Abstracte achtergrond
Titanium implantaten in de mondholte zijn bedekt met een speeksel afgeleide vlies waaraan vroege koloniserende micro-organismen zoals Streptococcus oralis
kan binden. De eiwitprofielen van speeksel pellicles op titanium zijn niet goed gekarakteriseerd en de eiwitten van belang te binden zijn dus bekend. Biofilmbacteriën verschillende fenotypes vertonen hun planktonische tegenhangers en Contact speekseleiwitten kan een factor die bijdraagt tot de inductie van veranderingen in fysiologie. We hebben speeksel pellicles gekenmerkt van titanium oppervlakken en onderzocht hoe het contact met ongestreken en speeksel-gecoate titanium oppervlakken beïnvloedt metabole activiteit in hechtende cellen van S
. oralis
.
Methods
speekselklieren pellicles op gladde titanium oppervlakken werden gedesorbeerd en deze, alsmede gezuiverd menselijk speeksel, werden onderworpen aan tweedimensionale gelelektroforese en massaspectroscopie. Een parallelle plaat stroom-cell model werd gebruikt binding van een verse isolaat van S
om te studeren. oralis
te ongestreken en speeksel-gecoate titanium oppervlakken. Metabolische activiteit werd gemeten met behulp van de Bac
Licht CTC Vitaliteit Kit en confocale laser scanning microscopie. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd en de resultaten geanalyseerd met behulp van Student's t
-test of ANOVA.
Resultaten
Secretory IgA, α-amylase en cystatines werden geïdentificeerd als dominante eiwitten in het speeksel pellicles. Selectieve adsorptie van eiwitten werd aangetoond door de verrijking van prolactine-induceerbare eiwit en afwezigheid van zink-α
2-glycoproteïne ten opzichte van speeksel. Hechting van S
. oralis
titaan tot een up-regulatie van metabolische activiteit in de populatie na 2 uur. In aanwezigheid van een speeksel vlies, werd dit effect versterkt en behouden gedurende de volgende periode van 22 uur.
Conclusies
wij dat hechting aan titanium gladde oppervlakken onder stroom blijkt veroorzaakt een opregulatie van de metabolische activiteit in de vroege mondelinge kolonisator S
. oralis
, waarschijnlijk als onderdeel van een aanpassing aan de biofilm levenswijze. Het effect was door een vlies met speeksel sIgA, α-amylase, cystatines en prolactine-induceerbaar eiwit dat werd voor het eerst geïdentificeerd als een overvloedige component van speeksel pellicles op titanium. Verdere studies zijn nodig om de onderliggende mechanismen tot gevolg oppervlaktecontact op de metabole activiteit verduidelijken en de speekseleiwitten taak het bevorderen van de werking te identificeren.
Sleutelwoorden
Bacteriën microbiële biofilm Implantaatoplossingen Streptococci Elektronische aanvullend materiaal
de online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-32) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is achtergrond
de menselijke mondholte herbergt een groot aantal. verschillende bacteriële soorten die in complexe, multi-species biofilms. Op tanden, zijn deze biofilms bekend als tandplak. Van cruciaal belang voor de vorming en ontwikkeling van plaque is de hechting van pionier soorten zoals Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis Kopen en Streptococcus gordonii
evenals Actinomyces naeslundii
naar het speeksel vlies die jassen het tandoppervlak [1, 2]. Zodra biofilmvorming is geïnitialiseerd en de ontluikende tandoppervlak gekoloniseerd, co-hechting van later kolonisators leidt tot de vorming van rijpe orale biofilms [3]. De vroege ontwikkeling van biofilms op tandheelkundige implantaten niet goed gekarakteriseerd maar de volgorde van microbiële kolonisatie vertoont gelijkenis met die tanden in de mondholte dezelfde zijn [4, 5].
