Abstracte achtergrond
Met de stijgende vraag naar botgeïntegreerd titanium implantaten voor het vervangen van ontbrekende tanden, vaak bij patiënten met een geschiedenis van parodontitis, hebben-implantaat gerelateerde infecties een groeiend probleem geworden. Nieuwe methoden voor de behandeling en preventie van implantaat infecties zijn dringend nodig. Het doel van dit onderzoek was om te onderzoeken of verschillende pH, de atmosfeer en de oppervlakte-eigenschappen van bacteriële hechting aan oppervlakken titanium gebruikt in de tandheelkundige implantaten kunnen beperken.
Methods
Titanium schijven met machinaal of geanodiseerd (TiUnite ™) oppervlak werden met een co-cultuur van Streptococcus mitis Kopen en Actinomyces oris
(vroege kolonisten van orale oppervlakken) bij een pH van 5,0, 7,0 en 9,0 op de aërobe of anaërobe atmosfeer. De hechting werd geanalyseerd door het tellen van kolonievormende (CFU) eenheden op agar en door confocale laser scanning microscopie (CLSM).
Resultaten
de CFU analyse toonde dat een pH van 5,0 bleek de hechting van S. significante daling mitis, Kopen en een aërobe sfeer, de hechting van A. oris
. S. mitis
werd gevonden in aanzienlijk minder bedragen op geanodiseerd oppervlak dan het bewerkte oppervlak, terwijl A. oris
werd gevonden in gelijke hoeveelheden op beide vlakken. De CLSM analyse bevestigde de resultaten uit de CFU tellen en aanvullende informatie over de wijze waarop de twee mondelinge commensal soorten gehecht aan de oppervlakken. Voornamelijk in verspreide clusters gericht met de bosjes van het bewerkte oppervlak en de poriën van het geanodiseerd oppervlak
Conclusies
Bacteriële hechting van S. mitis Kopen en A. oris
kan worden beperkt door zure pH en aërobe sfeer. Het geanodiseerde oppervlak verminderde de hechting van S. mitis
in vergelijking met de bewerkte oppervlakte; terwijl A. oris
gehecht evengoed om de poriën van het geanodiseerd oppervlak en de groeven van het bewerkte oppervlak. Het is moeilijk direct de resultaten over in een klinische situatie. Het is echter de moeite waard verder onderzoek van deze resultaten van een in vitro perspectief, dan wel klinisch, meer kennis van de effecten zure pH en aërobe sfeer op initiële bacteriële hechting te verkrijgen.
Sleutelwoorden
Bacteriële hechting Implantaten Peri -implant ziekte confocale laser scanning microscopie Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-4) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is
. achtergrond
Advances in tandheelkundige implantologie de afgelopen 20 jaar hebben het mogelijk gemaakt om een groter aantal patiënten met succes botgeïntegreerde implantaten bieden. [1, 2]. Echter, met de verschuiving van vooral de behandeling volledig tandeloze patiënten om patiënten ontbreekt een of een paar tanden, vaak als gevolg van parodontitis, implantaten gerelateerde bacteriële infecties hebben een punt van toenemende zorg [3-5] geworden. Bacteriën kolonisatie van de parodontale pockets kan zich verspreiden naar de peri-implantaat weefsel en blootgesteld implantaat deel, en kunnen een ontstekingsreactie in de peri-implant weefsel [6] te starten. Een ontsteking in het zachte weefsel rond het implantaat kan de dichte verbinding tussen de mucosa en het implantaat abutment verstoren. Hierdoor bacteriële hechting mogelijk het gladde oppervlak van de opbouw en, indien blootgesteld aan het ruwe oppervlak van het implantaat [7, 8]. Indien niet succesvol behandeld, kan de ontsteking uiteindelijk leiden tot afbraak van de implantaat-ondersteunende been, waardoor verlies van het implantaat. Behandeling van peri-implantaat vandaag ziekte