBST. De membranen werden vervolgens geïncubeerd (1 uur) met een mierikswortel peroxidase-geconjugeerd geiten anti-konijn-antilichaam (Dako, P0448, Glostrup, Denemarken), verdund 1: 2500 in 5% afgeroomde melk /TBST en banden werden gevisualiseerd met het ECL Western detectie kit (Pierce, Rockford, IL, USA).
2DE, LC-MS /MS en Western blotting van celoppervlakeiwitten Ondernemingen De bulkfase omliggende biofilm cellen groeien in een MUC5B- of een voedingsstof broe- omgeving, was verwijderd met een pipet uit de stroom-cellen en vervangen door 50 pl extractiebuffer bestaande uit 5 M ureum, 2 M thioureum, 2% CHAPS, 2% caprylyl sulfobetaïne, 2 mM tributylfosfine, 0,5-2% IPG en 40 mM Tris base op pH 9,5. Om oppervlakteproteïnen solubiliseren van de resterende biofilm cellen, werden de stroomsnelheid cellen geïncubeerd onder schudden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en de extractiebuffer vervolgens verwijderd en gedurende 10 minuten (6000g
). De proteïneconcentraties in de resulterende supernatanten werden bepaald met een 2D Quant kit (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK). De supernatanten werden vervolgens verdund met rehydratatie buffer die 8 M ureum, 2% CHAPS, 10 mM DTT, 2% Immobiline (IPG) buffer (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK) tot een uiteindelijke eiwitconcentratie van 20 ug in 200 geven pl. Deze monsters werden opnieuw zwellen cassettes geplaatst bij 11 cm IPG strips, pH 4-7, geplaatst en rehydratie werd uitgevoerd onder olie bij kamertemperatuur gedurende 30 uur. Iso-elektrisch focusseren werd uitgevoerd in hoofdzaak zoals beschreven door Davies et al.
[23], met de Multiphor II (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK), 85, 500 volt uur. De stroken werden geëquilibreerd en vervolgens ingebed bovenop 14% polyacrylamidegelen. SDS-PAGE werd uitgevoerd bij een constante stroom van 15 mA /gel, 10 ° C, overnacht in een PROTEAN II xi cell (Bio-Rad, Hercules, CA) met hoog- frequente Rainbow moleculair gewicht standaarden (GE Healthcare Life wetenschappen, Little Chalfont, UK) aan de zure kant van het IPG strips. Gels werden met zilver gekleurd volgens de instructies van de fabrikant of colloïdale Coomassie Brilliant Blue G proteïne-identificatie. Gels werden geanalyseerd met Delta2D software (Decodon GmbH, Greifswald, Duitsland). Na identificatie van de contante grenzen zijn de geïntegreerde optische dichtheid (IOD) waarden bepaald en uitgedrukt als een percentage van de totale intensiteit per gel. Locaties toont meer dan drie-voudig verschil werden uit de Coomassie-gekleurde gelen, onderworpen aan in-gel tryptische digestie en geanalyseerd door LC-MS /MS zoals beschreven [23]. Voor detectie van O-
sialoglycoproteïne endopeptidase, 2DE gels werden elektro-geblot op PVDF-membranen (Millipore, Immobilon-P, 0,45 mm, Bedford, MA, USA) gedurende de nacht met behulp van een Mini Trans-Blot elektroforetische transfercel (Bio-Rad , Hercules, CA, USA) en de membranen vervolgens geblokkeerd met 5% (w /v) melkpoeder in TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,05% Tween 20) gedurende 1 uur. Het eiwit werd gedetecteerd met een polyklonaal antiserum MOB-LFGE-2 opgewekt tegen een synthetisch peptide met de sequentie (CDAAGEAYDKVGRV) (Innovagen AB, Lund, Zweden), verdund 1: 1000 in 5% BSA /TBST. De membranen werden vervolgens geïncubeerd (1 uur) met een mierikswortel peroxidase-geconjugeerd geiten anti-konijn antilichaam en banden werden gevisualiseerd met het ECL Western detectie zoals hierboven is beschreven.