Tanden en tandheelkundige implantaten, en de mucosale oppervlakken zijn bedekt met een vlies dat een dunne film geadsorbeerde eiwitten voornamelijk afkomstig van speeksel. Pellicle eiwitten bieden een scala van mogelijke receptoren voor de bevestiging van de vroege kolonisators. Een combinatie van in vivo en in vitro
studies met antilichamen gebaseerde en proteomics benaderingen, blijkt dat de verkregen glazuur vlies bevat een aantal verschillende speekseleiwitten zoals lysozym, histatinen, statherins [6], α-amylase , cystatines, secretorisch IgA (sIgA), lactoferrine en proline-rijke eiwitten (PRPs) [7] en de grote speekselklieren mucine, MUC5B [8]. Voor een uitgebreide samenvatting van eiwitten ontdekt in emaille pellicles zien Siquiera et al
., 2012 [9]. De samenstelling van een hechtend vlies, alsmede de dichtheid en bevestiging van de daarin aanwezige eiwitten, wordt algemeen gedacht te worden beïnvloed door de fysisch-chemische eigenschappen van de ondergrond, maar vooralsnog de totale samenstelling van het speeksel pellicles gevormd op verschillend gemodificeerde titanium oppervlakken bekend. Ondanks het bestaan van slechts enkele studies zijn sommige speekseleiwitten waaronder cystatines, sIgA, α-amylase en proline-rijke eiwitten geïdentificeerd in de hechtende vlies gevormd op titanium in vitro
via Western blotting [10, 11]. Echter in al deze studies, de gebruikte speeksel te bereiden voor gebruik als vlies werkwijzen kan een grote invloed op de verkregen resultaten. Zo kan filteren en centrifugeren technieken grote populaties van speekselproteïnen leidt tot de vorming van speeksel pellicles die niet representatief zijn voor de aanwezigen in vivo
verwijderen. Ondernemingen De erkenning dat microbiële biofilms zijn een belangrijke factor in verband met het falen van tandheelkundige implantaten [12] heeft geleid tot vele onderzoeken van bacteriële hechting aan titanium oppervlakken. In vivo
, waar de hechting van bacteriën en de vorming van speeksel vlies optreden in parallel, S
. oralis Kopen en S
. mitis
behoorden tot de belangrijkste vroege kolonisten on-titanium coating glazen oppervlakken en geen Actinomyces
soorten werden gevonden [13]. In vitro
, heeft de aanwezigheid van sputum aan beide gladde of ruwe oppervlakken matig blijkt zowel verhoging en de hechting van de vroege kolonisator, S
verminderen. oralis
, [10, 14], terwijl de binding van A
. naeslundii
titaan niet beïnvloed door de aanwezigheid van een speeksel vlies [11]. Algemeen zijn de resultaten van studies van bacteriële hechting aan titaan in aanwezigheid van speeksel leverde een duidelijk beeld en terwijl sommige van de verschillen gezien het speeksel gebruikt kunnen geweten kan variatie in de bacteriestammen en soorten titaanoppervlak ook bijdragen aan gebrek aan consensus.
Terwijl biofilm ontwikkeling is belangrijk voor de ontwikkeling van orale ziekten, een cruciale factor is de fysiologie en activiteitsniveau van de aangehechte bacteriën. Bacteriële aanpassing aan de biofilm levenswijze bekend is geassocieerd te worden met grote veranderingen in transcriptie en eiwitsynthese [15]. Bijvoorbeeld, Porphyromonas gingivalis
vergelijkende transcriptoom analyse toonde aan dat een groot aantal genen die differentieel uitgedrukt in biofilm cellen in vergelijking met hun vrije zwevende tegenhangers [16]. In een onderzoek in Streptococcus mutans
, de relatieve snelheid van de synthese van ten minste 25 verschillende eiwitten was verhoogd binnen 2 uur na bevestiging aan een glasoppervlak. Deze eiwitten werden meestal geassocieerd met koolhydraat katabolisme [17] suggereert dat veranderingen in metabole activiteit kan optreden tijdens hechting aan oppervlakken. Weinig bekende echter de metabolische status van cellen tijdens interacties met vlies eiwitten in de vroege stadia van biofilmvorming. Het doel van dit werk was om te bestuderen hoe de naleving van titanium oppervlakken van invloed op de metabole activiteit van de vroege kolonisator S
. oralis Kopen en het effect van een speeksel vlies dit proces bepalen. Aan het licht, waarop speeksel eiwitten hechting en metabolische activiteit van invloed kunnen werpen, hebben de overheersende eiwitten die aanwezig zijn in een speeksel vlies gevormd op titanium geïdentificeerd.