omvat vaak grondige mechanische reiniging van het implantaat oppervlak en het gebruik van systemische antibiotica, maar er is geen garantie voor een succesvol resultaat [9, 10]. Ondernemingen De initiële hechting van bacteriën blootgestelde implantaat delen worden beïnvloed door variaties in de orale omgeving. De pH en het niveau van zuurstof in de mondholte is afhankelijk van een aantal factoren, waaronder de inname van voedsel, mondgezondheid en de locatie in de mond, dat wil zeggen de lucht blootgesteld tandoppervlak vs. zuurstof beroofd tandvlees zak. [11]. Orale bacteriën, zoals Streptococcus mitis Kopen en Actinomyces oris
(voorheen naeslundii
genotype II), zijn normaal in de lucht blootgesteld marge van het tandvlees spleet, en worden voortdurend gespoeld door speeksel met een neutrale pH van 7. echter, met de toename in bacteriële belading de lokale omgeving zuurder als gevolg van bacteriële productie van melkzuur [12]. Bovendien ontsteking in het implantaat omliggende zachte weefsel leidt tot een verhoogde productie van het licht alkalisch gingivale spleet vloeistof [13], en een verdieping van de peri-implantaat pocket [10, 14]. Met de verdieping van de tandvlees zak, de zuurstofverzadiging van de spleet vloeistof afneemt [15]. Veel van de studies in de literatuur zijn toegespitst op effecten van verzuring op cariës veroorzakende Streptococcus mutans
[16, 17], en de hechting aan hydroxyapatiet, een biokeramische vergelijkbaar met de minerale bestanddeel van bot en tanden [18]. Een zure pH van 4,5 is aangetoond dat de hechting van S. mutans Belgique Om hydroxyapatiet verminderen, terwijl een pH van 6,0 is gemeld dat een vergelijkbaar effect op het vermogen van A. oris
te hechten [19] hebben . Er is echter geen uitgebreid onderzoek gedaan naar het effect van verzuring op de bacteriële hechting aan het oppervlak van titanium implantaten en abutments, noch heeft het effect van alkalische pH op de bacteriële hechting grondig onderzocht, hoewel veel antimicrobiële irrigatie oplossingen en gels hebben een alkalische pH [20, 21]. Voorts hebben de meeste onderzoeken werden uitgevoerd met een monocultuur. Gezien de complexiteit van de microbiële gemeenschap van de mondholte, kan het gebruik van twee bacteriën in een co-kweek belangrijke aanvullende informatie.
Om implantaat gerelateerde infecties en de behandelingsopties verbeteren, meer kennis bacteriële hechting aan oppervlakken van het implantaat, bijvoorbeeld de invloed van oppervlakte-eigenschappen en de milieu-omstandigheden, is van cruciaal belang. Het doel van deze studie was om het effect van pH 5,0, pH 7,0 en 9,0 in combinatie met aërobe of anaërobe atmosfeer op de initiële bacteriële hechting van een co-cultuur van S. mitis Kopen en A. oris
onderzoeken zowel machinaal bewerkte en geanodiseerde titanium oppervlakken; en analyseren of de kenmerken van het implantaatoppervlak beïnvloedt de oorspronkelijke bacteriële hechting. S. mitis Kopen en A. oris Wat zijn beide facultatieve anaërobe die kan overleven in een aërobe omgeving, al hebben zij een groter groeipotentieel onder anaerobe omstandigheden. Onze hypothese is dan ook, dat bacteriële hechting beperkt door een aërobe omgeving en door zowel zure als alkalische pH. Terwijl verder ruwe oppervlakken meestal bacteriële hechting vergemakkelijken, het geanodiseerd oppervlak een titaniumoxidelaag hoofdzakelijk constante van de kristallijne fase anataas, waarvan bekend is dat antimicrobiële eigenschappen [22, 23] hebben. Zo hebben we verder veronderstellen dat minder bacteriën moeten hechten aan de lichtopbrengst dan het bewerkte titanium oppervlak.
