Abstract achtergrond
Tandvlees overgroei (GO) is een gemeenschappelijk bijwerking van het chronisch gebruik van cyclosporine (CsA), een immunosuppressivum schaal gebruikt om afstoting bij transplantatie patiënten. Recente studies hebben hoge niveaus van specifieke cytokinen in overgroei gingivale weefsel, met name TGF-beta, suggereert dat deze groeifactor een rol in de accumulatie van extracellulaire matrixmaterialen speelt gerapporteerd. De effectiviteit van azithromycine, een macrolide antibioticum, in de regressie van deze ongewenste bijwerking is ook aangetoond.
Werkwijzen
In deze studie hebben we een experimenteel model voor het beoordelen van de therapeutische werking van roxitromycine in GO en de uitdrukking van transformerende groeifactor beta (TGF-beta2) door middel van immunohistochemie. We gebruikten vier groepen ratten in totaal 32 personen. GO werd geïnduceerd gedurende vijf weken en behandeling met geneesmiddelen werd gegeven op de 6e week als volgt: groep 1 kreeg een zoutoplossing; groep 2 kregen CsA en werd behandeld met zoutoplossing op de 6e week; groep 3 ontving CsA en, op de 6e week, ampicilline; en Groep 4 kreeg CsA gedurende 5 weken, op de 6e week, werd behandeld met roxitromycine.
Resultaten
De resultaten toonden aan dat roxitromycine behandeling was effectief bij het beperken van cyclosporine geïnduceerde GO bij ratten. Zowel epitheel en bindweefsel toonde een afname in dikte en een significante vermindering van TGF-beta2 expressie met een lager aantal fibroblasten, vermindering van fibrotische gebieden en afname van inflammatoire infiltraat.
Conclusie Ondernemingen De onderhavige gegevens suggereren dat de down-regulatie van TGF-beta2 expressie kan een belangrijk werkingsmechanisme waardoor roxitromycine remt gaan
Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi:.. 10 1186 /1472-6831-9 -33) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers. achtergrond
tandvlees overgroei (GO) is een veel voorkomende bijwerking van bepaalde geneesmiddelen, zoals fenytoïne, calciumkanaalblokkers en cyclosporine [1, 2].
Cyclosporine (CsA) wordt veel gebruikt om orgaantransplantatie afstoting te voorkomen en te behandelen verschillende immunodiseases [2]. Het onderdrukt selectief helper T-celfunctie moduleert en het netwerk van inflammatoire cytokines. Echter CsA wordt geassocieerd met verschillende bijwerkingen, zoals nefrotoxiciteit, hepatotoxiciteit, hirsutisme en gingivale overgroei (GO) [1, 3, 4]. De gemiddelde prevalentie van dentate transplantatie patiënten die cyclosporine geïnduceerde GO ontwikkelen, is ongeveer 30%, met een variatie tussen de 10 en 85% [5-9]. Wanneer geassocieerd met andere geneesmiddelen, zoals calciumkanaalblokker antihypertensiva, deze prevalentie toeneemt, evenals de ernst van de complicaties, en daarmee het risico [10-13].