Methoden
Bacteriën en kweekomstandigheden
Een frisse klinische isolaat van S
. oralis
(89C) werd verkregen van een patiënt met een aan de gang zijnde peri-implantaat infectie na ethische goedkeuring werd verkregen van de Faculteit der Odontology [14]. Bacteriën werden gedurende de nacht gekweekt op agar in een atmosfeer van 5% CO 2 in lucht bij 37 ° C. Kolonies werden gesuspendeerd in 120 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing [0,15 M NaCl, 10 mM NaH 2PO 4, pH 7,4 (PBS)] om een OD 600nm geven = 0,6. Voor de stroomsnelheid celexperimenten, een gelijk volume PBS werd toegevoegd om de celconcentratie vóór biofilmvorming halveren, terwijl de planktonische experimenten de oorspronkelijke bacteriële suspensie werd gemengd met een gelijk volume PBS of 50% volledig menselijk speeksel geeft een eindconcentratie van 25% speeksel.
Verzameling en bereiding van speeksel
speeksel verzameld op ijs gedurende 1 uur van tien gezonde individuen werd verzameld en bereid zoals eerder beschreven [18] na ethische toestemming werd verkregen van de Faculteit der Odontologie. In het kort werd het monster gemengd met een gelijk volume PBS, voorzichtig geroerd overnacht bij 4 ° C en gecentrifugeerd in een Beckman Coulter Avanti JE centrifuge (Beckman JA 20 rotor, Beckman Coulter, Brea, CA) (20 min, 30 000 g
, 4 ° C). De supernatant werd vervolgens onderworpen aan isopycnische dichtheidsgradiënt centrifugatie in CsCI /0,1 M NaCl in een Beckman Coulter Optima LE-80K ultracentrifuge (Beckman 50.2 Ti rotor begindichtheid 1,45 g ml -1) bij 36.000 rpm gedurende 90 uur bij 15 ° C. Fracties bevattende bacteriën werden verwijderd en de overblijvende werden samengevoegd, gedialyseerd tegen PBS en opgeslagen bij -. 20 ° C
Titanium oppervlakken
titanium oppervlakken die in deze studie waren commercieel zuiver titanium klasse IV, die glad is, met een gemiddelde oppervlakteruwheid (S a) van 0,1 urn [14]. De platen (99 × 25 × 0,8 mm) werden gedraaid, gereinigd met detergent, gespoeld met gedestilleerd water en gesteriliseerd met behulp van γ straling (ELOS Pinol A /S).
Karakterisering van speeksel pellicles
Twee titanium platen, gescheiden door een rubberen afstandhouder met een dikte van 1,6 mm, werden aangebracht in een stroming-cel en de oppervlakken bekleed met 50% volledig menselijk speeksel nacht. Na deze tijd werd de stroom-cellen afgegoten en de oppervlakken gewassen (2 x 2 min) met PBS op een schommelende plaat. De oppervlakte-geassocieerde pellicles, een mengsel van Tween 80 (0,006 v /v%) en Triton X-100 (0,012 v /v%) werd ingebracht en de volledige stroom-cellen geplaatst in een ultrasoon bad gedurende 1 uur verwijderd. De inhoud werd toen gedraineerd en verzameld voordat men deze stap nog eens 15 minuten. Eiwit desorbates verzameld na elke wasbeurt werden samengevoegd en de eiwitconcentratie bepaald met behulp van een 2D-Quant kit (GE Healthcare Life Sciences). Een volume dat overeenstemt met 20 ug eiwit werd onderworpen aan 2DE. In het kort werd de rehydratatie desorbate verdund met buffer en in een opnieuw zwellen cassette met 18 cm pH 4-7 lineaire IPG strips (GE Healthcare Life Sciences) geplaatst. Rehydratatie werd uitgevoerd bij kamertemperatuur gedurende 30 uren onder siliconenolie. Iso-elektrische focussering werd uitgevoerd met behulp van een Multiphor II (GE Healthcare Life Sciences) met koelwater bij 15 ° C door Pharmacia Multitemp II geleverd. De nadruk werd gestart bij 150 V gedurende 1 uur voortgezet bij 300 V gedurende 3 uur, 600 V gedurende 3 uur, 1200 V gedurende 12 uur en tot slot 3500 V gedurende 20 uur. Na concentreren werden de IPG-strips bewaard bij -80 ° C. Voordat u in de tweede dimensie werden de IPG strips eerst geëquilibreerd in 50 mM Tris buffer pH 6,8 die 2% SDS, 26% glycerol en 16 mM DTT gedurende 15 minuten en daarna in 50 mM Tris buffer pH 6,8 die 2% SDS, 26 % glycerol, 250 mM joodaceetamide en 0,005% broomfenolblauw nog eens 15 minuten. De geëquilibreerde IPG strips ingebed bovenop 14% polyacrylamidegelen (20 x 20 x 0,1 cm) onder toepassing van 0,5% (w /v) gesmolten agarose. SDS-PAGE werd uitgevoerd bij een constante stroom van 15 mA gel -1, 10 ° C, 's nachts in een PROTEAN II xi cel (Bio-Rad) met regenboog high-range massastandaarden moleculaire (GE Healthcare Life Sciences) run aan de zure kant van het IPG strips. Gels werden