Resultaten
Vergelijking van proteolytische activiteit in planktonische en biofilm cellen L. fermentum
om het effect van MUC5B op proteolytische activiteit in planktonische cellen van L. fermentum
onderzoeken, werden de cellen blootgesteld aan MUC5B in de vloeibare fase. Kweekbouillon werd gebruikt als controle. Het aandeel van proteolytisch-actieve cellen werd geëvalueerd met behulp CLSM na incubatie met FITC-caseïne. Dit toonde geen verschil tussen de hoeveelheid proteolytisch actieve cellen in voedingsmedium met die in MUC5B mucinen gesuspendeerd in PBS en in beide gevallen de activiteit in de populatie lager dan 4% (Figuur 1). Geen verschil in het niveau van activiteit van de celpopulatie gesuspendeerd in MUC5B mucinen in PBS en gesuspendeerd in PBS alleen (controle) werd waargenomen (gegevens niet getoond). De proteolytische activiteit van planktonische cellen met die van biofilm cellen van L. fermentum vergelijken, werden
bacteriën liet biofilms onder statische omstandigheden in een mini-stromingskamer voor 24 uur in een omgeving MUC5B (op oppervlakken bekleed met MUC5B vormen en MUC5B in de vloeibare fase) of een voedingsbodem omgeving. Het aandeel van proteolytisch-actieve cellen in biofilms in het MUC5B milieu tien maal hoger (47 ± 0,6%) dan hun planktonische tegenhangers (Figuur 1b) terwijl een dergelijke verhoging werd waargenomen bij biofilms gevormd in de aanwezigheid van voedingsmedium. Beeldvorming van de biofilms bleek dat L. fermentum
cellen gehecht aan zowel de onbeklede en de MUC5B beklede oppervlakken en biofilms gevormd (figuur 2). In het MUC5B milieu werden proteolytisch actieve cellen gelijkmatig verdeeld over de biofilm (figuur 2a), terwijl de activiteit in de voedingsbouillon milieu laag was (Figuur 2b). Deze gegevens aan dat proteolytische activiteit wordt versterkt in biofilm cellen van L. fermentum
van een mucine-rijke omgeving. Het effect wordt niet gezien als planktonische L. fermentum
cellen worden blootgesteld aan dezelfde mucinen in de vloeistoffase of in aanwezigheid van voedingsmedium. Figuur 1 Aandeel van proteolytisch-actieve Lactobacillus fermentum cellen in planktonische en biofilm cultuur. Grafieken die het percentage proteolytisch actieve cellen in populaties van (a) planktonische of (b) biofilm cellen van L. fermentum
in een MUC5B- of voedingsbodem milieu zoals geopenbaard onder toepassing van een fluorescent substraat gecombineerd met CSLM. De balken geven de gemiddelde waarde van drie onafhankelijke experimenten ± SE (** p & lt; 0,01).
Figuur 2 Proteolytische activiteiten van Lactobacillus fermentum biofilm populaties in aanwezigheid of afwezigheid van MUC5B mucinen. CSLM beelden die biofilm cellen groeien in (a) de aanwezigheid van een MUC5B omgeving of (b) een voedingsbodem omgeving. Proteolytische activiteit werd gevisualiseerd door incubatie met een FITC-geconjugeerde caseïne substraat (groen) gedurende 1 uur. De cellen werden vervolgens tegengekleurd met behulp Syto 24 (rood). De staaf geeft 20 pm en de inserts tonen viervoudige uitbreidingen van de belangrijkste microfoto.