Methods
Titanium schijven
Discs van commercieel zuiver titanium (diameter 15 mm) met ofwel een bewerkt of geanodiseerd (TiUnite ™) oppervlak gebruikt (zie figuur 1). De schijven met bewerkt oppervlak had een dikte van 1,0 mm en de schijven lichtopbrengst had een dikte van 1,7 mm. Alle schijven werden geproduceerd, gereinigd, gesteriliseerd en in ethanol geleverd door Nobel Biocare AB. De gemiddelde oppervlakteruwheid (S
a) van de schijven werd gemeten bij Nobel Biocare AB na de productie in een 88 x 76 micrometer gebied door interferentie microscopie met de Mapview EX oppervlakteafbeelding software en een Gaussische high-pass 50 x 50 micrometer filter. De S een waarde (± standaarddeviatie) bleek 0,48 ± 0,04 urn voor de bewerkte oppervlak en 1,26 ± 0,09 urn voor de lichtopbrengst te zijn, corresponderen met waarden die in de literatuur voor gelijkwaardige implantaten [24, 25]. De S een waarde werd verkregen door het berekenen van het rekenkundig gemiddelde van de absolute waarden van de gemeten oppervlak afwijkingen van een middenvlak in bemonsteringsplaats [26]. De Gauss filter werd toegepast om de ruwheid te scheiden van de golving en de vorm van het oppervlak [25]. De S een gemeten gedurende ten minste 2 plaatsen per drievoud van elk oppervlak. Figuur 1 Scanning elektronenmicroscopie (SEM) beelden van de bewerkte (a) en geanodiseerd (b) titanium oppervlakken door Nobel Biocare AB. De bewerkte oppervlak is relatief glad met duidelijke oriëntatie van de oneffenheden (anisotrope), terwijl de geanodiseerd oppervlak ruw met een homogene structuur (isotroop).
Bereiding van Inentingen
De vroege kolonisten S. mitis
(CCUG 27.741) en A. oris
(CCUG 33.517), oorspronkelijk afkomstig uit menselijke tandplak (Culture Collection, Universiteit van Göteborg, Zweden), werden gekweekt op paard bloed agar platen. Overnacht kweken van beide bacteriën werden afzonderlijk gedurende 19 uur in hersen- hart infusie (BHI) medium, 37 gl -1 (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) aangevuld met glucose, 10 gl -1, cysteïne hydrochloride, 0,5 gl -1 (VWR International, Stockholm, Zweden), gistextract, 5 gl -1 (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) en geïnactiveerd paardenserum 1% (Fisher Scientific, Göteborg , Zweden). De 50/50 co-kweek (10 6 ml CFU -1) van S. mitis Kopen en A. oris
, nieuwe aangevuld BHI bouillon werd bereid onmiddellijk voorafgaand aan gebruik. Agarplaten en een nacht kweken werden geïncubeerd in een anaërobe fles bij 37 ° C met CO 2Gen (Oxoid, Malmö, Zweden) om een atmosfeer rijk aan kooldioxide (CO 2, 6%) en zuurstofarm (O 2, 15%). De aanvullende serum en eiwitten wanneer toegevoegd aan het medium na te bootsen de gingivale spleet vloeistof en een eiwit laag op het titanium oppervlak, zoals vlies gevormd op orale harde oppervlakken.
Bacteriële duur vertragingsfase en aanvangshechting
lag duur fase (LPD) van S. mitis
en A. oris,
in mono en co-cultuur, werd gemeten. Bacteriën werden gekweekt in BHI bouillon aangevuld, pH 7,0, bij 37 ° C in gemodificeerde atmosfeer (CO 2, 6%; O 2 15%) zoals hierboven beschreven. Zeven monsters werden met tussenpozen gedurende een periode van 4 uur incubatie ingetrokken. Monsters werden adequaat verdund en uitgespreid op agar platen voor kolonievormende eenheid (CFU) tellen, na incubatie bij 37 ° C in een anaerobe pot voor twee dagen, zoals hierboven beschreven. De LPD werd bepaald door het aanbrengen van het model van Baranyi en Roberts [27] om de groeicurven met behulp van de freeware MicroFit 1.0 (Institute of Food Research, Norwich, UK). Ondernemingen De initiële hechting van S. mitis Kopen en A . oris,
van mono- en co-kweek, na 2,0 uur incubatie bij pH 7,0 in gemodificeerde atmosfeer (CO 2, 6%; O 2 15%) werd gemeten. -Ethanol gesteriliseerd titanium schijven met machinaal en geanodiseerd oppervlak werden in een 12-puts microtiterplaat geplaatst en geïncubeerd in 2,0 ml aangevuld BHI-bouillon (pH 7) geïnoculeerd met de twee bacteriën tot een concentratie van 10 6 CFU ml -1 van elke bacterie, in één en in co-kweek. Incubatie werd uitgevoerd op een rondschudapparaat (80 omwentelingen per minuut, tpm) bij 37 ° C. De metingen werden tweemaal herhaald.