gekleurd met Coomassie brilliant blauw of zilver volgens de protocollen van GE Healthcare Life Sciences. Identificatie van eiwitten op 2D-gels door LC-MS /MS
Spots van belang werden met de hand uitgesneden uit Coomassie brilliant blauw gekleurde 2DE gels van speeksel en onderworpen aan LC-MS /MS zoals eerder beschreven [19]. In het kort werden proteïnen gereduceerd met DTT (60 ° C, 20 minuten), gealkyleerd met joodacetamide (25 ° C, 10 minuten) en vervolgens gedigesteerd met trypsine (37 ° C, 8 uur). Tryptische peptiden werden gescheiden en onderworpen aan MS. Peptide pieken werden automatisch deconvoluted en massa-lijsten in de vorm van Mascot Generic Files gebruikt als input voor Mascot MS /MS Ionen zoekopdrachten van de NCBInr database met behulp van de Matrix Science web server (http:.. //Www matrixscience com) .
Bepaling van oppervlaktebedekking en levensvatbaarheid
levensvatbaarheid van cellen gesuspendeerd in PBS of 25% speeksel werd bepaald door kleuring een druppel van de suspensie met de live /Dead Bac
Light kleuring kit (Life Technologies, Stockholm , Zweden) bij aanvang (tijd 0), na 2 en 24 uur en het bekijken met een omgekeerde confocale laser scanning microscoop (CSLM) (Eclipse TE2000, Nikon Corp.). De verticale, parallelle plaat stroming gebruikte celsysteem is eerder beschreven (14). In het kort, S
. oralis
cellen werden gepasseerd twee titanium oppervlakken (99,25 x 25,25 x 0,8 mm), gescheiden door een 1,6 mm rubber spacer, die ofwel ongecoat waren of waren 's nachts bedekt met speeksel. Alle experimenten werden uitgevoerd bij 37 ° C en een laminaire stroming van 42 ml h -1 werd gebruikt om de dagelijkse speekselvloed via orale oppervlakken modelleren. Alle oplossingen werden ingebracht door de onderste inlaat en afvoer plaatsgevonden door de bovenste klep. Aanvankelijk werden oppervlakten gespoeld met PBS gedurende 30 minuten. Dezelfde bacteriële suspensie werd vervolgens in twee stromen cellen; een met twee onbeklede oppervlakken en de andere twee met speeksel beklede oppervlakken 2 of 24 uur bij 37 ° C. Hierna werden de stroomsnelheid cellen gewassen met PBS (zoals hierboven) gedurende 30 minuten om losjes gebonden bacteriën van het oppervlak te verwijderen. Oppervlaktebedekking en levensvatbaarheid van oppervlakte-geassocieerde cellen werden op een van de titanium platen in iedere stroom-cel gebruikt Live /Dead Bac
Licht kleuring. Experimenten werden drie keer uitgevoerd met behulp van onafhankelijke bacterieculturen.
Bepaling van de metabolische activiteit Belgique Om metabole activiteit van planktonische cellen te onderzoeken, werd een monster verwijderd uit dezelfde bacteriële suspensie gebruikt voor de levensvatbaarheid metingen, geplaatst in een ibidi flow celkamer en de cellen geïncubeerd met het Bac
Licht CTC Vitality Kit (Life Technologies, Stockholm, Zweden) in een vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 2 uur. De objectglaasjes werden vervolgens bekeken met een CSLM. De metabolische activiteit aan elkaar hechtende cellen te onderzoeken, de tweede titaniumplaat in iedere stroom-cellen, werd geïncubeerd met het Bac
Licht CTC Vitality kit zoals hierboven beschreven en de cellen vervolgens tegengekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol ( DAPI, Life Technologies, Stockholm, Zweden). Gekleurde cellen werden gevisualiseerd met behulp van een CSLM.