Proteolytische activiteit biofilm cellen van L. fermentum
beïnvloed door oppervlakte-geassocieerde MUC5B Belgique Om te bepalen of de verhoging van proteolytische activiteit in de L. fermentum
biofilm bevolking in de MUC5B omgeving was vooral te danken aan de oppervlakte-geassocieerde mucinen of die in de bulk fase werden de effecten van deze afzonderlijk onderzocht. Biofilms van L. fermentum
dan die gevestigd werd op MUC5B beklede oppervlakken voedingsbouillon in de vloeibare fase of onbeklede oppervlakken MUC5B in de vloeibare fase. In aanwezigheid van oppervlakte-geassocieerde MUC5B, beeldanalyse bleek dat 13 ± 3% van de bevolking proteolytisch actief (figuur 3), terwijl in cellen blootgesteld aan MUC5B in de vloeibare fase alleen activiteit was zeer laag (0,3 ± 0,02%). Aldus tonen deze gegevens dat de aanwezigheid van mucinen op het oppervlak van belang voor de verhoging van proteolytische activiteit. De hoeveelheid actieve cellen op het oppervlak geassocieerde mucinen alleen was significant lager dan die in de MUC5B omgeving waar mucinen in de bulkfase waren ook. Dit suggereert dat de naleving van oppervlakte-geassocieerde MUC5B kunnen 'geprimede' de cellen zodat ze bij de aanwezigheid van MUC5B in de vloeibare fase. Figuur 3 Proteolytische activiteiten van Lactobacillus fermentum biofilm populaties in aanwezigheid van (a) oppervlakte-geassocieerde of (b) de vloeistoffase MUC5B mucinen. CSLM beelden die biofilm cellen groeien in (a) de aanwezigheid van een oppervlakte-laag van MUC5B mucinen of (b) in aanwezigheid van MUC5B mucinen in de vloeibare fase. Proteolytische activiteit werd gevisualiseerd door incubatie met een FITC-geconjugeerde caseïne substraat (groen) gedurende 1 uur. De cellen werden vervolgens tegengekleurd met behulp Syto 24 (rood). De bar staat voor 20 micrometer en de inzetstukken tonen viervoudige uitbreidingen van de belangrijkste microfoto.
Afbraak van MUC5B door L. fermentum
Om te bepalen of mucinen in de mucine-rijke omgeving worden afgebroken door de proteases geproduceerd binnen de L. fermentum
biofilms werden MUC5B mucinen die in contact waren geweest met biofilms gedurende 24 uur onderworpen aan SDS-PAGE gevolgd door Western blotting met een anti-MUC5B antiserum (figuur 4). Controle mucinen, die niet in contact waren geweest met bacteriën werden gevisualiseerd als een enkele band op de top van de gel tonen dat zij hoog molecuulgewicht (& gt; 300 kDa). Echter wanneer mucinen geïncubeerd waren met L. fermentum
biofilms, verscheen een extra band in het bovenste gebied van 4-12% gradiënt gel aangeeft dat een deel van de mucinen had enige verslechtering die toegestaan MUC5B migreren in de gel ondergaan. Dus deze gegevens bevestigen dat proteolytisch-actieve biofilm populaties van L. fermentum
kan MUC5B degraderen. Figuur 4 Afbraak van de MUC5B polypeptide keten door proteasen van biofilms van L. fermentum. Een controlemonster van MUC5B (a) en MUC5B die in contact waren geweest met biofilm cellen gedurende 24 uur (b) werden onderworpen aan SDS-PAGE op 4-12% gels. Na elektro-blotten op PVDF membranen werd MUC5B gedetecteerd met de LUM5B-14 antiserum. De bodem van de put wordt aangegeven.