Incubatieomstandigheden voor bacteriële hechting
gesupplementeerd BHI bouillon met een pH van 5,0, 7,0 of 9,0 werd geënt met S. mitis Kopen en A. oris
tot een concentratie van 10 6 CFU ml -1 van elke bacterie. Machinaal en geanodiseerde titanium schijven werden geplaatst in een 12-well microtiterplaat zoals hierboven beschreven, behandeld met 2,0 ml van het geïnoculeerde BHI bouillon van verschillende pH en geïncubeerd onder aërobe of anaërobe atmosfeer. Incubatie werd uitgevoerd bij 37 ° C op een schudapparaat (80 rpm) gedurende 2,0 uur. De experimenten met alle combinaties van pH, atmosfeer en oppervlak werden tenminste zes maal bij verschillende gelegenheden uitgevoerd. Ondernemingen De waarden van pH (5,0 en 9,0) werden gekozen om de schommelingen in pH van het milieu die zich voordoen in de mond afhankelijk vertegenwoordigen op locatie in de tandplaque, voedselinname en mondgezondheid. De pH van speeksel varieert 6,75-7,25 [28], en pH 7,0 werd daarom gebruikt als referentie. De pH van de BHI-bouillon aangevuld werd (15 minuten bij 121 ° C) ingesteld met HCl of NaOH vóór sterilisatie en geanalyseerd na sterilisatie detecteren of afwijkingen van de voorgeschreven waarde had plaatsgevonden. Bij aërobe opgeslagen gedurende ten minste 24 uur bij 5 ° C de BHI bouillon aangevuld bereikt een verzadiging van opgeloste zuurstof van ongeveer 80%, dat werd gebruikt om de aërobe omgeving van de gingivale rand vertegenwoordigen. Het zuurstofgebrek omgeving in de gingivale spleet en volwassen plaque werd gesimuleerd door spoelen de bouillon met stikstof gedurende twee minuten direct voorafgaand aan gebruik, om de zuurstofverzadiging in de bouillon te verminderen van 80% tot 20%. Incubatie werd uitgevoerd in een gesloten menger zak (VWR International, Stockholm, Zweden) uitgerust met een membraan waardoorheen de lucht werd met een spuit en vervangen door stikstof. Dit werd gedaan om de zuurstofverzadiging in de bouillon te voorkomen stijgen toen de omvang van het experiment. De zuurstofverzadiging van het BHI bouillon werd gemeten bij kamertemperatuur met een zuurstofmeter (Oxi 340i) met een zuurstofgas elektrode (CellOx 325) (beide van WTW, Weilheim, Duitsland) bij drie verschillende gelegenheden, voorafgaand aan het experiment. De zuurstofverzadiging van het BHI bouillon nam af tot 20% na 1 minuut stikstof spoeling en niet verder hoewel gespoeld dalen tot 20 minuten. Dus een tijd van 2 minuten werden voor de experimenten.