Fibrosis, een van de belangrijkste bevinding in GO is het resultaat van een verscheidenheid van biochemische signalen van vele celtypen waaronder ontstekingscellen en fibroblasten, die fibroblast proliferatie en extracellulaire matrix productie [14] stimuleren. De transformerende groeifactor beta (TGF-beta) is een multifunctionele familie van cytokinen die in dit traject en er zijn drie zoogdier isovormen van TGF-beta (TGF-beta1, TGF-beta2 en TGF-beta3), die structureel vergelijkbaar [15 zijn ]. Verhoogde TGF-beta1 niveaus zijn betrokken bij door cyclosporine geïnduceerde renale fibrose [16]. Het merendeel van de studies pleiten voor TGF-beta1 in de CsA-geïnduceerde tandvlees overgroei. Maar een paar aantal studies onderzochten de expressie van TGF-beta2 deze pathologische toestand [15, 17]. TGF-beta2 is als een immunosuppressief cytokine gemoduleerd door cyclosporine dat een centrale rol speelt bij de vorming van fibrose en ontstekingsreactie [18-20]. Recent werd aangetoond dat roxitromycine heeft een remmend effect op de productie van TGF-βbeta door humane mesangiale cellen, en kunnen doeltreffend zijn bij de behandeling van glomerulosclerose [21]. Daarom is deze macrolide antibioticum met gelijke kenmerken van azitromycine is bekend ontstekingsremmende, immunomodulerende en weefsel herstellende effecten naast de bacteriostatische activiteit kan een therapeutisch alternatief voor de behandeling van gingivale begroeiing zijn. Onlangs hebben we een studie met interessante resultaten renale getransplanteerde patiënten waarbij de gingivale begroeiing werd verminderd na behandeling roxitromycine [22]. In het onderhavige onderzoek onderzochten we het effect van roxitromycine op GO in ratten behandeld met cyclosporine. Onze bevindingen wijzen erop dat roxitromycine vermindert GO en down-reguleert TGF-beta2 expressie in tandvlees weefsels.
Methods
Tweeëndertig 6 weken oude mannelijke Wistar ratten (Rattus novergicus albinun
), met een gewicht van 100 tot 150 g. werden willekeurig geselecteerd en gelijk verdeeld in vier groepen van acht dieren elk. De controle ratten (groep 1) werden dagelijks subcutaan geïnjecteerd met zoutoplossing. De experimentele ratten (groep 2) werden behandeld met CsA subcutaan in een dagelijkse dosis van 10 mg /kg gedurende zes weken en aan het begin van de 6e week, werden zij subcutaan geïnjecteerd met zoutoplossing. Groep 3 was vergelijkbaar met groep 2, maar in de laatste week werd behandeld met 50 mg /kg ampicilline (een antibioticum schaal gebruikt in periodontale infecties) via maag voeden. In groep 4 ontvingen de dieren dagelijks CsA gedurende 6 weken en de laatste week ze werden behandeld met 40 mg /kg roxitromycine door maag voeden. De ratten werden wekelijks gewogen en de dosering werd aangepast. . Dieet en drinkwater kregen ad libitum
tijdens het experiment
Macroscopie analyse
Aan het eind van de experimentele periode werden alle dieren gedood door middel van een overdosis van verdoving (Kensol
® - 10 mg /kg en Vetanarcol ® - 90 mg /kg). Om tandvlees veranderingen in de tijd te onderzoeken, werden stenen modellen gemaakt van siliconen indrukken van de bovenfront regio. Hoe hoger buccale-linguale breedte en mesio distale breedte van het voorste segment van de bovenkaak werden gemeten met een digitale schuifmaat.
Histopathologie en histomorfometrie tandvlees Leer Alle monsters die waren gefixeerd in 10% gebufferde formaline (pH 7) voor tenminste 24 uur. Na fixatie werden de monsters gedehydrateerd in geleidelijk toenemende concentraties ethanol (70% tot 100%), geklaard in xyleen, geweekt en ingebed in paraffine volgens routinematige histologische methoden. Ondernemingen De in paraffine ingebedde fragmenten werden geknipt met een " 820 "Spence microtoom en 4 pm dikke secties werden verkregen. Alle tandvlees monsters werden in paraffine met dezelfde oriëntatie. De secties altijd geanalyseerd liet het epitheel, het bindweefsel en spierweefsel. De histometry metingen werden uitgevoerd sinds de ephitelium totdat het spierweefsel. De histologische objectglaasjes werden in een incubator gehouden om te drogen, en vervolgens werden de coupes gekleurd met hematoxyline en eosine voor histologische analyse. Histomorfometrie werd uitgevoerd met behulp van beelden vastgelegd en geëvalueerd door een geautomatiseerde Axion Vision (Zeiss, Berlijn, Duitsland) image capture systeem. Beelden werden opgevangen uit vier willekeurig gekozen microscopische velden voor elke histologische dia met de digitale camera (400 x en 100 x vergroting) van een Axiostar Plus microscoop (Zeiss, Berlijn, Duitsland) en het aantal TGF-betapositive cellen geteld.