Image analyses en statistieken
Voor monsters gekleurd met de Live /Dead Bac
lichte vlekken kit, tien willekeurige afbeeldingen, elk met een oppervlakte van 127,3 urn 2 werden genomen voor beeldanalyse. Beelden werden geanalyseerd met de BioImage
_L
softwarepakket de gemiddelde oppervlaktebedekking en de hoeveelheid levende (groen) en dode (rode) cellen [20] kwantificeren. Voor monsters gekleurd met het Bac
Licht CTC Vitality Kit metabole activiteit bepalen, werd beeldanalyse uitgevoerd door het waarnemen van ten minste 1000 cellen en tellen van het aantal metabolisch actieve cellen (rood /roze) en niet-actieve cellen (onbesmet in de opschorting monsters of tegengekleurd blauw op de titanium oppervlakken). De verkregen resultaten werden geëvalueerd met behulp van Student's t-test
twee groepen of een eenzijdige ANOVA met Bonferroni post-test drie groepen vergelijken vergelijken. Een betrouwbaarheidsinterval van 95% werd gekozen en p-waarden lager dan 0,05 werden significant beschouwd.
Resultaten
Biofilmvorming op titanium in flow-cellen Ondernemingen De biofilm-vormende vermogen van S
. oralis
werd onderzocht in een stroom-celsysteem dat twee onbeklede titanium oppervlakken. Bacteriële kolonies gedispergeerd in PBS werden in stroom-cellen en toegestaan te hechten gedurende 2 en 24 uur. Na 24 uur werd de gemiddelde bedekkingsgraad af met 60% vergeleken met die na 2 uur, wat suggereert dat sommige cellen die aanvankelijk los gehecht tijd (Figuur 1). In de eerste celsuspensie het niveau van de levensvatbaarheid was hoog zoals onthuld door kleuring met de Bac
Licht Levend /Dead kit. Na 2 en 24 uur, de levensvatbaarheid van de hechtende populaties niet significant verschillen van die van de originele suspensie, hetgeen aangeeft dat binding aan titaan had geen negatieve invloed op de cellen. Sinds oppervlakken in de mondholte zijn bedekt met een speeksel vlies, onderzochten we het effect van het speeksel op de naleving en de levensvatbaarheid van S
. oralis
. Op oppervlakken bekleed met 25% speeksel, het gemiddelde oppervlak dekking na 2 uur (178 ± 103 pm 2) was niet significant verschillend met die op de onbeklede oppervlakken (p = 0,67) (gegevens niet getoond). Wat betreft de niet-gecoate oppervlakken, na 24 uur was de gemiddelde oppervlakte dekking op het speeksel jas was gedaald (24,6 ± 7,4 micrometer 2), waaruit blijkt dat bacteriële cellen ook los van deze oppervlakken in de tijd. De mate van levensvatbaarheid van de cellen op het speeksel beklede oppervlak was niet significant anders dan dat op het onbeklede oppervlak op hetzelfde tijdstip. Figuur 1 toont afbeeldingen biofilmvorming door S. oralis op ongecoat titanium oppervlakken. Bacteriën gesuspendeerd in PBS mochten biofilms op titanium oppervlakken in een parallelle plaat stroming-cel te vormen voor 2 en 24 uur. De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door Levend /Dead Bac
Licht kleuring en bekijken met CSLM. Oppervlak dekking op de titanium platen werd beoordeeld vanuit tien willekeurige afbeeldingen met behulp van de BioImage
_L
softwarepakket. De omvang balken geven 10 urn en de inzetstukken tonen cellen in tweevoud uitbreiding.