Bepalen aan elkaar hechtende bacteriën
Na incubatie werd elke plaat titanium gespoeld in steriel gedestilleerd water gedurende 10 seconden om niet-gehecht bacteriën te verwijderen. De schijf werd vervolgens in een plastic blender zak (VWR International, Stockholm, Zweden) met 42 ml steriel gebufferd peptonwater (0,85% NaCl en 1% pepton) (Difco Laboratories, Becton Dickinson, Stockholm, Zweden) en verwerkt in een Stomacher zoals beschreven door Gagnon en Slawson [29] met 500 slagen per minuut gedurende 60 seconden om de gehechte bacteriën uit de titanium schijf mechanisch verwijderen. Ondernemingen de peptonwater bevattende de losgemaakte bacteriën verdund 1:10, verspreid over agarplaten en geïncubeerd zoals hierboven beschreven CFU tellen. De kolonies gevormd door de twee bacteriën verschillen in kolonie morfologie en met betrekking tot grootte, kleur en vorm waardoor de CFU van de twee afzonderlijk bacteriën te tellen. De totale hoeveelheid bacteriën op de schijven na 2,0 uur incubatie kon worden berekend door het tellen van de CFU op agar en gedeeld door het oppervlak van de schijven blootgesteld aan de bacteriën. De schijf op de bodem van een microtiter putje werd geplaatst, werden slechts kleine aantallen bacteriën te houden aan de onderzijde van de schijf (microscopie analysegegevens niet in verhouding tot de bovenzijde en randen getoond. Op basis daarvan de bacteriën die gehecht aan de ondersteboven geacht de globale vergelijking, en slechts het bovenoppervlak en de zijkant van de schijf niet van invloed zijn bij de berekening van de omgeving. Hoewel de lichtopbrengst is voorgesteld om een 95% groter gebied hebben dan een ideaal vlak oppervlak, [24] werd geacht meer klinisch relevant is voor het gebied berekenen op mm niveau, zonder rekening bij de vergroting van de oppervlakte op urn niveau van de lichtopbrengst rekening door het gestructureerde oppervlak.
microscopietechnieken
titanium schijven werden geïncubeerd met de bacteriële co-kweek zoals hierboven beschreven, gekleurd met 10 gl LEVENDE /DEAD® (1% in steriel gedestilleerd water) (Molecular Probes, Stockholm, Zweden) en in het donker geïncubeerd gedurende 20 minuten. De bacteriële hechting werd geanalyseerd met behulp van confocale laser scanning microscopie (CLSM) met een omgekeerde microscoop (Leica DM IRE2, Leica Microsystems, Manheim, Duitsland) met een glycerol immersie objectief met een vergroting van 63 keer en een numerieke apertuur van 1,3. De fluorochromen met vermelding van levende en dode cellen werden enthousiast door 488 en 594 nm licht, respectievelijk. Het uitgezonden licht werd opgevangen in de golflengte varieert 500-554 en 620-660 nm, de voormalige (groen) dat aangeeft levensvatbare cellen en de tweede (rood) niet-levensvatbare cellen. S. mitis Kopen en A. oris
kan visueel worden gescheiden door het verschil in cel- en kolonie morfologie (cocci en kettingen v.s. staaf en clusters, respectievelijk). Monsters werden bereid en in duplo geanalyseerd op twee verschillende gelegenheden. De resolutie van alle afbeeldingen was 0,12 micrometer per pixel. Ondernemingen De hoeveelheid gehecht bacteriën op de onderste zijde van het titanium schijven na 2,0 uur incubatie werd geanalyseerd door kleuring met de oppervlakken Live /DEAD® zoals hierboven beschreven en ze afbeelden met een fluorescentie microscoop (Axioskop, Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland). De oppervlakken werden afgebeeld na stomaching (1 min) om ervoor te zorgen dat de aangehouden bacteriën naar tevredenheid werden verwijderd. Dit onderzoek werd uitgevoerd op duplicaten van elk oppervlak, één geïncubeerd bij pH 5,0 en de andere bij pH 7,0, bij 37 ° C en gemodificeerde atmosfeer (CO 2, 6%; O 2 15%).