Expressie van oppervlakte-eiwitten in L. fermentum
Aangezien MUC5B mucinen werden afgebroken door biofilm cellen van L. fermentum
, werd het genoom databank gescand proteasen kunnen vernederende glycoproteïnen. Met deze aanpak, een protease, O-
sialoglycoproteïne endopeptidase met een molecuulgewicht van ongeveer 35 kDa, werd geselecteerd als mogelijke kandidaat. Western blotting van 2DE gels van oppervlakte-eiwitten van L. fermentum
biofilm cellen met een polyklonaal antiserum opgewekt tegen een peptide in de sequentie van het geïdentificeerde glycopeptidase een vlek bij 32 kDa, overeenkomend met o
sialoglycoproteïne endopeptidase (zie figuur 5a). Om te onderzoeken of dit eiwit differentieel tot expressie werd gebracht op het oppervlak van L. fermentum
biofilm cellen in de verschillende omgevingen werden oppervlakteproteïnen van biofilm cellen in een MUC5B omgeving vergeleken met die van cellen in een nutriënt-bouillon-omgeving met behulp van 2D- gelelektroforese. Beeldanalyse zilver gekleurde gelen bleek dat expressie van de O-
sialoglycoproteïne endopeptidase werd versterkt 2,7 maal in aanwezigheid van MUC5B, vergeleken met voedingsmedium. Daarnaast is een aantal plaatsen in het traject 52-76 kDa vertoonden hogere niveaus van expressie in de MUC5B- dan in nutriënt-bouillon-omgeving (zie Figuur 6 en Tabel 1). Deze werden uit een overeenkomstig Coomassie-gekleurde gel (zie Figuur 5b) gesneden, onderworpen aan LC-MS /MS en de eiwitten vervolgens geïdentificeerd door vergelijking van de tryptische fragmenten met de Mascot database. Hieruit bleek vier eiwitten met een meer dan drievoudige up-regulatie in het MUC5B- vergeleken met de nutriënt-bouillon-omgevingen, overeenkomend met de chaperonne eiwitten; trekker factor (25-voudige toename), DnaK (9-voudige toename), Ef-G (6-voudige toename) en GroEL (3-voudige toename). Aldus tonen deze gegevens dat naast opregulatie van de glycoprotease, verhoogde proteolytische activiteit in de populatie wordt geassocieerd met een toename van de oppervlakte-expressie van de chaperone eiwitten DnaK, GroEL en uitlokkende factor. Figuur 5 Oppervlakte geïdentificeerde eiwitten in biofilm cellen van L. fermentum. (A) Western blotting van tweedimensionale elektroforese (2DE) van oppervlakte-eiwitten. Monsters werden onderworpen aan IEF een pH 4-7 gradiënt gevolgd door SDS-PAGE in 14% gels. Na elektroblotten op PVDF-membranen, GPR,
O-sialoglycoproteïne endopeptidase werd gedetecteerd met behulp van het polyklonale antiserum MOB-LFGE-2. (B) gel gekleurd met Coomassie Brilliant Blue na 2DE van oppervlakte-eiwitten. Spots werden uit de gel gekleurd, onderworpen aan in-gel tryptische digestie en eiwitten geïdentificeerd met LC-MS /MS analyse. De eiwitten geïdentificeerd waren: arg
, arginine deiminase; ATPase
, ATP synthase pyruvaat dehydrogenase; DnaK
; Ef-G
, rek factor G; Ef-Tu
, rek factor Tu; fum
, fumaraat hydratase; GroEL
; LDH
, lactaatdehydrogenase; Ket
, fosfoketolase; orn
, ornithinecarbamoyltransferase; PDH
, pyruvaat dehydrogenase en PPH
, phophopyruvate hydratase.
Figuur 6 twee-dimensionale gel-elektroforese van oppervlakte-eiwitten van Lactobacillus fermentum. Eiwitten geïsoleerd uit bacteriën in een MUC5B-omgeving (links) of een voedingsbodem omgeving (rechts) werden onderworpen aan IEF een pH 4-7 gradiënt gevolgd door SDS-PAGE in 14% gels. Gels werden zilver-gekleurd en beeldanalyse van verschillend tot expressie gebrachte eiwitten uitgevoerd met gebruikmaking Delta 2D software.