Metabolische activiteit in relatie tot contact met ongestreken en speeksel-gecoate oppervlakken
metabole activiteit van S
. oralis
cellen werd vastgesteld met behulp van Bac
Licht CTC Vitality Kit, waarbij metabolisch actieve cellen verminderen kleurloze tetrazolium zout een onoplosbaar formazan product waardoor ze rood verschijnen (of roze in aanwezigheid van de blauwe DAPI tegenkleuring). Cellen uit bloed agar op tijdstip 0 en gedispergeerd in PBS vertoonde een lage endogene metabole activiteit (6 ± 1,5%) (Figuur 2). Vervolg incubatie van de cellen in PBS had geen significant effect op de metabolische activiteit na 2 uur (4 ± 0,5%) of 24 uur (2 ± 0,1%). Echter, na 2 uur in de stroom-cell model, de hechtende populatie bevatten een aanzienlijk hoger percentage rode cellen aangeeft dat metabole activiteit werd gestimuleerd door contact met een oppervlak. Na 24 uur was het niveau van de metabole activiteit in de hechtende populatie af maar was nog steeds significant groter dan in de oorspronkelijke suspensie PBS (p & lt; 0,01). Figuur 2 Afbeeldingen tonen metabole activiteit van S. oralis in suspensie en gehandeld op grond van niet-gecoate titanium oppervlakken. Bacteriën gesuspendeerd in PBS mochten biofilms op titanium oppervlakken in een parallelle plaat stroming-cel te vormen voor 2 en 24 uur. De metabole activiteit van de cellen werd vastgesteld met behulp van Bac
Licht CTC Vitality Kit. Voor gehecht cellen werd DAPI als een tegenkleuring. De cellen werden bekeken met CSLM en het aandeel van metabolisch actief (rood /roze) cellen beoordeeld door handmatig tellen van ten minste 1000 cellen. De omvang balken geven 10 urn en de inzetstukken tonen cellen in tweevoud uitbreiding. Ondernemingen De effecten van speeksel coating op de metabole activiteit van hechtende bacteriën werden vervolgens onderzocht. Hieruit bleek dat de niveaus waren significant hoger voor cellen geassocieerd met speeksel beklede oppervlak na 2 uur en 24 uur vergeleken met die in de oorspronkelijke suspensie PBS (p & lt; 0,001) (figuur 3). Incubatie van bacteriën met 25% speeksel in suspensie veroorzaakt geen significante verandering in metabolische activiteit gedurende 2 uur (4 ± 0,5%) of 24 uur (3 ± 0,6%), wat suggereert dat het effect was specifiek voor speekseleiwitten gehecht aan een oppervlak. Deze gegevens tonen derhalve dat speekseleiwitten geadsorbeerd te zijn tot een metabole respons die niet wordt gezien als de eiwitten in oplossing aanwezig zijn wekken. Figuur 3 toont afbeeldingen metabole activiteit van S. oralis gehandeld op grond van speeksel gecoat titanium oppervlakken. Bacteriën gesuspendeerd in PBS mochten biofilms on-speeksel beklede titanium oppervlakken in een parallelle plaat stroming-cel te vormen voor 2 en 24 uur. De metabole activiteit van de cellen werd vastgesteld met behulp van Bac
Licht CTC Vitality kit met DAPI als tegenkleuring. De cellen werden bekeken met CSLM en het aandeel van metabolisch actief (rood /roze) cellen beoordeeld door handmatig tellen van ten minste 1000 cellen. De schaalbalken vertegenwoordigen 10 urn en de inserts vertonen cellen in tweevoudige vergroting.