Statistische analyse Electronics test van de gelijkheid van de fout afwijkingen Levene's werd gebruikt om vast te stellen dat de logaritme (grondtal 10) van het aantal bacteriën gehandeld op grond van de bewerkte en geanodiseerde titanium schijven (log CFU mm -2) had een homogene variantie. Aangezien dit bleek het geval, drie-weg variantieanalyse (ANOVA) kan worden uitgevoerd voor statistische analyse van het effect van pH 5,0 en 9,0 ten opzichte van pH 7,0 in combinatie met aërobe of anaërobe atmosfeer op de hechting van S. mitis
en A. oris
in co-cultuur om bewerkte en geanodiseerde titanium oppervlakken. De effecten van de oppervlakte, de pH en de sfeer van het aantal aan elkaar hechtende S. mitis Kopen en A. oris
(log CFU mm -1), in co-kweek werden geanalyseerd. Dunett's t-test werd gebruikt om het effect van pH 5,0 en 9,0 versus pH 7,0 vergelijken. Als de andere factoren (atmosfeer en het oppervlak) had slechts twee niveaus, werd geen post hoc-test nodig. Alle analyse werd uitgevoerd in SPSS Statistics versie 17.0 en het criterium voor statistische significantie werd ingesteld tot a = 0,05 (d.w.z. vergelijking waardoor een p-waarde kleiner dan 0,05 worden beschouwd als statistisch significant). De onderzochte factoren bleken de hechting van S. mitis Kopen en A. oris
anders beïnvloeden. Aangezien de bacteriën werden in co-kweek, niet konden worden
als onafhankelijk van elkaar en zonder statistische analyse van het verschil tussen de beide bacteriën uitgevoerd. Resultaten
duur Bacteriële vertragingsfase en adhesie
aanloopfase van A. oris
bleek 2,4 uur in zowel mono als co-cultuur (gegevens niet getoond) zijn. De LPD van S. mitis
bleek 3,0 uur in monocultuur en 2,8 uur in co-cultuur. Na 3-3,5 uur, samenvallend met de log-fase van S. mitis
werd de lag-fase van A. oris
in co-kweek gevonden te worden verstoord, met een daling van het aantal levensvatbare cellen als resultaat. Aangezien het doel van de studie was de initiële bacteriële hechting en geen groei op het oppervlak of de competitie tussen de beide bacteriën in co-cultuur, een incubatietijd van 2,0 uur werd voor de experimenten onderzoeken. Ondernemingen De hechting van S. mitis Kopen en A. oris,
in co-cultuur gedurende 2,0 uur bij optimale omstandigheden (pH 7,0, 37 ° C, CO 2: 6%, O 2: 15 %) werd gemeten. S. mitis
werd gevonden om zich te houden aan de bewerkte en geanodiseerde titanium oppervlakken in hoeveelheden van 2,3 ± 0,14 en 2,0 ± 0,039 log CFU mm -2, en A. oris
in hoeveelheden van 1,9 ± 0,55 en 1,8 ± 0,26 log CFU mm -2, respectievelijk. Aangezien 2,0 uur incubatie bleek voldoende voor bacteriële hechting zijn, werden de voortdurende experimenten uitgevoerd met dezelfde incubatietijd, zij het op verschillende pH en atmosfeer.
Gevolgen van omgevingsfactoren op de bacteriële hechting
De zure pH van 5,0 bleek de hechting van S. mitis
titanium oppervlakken verminderen met 50% in vergelijking met pH 7,0 (zie figuur 2), terwijl pH geen effect op de hechting van A. oris
had. Bovendien is de hechting van zowel bacteriën bleek niet beïnvloed door incubatie bij pH 9,0 te zijn in vergelijking met pH 7,0. Figuur 2 Effecten van omgevingsstress pH (5,0, 7,0 en 9,0) en aerobe of anaerobe omstandigheden op de hechting van S. mitis en A. oris in co-kweek na incubatie 2,0 uur. Statistisch significant minder gehecht S. mitis
gevonden na incubatie bij pH 5,0 dan pH 7,0 en A. oris
na incubatie bij aërobe vergeleken bij anaëroob milieu.