Tabel 1 Identificatie van de oppervlakte-eiwitten in L. fermentum biofilms verbeterd meer dan 2,0-voudig MUC5B vergeleken bij een voedingsbodem omgeving a
Eiwitten
IOD%
Vouw changeb
MUC5B
Nutrient bouillon
Trigger factor
3.53
0.14
25.2
DnaK
2.57
0.29
8.9
Elongation factor G
2.91
0.46
6.3
GroEL
5.66
1.84
3.1
O-sialoglycoprotein endopeptidase
3,31
1.24
2.7
pyruvaatdehydrogenase
3.04
1,22
2,5
adata bij analyse van de 2DE-zilver gekleurde gelen figuur 6.
bFold wijziging berekend als de procentuele waarde van de geïntegreerde optische dichtheid (IOD) van eiwitten in de MUC5B vs. de voedingsstof bouillon milieu.
Discussie
in hun natuurlijke omgeving in de mondholte, maag-darmkanaal en de vrouwelijke voortplantingsorganen stukken, Lactobacilli zijn te vinden in multi-species biofilms binnen de aanhanger slijm lagen op de host mucosale oppervlakken. Overleving en groei op deze plaatsen is afhankelijk van het vermogen van bacteriën om te binden aan het slijm lagen en af te breken complexe substraten zoals mucus glycoproteïnen tot kleine peptiden en sacchariden als voedingsbron genereren. In deze studie, L. fermentum
kon zowel binden en vormen biofilms in het MUC5B omgeving, overeenkomstig de expressie van het mucine-eiwit, 32-Mmubp van deze soorten [16]. De MUC5B mucine is een belangrijke component van slijm hechtende lagen in de mondholte en het vrouwelijke voortplantingssysteem, beide plaatsen waar L. fermentum
bekend te koloniseren [10, 24]. Ondernemingen De hoeveelheid proteolytisch actief cellen in biofilm populaties van L. fermentum
was een mucine-rijke omgeving significant hoger dan in de aanwezigheid van voedingsbouillon suggereert dat de aanwezigheid van mucinen bevordert proteolytische activiteit in L. fermentum
. Het vermogen van MUC5B mucinen proteolytische activiteit induceren eerder aangetoond in de orale commensale bacterie Streptococcus mitis
[25] en up-regulatie van proteolytische activiteit is ook aangetoond in de pathogene schimmel Aspergillus fumigatus
groeien in de maag mucinen [26]. Om de relatieve rol van oppervlakte-geassocieerde en vloeibare fase mucinen in het bemiddelen van deze verhoogde activiteit te bepalen werden L. fermentum
cellen toegestaan te hechten aan oppervlakken bekleed met mucinen of biofilms op niet-mucine-gecoate oppervlakken waar ze waren te vormen blootgesteld alleen vloeistoffase mucinen. Hieruit bleek dat blootstelling aan alleen vloeistoffase mucinen niet up-regelende invloed op de proteolytische activiteit in de biofilms had. Evenzo was de proteolytische activiteit versterkt in plankton cellen blootgesteld aan mucinen in oplossing, wat aangeeft dat de aanwezigheid van mucinen in de vloeistoffase niet up-reguleren proteolytische activiteit in L. fermentum
. Daarentegen contact van de cellen met het oppervlak geassocieerde mucinen veroorzaakte een significante toename in proteolytische activiteit in de populatie suggereert dat mucinen een centrale rol in het reguleren van de werking en het oppervlak geassocieerde moleculen van bijzonder belang. De onderliggende mechanismen van deze waarneming zijn nog niet bekend maar het is mogelijk dat epitopen binnen de mucinen, geopenbaard als gevolg van binding aan een oppervlak, vereist voor opwaartse regulatie van proteolytische activiteit. Interessant is dat de mate van proteolytische activiteit in biofilm cellen op het oppervlak geassocieerde mucinen (13 ± 0,4%) was lager dan die bij mucinen aanwezig waren zowel aan het oppervlak als in de vloeistoffase (47 ± 0,6%), hetgeen suggereert dat cellen Alle auteurs hebben gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