Aangezien niet-levensvatbare cellen op het oppervlak niet verwacht metabolische activiteit vertonen, de mate van metabole activiteit onderzocht als functie van het aantal levensvatbare cellen een verhouding werd berekend voor elk tijdstip (Tabel 1). Hieruit bleek dat de cellen gesuspendeerd in PBS of speeksel, terwijl levensvatbaarheid behouden, waren er geen significante veranderingen in metabolische activiteit in de tijd. Hechting aan een onbeklede oppervlak veroorzaakt het gedeelte van de levensvatbare cellen die metabolisch actief stijgen tot 50% na 2 uur waren, terwijl binding aan een speeksel vlies aanzienlijk toegenomen dit niveau tot 98% van de levensvatbare cellen (p & lt; 0,001). Terwijl dus contact opneemt met een oppervlak een toename van de metabole activiteit in de populatie veroorzaakt, was dit sterk door de aanwezigheid van een speeksel vlies. Na 24 uur was het aantal metabolisch actieve cellen op het onbeklede oppervlak titaan tot 25% gedaald, terwijl op de met speeksel beklede oppervlak niveau bleef 96%. Dit suggereert dat, naast het verbeteren van de initiële respons op contact oppervlak de aanwezigheid van speekselproteïnen aanhoudende toename van de metabole activiteit dan 24 hours.Table 1 Percentage levensvatbare bacteriën in de populatie blijkt metabole activiteit onder verschillende omstandigheden
Milieu
% levende cellen met metabolische activiteit
0 h kopen van 2 uur
24 uur
cellen gesuspendeerd in PBS
6 ± 1,5
4 ± 0,5 kopen van 2 ± 0,03
cellen gehandeld op grond van niet-gecoate oppervlakken in PBS
Catawiki -
50 ± 4,5
25 ± 2,6
cellen gesuspendeerd in 25% speeksel
-
4 ± 0,8
3 ± 0,6
Cells gehandeld op oppervlakken bekleed met 25% speeksel
-
98 ± 4,3
96 ± 6,3
Karakterisering van speeksel coating op titanium oppervlakken Belgique om de belangrijkste eiwitbestanddelen in het bacterievrije speeksel preparaat kunnen identificeren, werd het materiaal onderworpen aan 2DE en eiwitten zichtbaar gemaakt door kleuring met Coomassie brilliant blue (figuur 4a). Dit toonde de aanwezigheid van meer dan 100 spots, waarvan de meerderheid (70) werden opgepikt en 68 van deze kunnen worden geïdentificeerd met behulp van LC-MS /MS (Tabel 2). Bijna alle eiwitten die werden speeksel oorsprong, met secretorische IgA, zink-α 2-glycoproteïne, leden van het cystatine-familie, α-amylase en prolactine geïnduceerde eiwit (PIP) als de dominante species in het voorbereiding. Bovendien, kallikreïne, vetzuur bindend eiwit en von Ebner's eiwit geïdentificeerd. Figuur 4 2DE gels speeksel en speeksel vlies gedesorbeerd uit titanium oppervlakken. Gepoolde volledig menselijk speeksel (A) en speeksel pellicles gedesorbeerd uit titanium oppervlakken met wasmiddel (B) onderworpen aan iso-elektrisch focusseren op pH 4-7 IPG strips, gevolgd door SDS-PAGE op 14% gels. Gels werden gekleurd met Coomassie Blue (A) of zilver (B). Spots van belang werden geplukt uit de Coomassie gel, geïdentificeerd met behulp van LC-MS /MS en spot identiteiten overgebracht naar het zilver gel. Een verklaring van de labels wordt gegeven in tabel 2. Tabel 2
identiteiten van eiwitten van speeksel en speekselklieren pellicles gedesorbeerd uit titanium oppervlakken met wasmiddel verkregen middels LC-MS /MS of spots van 2DE gels.
Protein identiteit
Spot naam
% Sequence dekking
gedetecteerd op het oppervlak
Amylase
amy
45- 55
Ja
calgranuline
cal
49 verhuur No
Cystatin
S
cysS
77
Yes
SA
cysSA
37–73
Yes
D
cysD
31
Yes
Vetzuur bindend eiwit
fab
51
Ja
immunoglobuline A
J-keten
IgA /J
37-63
Ja
zware keten
IgA /h
18- 36
Ja
zware keten C gebied
IgA /c
21 verhuur No
Secretorische component
sec
32–36
Yes
Bur
Bur
11–15
No
Immunoglobuline
lichte keten (kappa)
Ig /κ
38-59
Ja
kallikreïne
kal
10 verhuur No
Prolactine-induceerbare eiwit
pip
63-67
Ja
Von Ebners 's klier eiwit (lipocaline)
VEB
27 verhuur No
Zink-α 2-glycoproteïne
ZnGP
23-45 verhuur No
Om de eiwitten die aanwezig zijn in het identificeren speeksel vliesje gevormd op titanium oppervlakken werden overnacht geïncubeerd met speeksel en, na wassen, werden de aangehechte eiwitten gedesorbeerd met water en onderworpen aan 2DE (figuur 4b). Zilverkleuring van de gels toonde ongeveer 50 vlekken die alle werden waargenomen in de met Coomassie gekleurde gel speeksel. Secretorische IgA, cystatine eiwitten, α-amylase en PIP aanwezig maar zink-α 2-glycoproteïne afwezig aangeeft dat dit eiwit zich niet aan het titanium oppervlak. De relatieve intensiteit van PIP plekken in het vlies was groter dan in de oorspronkelijke speeksel preparaat suggereert dat dit eiwit kan worden verrijkt op het titanium oppervlak.