Figuur 2b toont dat de hoeveelheid A. oris
gehecht aan de twee titanium oppervlakken bleken significant groter na incubatie in een anaëroob milieu dan in een aërobe omgeving. De hechting van S. mitis,
daarentegen bleek niet beïnvloed door de aerobe atmosfeer te zijn en bleek in gelijke hoeveelheden na incubatie in zowel anaërobe en aërobe omgevingen. De hoeveelheid S. mitis, vond op de lichtopbrengst is half zo op het bewerkte oppervlak (zie figuur 3), die statistisch significant. A. oris
bleek zich in gelijke hoeveelheden op beide oppervlakken. De exacte cijfers voor de hechting onder invloed van de belangrijkste factoren zijn weergegeven in Tabel 1. Figuur 3 Effect van oppervlakte-eigenschappen op de hechting van S. mitis en A. oris in co-cultuur titanium na 2,0 uur incubatie. Statistisch significant minder gehecht S. mitis
werd gevonden op de lichtopbrengst dan het bewerkte titanium oppervlak.
Tabel 1 Het gemiddelde aantal aan elkaar hechtende bacteriën (log CFU per mm 2 ± SEM) aan de titanium schijf, onder invloed van oppervlak, pH en de sfeer, worden voor elk van S. mitis en A. oris
Surface
pH
sfeer
Bacteriën
Bewerkte Ti
geanodiseerd Ti
5.0
7,0
9,0
Anaërobe
Aerobic
S. mitis
1.55 ± 0.12
0.81 ± 0.07
0,68 ± 0,08
1,39 ± 0,14
1.47 ± 0.13
1,22 ± 0,11
1.14 ± 0.12
p
0.001 *
0.001 *
0,483
A. oris
1.67 ± 0.07
1.81 ± 0.05
1,64 ± 0,08
1.76 ± 0.08
1,84 ± 0,052
1.90 ± 0.05
1.59 ± 0.06
p
0,065
1.106
0.001 *
Discs worden geïncubeerd met de bacteriën in co-cultuur echter CFU voor de twee bacteriën worden gescheiden door hun verschil in kolonie morfologie. Het aantal CFU beïnvloed door oppervlakte, pH en de atmosfeer werd geanalyseerd met ANOVA en de resultaten van de belangrijkste factoren in deze tabel. De p-waarden aangeeft significant verschil zijn gemarkeerd met *.
Bovendien werden belangrijke (en statistisch significant) interactie-effecten gevonden tussen pH en oppervlak. De hechting van S. mitis,
in co-kweek met A. oris
, wordt verminderd op beide oppervlakken na incubatie bij pH 5,0 ten opzichte van incubatie bij pH 7,0. Deze vermindering is statistisch significant voor de hechting aan bewerkte titanium dan geanodiseerd titanium, die een lage hechting van S. mitis
had ook bij pH 7, zoals getoond in figuur 4a. Bovendien werd een borderline effect gevonden voor de interactie tussen atmosfeer en oppervlak zoals getoond in figuur 4b. De reeds lage hoeveelheid S. mitis, vond op de lichtopbrengst werd verder verlaagd door incubatie in aërobe omstandigheden, terwijl er geen verschil in adhesie aan bewerkte titanium afhankelijk atmosfeer werd gevonden. Figuur 4 Interacties tussen oppervlakte, pH en de sfeer van invloed op tha bacteriële hechting. Het eerste cijfer (a) toont het effect van pH en oppervlakte-eigenschappen op de hechting van S. mitis
in co-kweek met A. oris. Ondernemingen De hechting van S. mitis
minder op beide oppervlakken na incubatie bij pH 5,0 dan 7,0 vermindering is echter significant groter bij de hechting aan bewerkte titanium dan geanodiseerd titanium. Figuur (b) illustreert het effect van oppervlakte-eigenschappen en aërobe of anaërobe omgeving op de hechting van S. mitis
in co-kweek met A. oris
. De hechting aan de lichtopbrengst bleek verminderd met aërobe incubatie terwijl het omgekeerde gevonden voor de naleving van bewerkte titanium dit verschil is echter niet statistisch significant.