Discussie
vroege kolonisators zoals S.
. oralis
initiëren biofilmvorming door direct interactie met de speekselklieren vlies die aanwezig zijn op orale oppervlakken. In deze studie hebben wij gebruikt pellicles speeksel bereid door dichtheidsgradiënt centrifugatie onder niet-denaturerende omstandigheden. Het voordeel van deze techniek is dat speeksel bacteriën, die worden gepelleteerd, kan worden gescheiden van grote macromoleculen mogen voorbereiden bacterievrij, 'inheemse' speeksel waarin zelfs grote speekseleiwitten aanwezig zijn. We hebben eerder geïdentificeerd beide grote speekselklieren mucinen (MUC5B en MUC7) en gp340, lysozym, lactoferrine, α-amylase, secretorische IgA en statherin in dit preparaat middels ELISA [21]. In deze studie hebben we 2DE uitgevoerd in combinatie met LC-MS /MS lager molecuulgewicht speekseleiwitten (Figuur 4a) te identificeren. Secretorische IgA was het meest voorkomende eiwit zoals blijkt uit de aanwezigheid van verschillende fragmenten (secretorische component, zware keten, κ keten en J-keten). In overeenstemming met de analyses van het menselijk speeksel door andere groepen met behulp van proteomics komt [7, 22] waren we ook in staat om α-amylase te identificeren, eiwitten van de cystatine-familie, zink-α 2-glycoproteïne en PIP. Vetzuurbindend eiwit, kallikreïne en von Ebners klier eiwit (lipocaline) waren in geringe hoeveelheden. In deze studie hebben we de methodologie om de speekselklieren pellicles gevormd op titanium onderzoeken toegepast. Hieruit bleek dat sIgA en α-amylase waren de meest overvloedige proteïnen in het vlies naast leden van de eiwitfamilie en cystatine PIP (figuur 4b). Vorige studies met behulp van SDS-PAGE in combinatie met Western blot-analyse met specifieke antilichamen tegen speekseleiwitten hebben aangetoond dat α-amylase, sIgA en PRPs binden aan titaan [10, 11]. Zink-α 2-glycoproteïne verblijf buiten de vlies desorbate suggereert dat dit eiwit niet voldoet aan titaan terwijl de grotere relatieve hoeveelheid van PIP in de desorbate dan in het oorspronkelijke speeksel preparaat aangeeft dat het proteïne verrijkte op het oppervlak. Orale bacteriën zoals S
. salivarius
, S
. parasanguinis Kopen en S
. oralis
kan interageren met PIP [23, 24], wat suggereert dat dit eiwit een belangrijke rol zou kunnen spelen bij het moduleren van bacteriële kolonisatie van de orale oppervlakken. Voor zover wij weten is dit de eerste keer dat PIP is geïdentificeerd als een overvloedige eiwit in pellicles op titanium. Een 20 kDa eiwit overeenkomt met PIP [25] Eerder is aangetoond dat bindt aan hydroxyapatiet maar niet verrijkt op dezelfde wijze even [26] gevonden. Een beperking van deze studie is echter dat het op dit moment niet bekend of de resultaten ook van toepassing op andere titanium oppervlakken met verschillende oppervlak topografieën of het oppervlak wijzigingen.
In de stroming-cel model, S
. oralis
hechtte goed aan speeksel beklede oppervlakken na 2 uur - in overeenstemming met andere studies op primaire kolonisators zoals Streptococcus anginosus
, Streptococcus gordonii Kopen en Streptococcus sanguis
[10] en Actinomyces naeslundii
[11]. Als groep zijn orale streptokokken bekend adhesinen die affiniteit hebben voor verschillende eiwitten in speeksel [27] te drukken. In een eerdere studie, identificeerden wij een 1060 aminozuur-bevattende LPXTG-gebonden eiwit tot expressie gebracht in stammen van S.
. oralis
die goed gebonden aan speeksel pellicles en in silico
analyse van de S
. Alle auteurs hebben gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