Microscopie analyse
Uit het visueel onderzoek van de bodem- kant van het titanium schijven na incubatie 2,0 uur, was het duidelijk dat sommige bacteriën gehecht aan deze kant. Maar deze hoeveelheid was klein in vergelijking met die op de bovenzijde, die de uitsluiting van de onderste zijde van de analyse uit. Hetzelfde resultaat met een geringe aantal resterende bacteriën, werd gevonden bij de analyse van de bovenzijde van de schijven na stomaching (gegevens niet getoond). Deze resultaten bevestigen dat 1 minuut stomaching volstaat om gehecht cellen van het geanodiseerd oppervlak te verwijderen en het bewerkte. Bovendien is het aantal resterende bacteriën op de oppervlakken na stomaching was zeer laag in vergelijking met het aantal verwijderde bacteriën en was daarom geacht niet invloed op de statistische analyse hebben.
CLSM werd uitgevoerd om meer informatie over het verkrijgen bacteriële hechting aan de oppervlakken en de levensvatbaarheid van bijgevoegde bacteriën. A. oris
werd vaak gevonden als enkele cellen of in kleine clusters, die vastzit aan de groeven gevormd door de bewerking van de bewerkte oppervlakte; en om de structuur van het geanodiseerd oppervlak, zoals te zien in figuur 5. S. mitis
bleek ook houden aan de groeven van het bewerkte oppervlak titaan (figuur 6a), terwijl de structuur van de lichtopbrengst leek de hechting belemmeren van deze bacterie, omdat de ketens werden vaak deels los van het oppervlak (figuur 6b). De oppervlakken naar links in figuur 5 worden bewerkt titanium terwijl de juiste oppervlakken geanodiseerd titanium. Bovendien levende cellen gevisualiseerd in groen en dode cellen worden gezien in rood. Oppervlakken A-C werden in anaerobe atmosfeer, oppervlakte d in aerobe atmosfeer. Oppervlakken c-d werden bij pH 5. In overeenstemming met de hierboven beschreven resultaten, grotere hoeveelheden van de lange ketens gevormd door S. mitis
werden gevonden op het bewerkte oppervlak dan op het geanodiseerd oppervlak, zoals getoond in figuur 5a-b. Gelijke hoeveelheden van beide bacteriën werden gevonden op het bewerkte oppervlak na anaërobe incubatie bij pH 7 (Figuur 5a), terwijl de hechting van S. mitis
op beide oppervlakken verlaagd door incubatie bij pH 5 ongeacht atmosfeer (figuur 5c-d ). Een hoge levensvatbaarheid van zowel bacteriën werd waargenomen na incubatie bij pH 7,0, met slechts weinig niet-levensvatbare cellen in de clusters en kettingen. De mate van niet-levensvatbare cellen van S. mitis
was echter groter na incubatie bij pH 5,0 (data niet getoond) en deze werd gevonden A. oris
na incubatie bij aërobe omgeving (figuur 5d) . Figuur 5 Confocale laser scanning microscopie afbeeldingen machinaal titaan (a, c) en geanodiseerde titanium (b, d) oppervlakken geïncubeerd met een co-kweek van A. oris en S. mitis. De bacteriën zijn gelabeld met live /DEAD® (Molecular Probes) dus groene kleur geeft aan levende cellen en rode kleur geeft dode cellen. Oppervlakken A-C werden gedurende anaerobe en aerobe d. Beide bacteriën werden in gelijke hoeveelheden op het bewerkte oppervlak na titanium anaërobe incubatie bij pH 7 (a), terwijl veelal A. oris
te vinden op de lichtopbrengst na incubatie bij dezelfde condities (b). De hechting van S. mitis
op beide oppervlakken verder teruggebracht na incubatie bij pH 5 ongeacht atmosfeer (c, d). Het aantal niet-levensvatbare cellen (rood) A.oris
bleek groter is na aerobe incubatie dan anaëroob (d) zijn.
Figuur 6 Confocale laser scanning microscopie afbeeldingen A. oris (kleine stippen en clusters, aangegeven met witte pijlen) en S. mitis (ketens) gehecht aan machinaal (a) en geanodiseerd (b) titanium oppervlakken na aërobe incubatie bij pH 7. De bacteriën worden gelabeld met Live /DEAD® (Molecular Probes) levende visualiseren cellen in het groen en dode cellen in te lezen. Alle auteurs hebben gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