De beelden werden opgeslagen en een telling van ontstekingscellen en van fibroblast-achtige cellen beschikbaar. Lineaire metingen werden gedaan om de hogere diameter van epitheliale en tandvlees bindweefsel te verkrijgen, met behulp van digitale markering.
Immunohistochemie
Paraffinecoupes (4 urn dik) van formaline gefixeerde weefsels werden op verschillende diepten van elk weefsel blok verkregen. De aanwezigheid van TGF-beta2 eiwit in de gingivale monsters werd onderzocht in paraffine secties met de avidine-biotine-peroxidase complex procedure (ABC) met een extra stap voor antigen herstel met een Retrieval Solution (Dakopatts, Kopenhagen, Denemarken). In het kort werden de coupes geïncubeerd met polyklonale konijn anti-TGF-beta2-antilichaam verdund 1/20 en gedurende één uur bij kamertemperatuur (Santa Cruz, Santa Cruz, USA) gevolgd door een geit anti-konijn IgG gebiotinyleerd antilichaam (Dakopatts, Kopenhagen, Denemarken). Controles voor de ABC procedure werd uitgevoerd door het vervangen van anti-TGF-beta2 antilichaam met normaal konijnenserum, of door het weglaten van anti-TGF-beta2-antilichaam. De coupes werden geanalyseerd via lichtmicroscopie en microfoto's werden genomen met een Axiostar Zeiss microscoop (Zeiss, Duitsland). Het aantal van de TGF-beta2 immunoreactieve cellen microscopisch veld (400 x vergroting) geteld in bindweefsel.
Statistische analyse De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde en standaardafwijking afwijking. ANOVA werd gebruikt voor de statistische evaluatie en de Bonferroni post-hoc test werd gebruikt na ANOVA. De gingivale mucosa breedte, het aantal ontstekingscellen, alle fibroblast-achtige cellen en TGF-beta2 immuunreactieve cellen werden vergeleken tussen groepen met de Student's t-test
. De betekenis niveau zijn aangenomen was p
& lt; 0.05.
Het manuscript werd uitgevoerd met de goedkeuring van de ethische commissie in experimenteel onderzoek bij dieren door de Federale Universiteit van Juiz de Fora /Brazil (protocol n ° 039/2005).
Resultaten
Alle cyclosporine behandelde ratten gepresenteerd GO dat duidelijk was in alle tandvlees lokalisaties. Graphic 1 toont macroscopische metingen van de buccale-lingual breedte en mesio-distale breedte (p & lt; 0,05). De macroscopische analyse toonde een significante vermindering van de buccale-linguale breedte en mesio distale breedte in de roxithromycine behandelde ratten (groep 4) in vergelijking met de groep 2 en groep 3 (grafiek 1) (p & lt; 0,05). De histopathologische analyse toonde dat GO was een gevolg van de uitbreiding van epitheliale en bindweefsels (figuren 1A, 1B, 1C, 1D). Een matige acanthosis werd waargenomen bij dieren uit groepen 2, 3 en 4. Geen statistisch verschil waargenomen vergeleken de dikte van de gedetecteerde gingiva verkregen uit de positieve controle groepen met behandelde groepen epitheel. Een ernstige hyperplasie van collageenvezels werden waargenomen bij de gingivale verkregen uit groepen 2 en 3. De microscopisch onderzoek toonde een vermindering van collageenvezels in gingivale monsters van de behandelde ratten in vergelijking met gingival monsters van de controleratten. Geen fibrotische gebieden waargenomen in gingivale monsters uit groep 1 (negatieve controlegroep). Uitgebreide fibrose vaak voorkomt in gingivale monsters van groepen 2 en 3, maar een paar aantal fibrotische gebieden waargenomen bij gingivale weefsel van roxitromycine behandelde ratten (figuur 2). Diameter metingen van het epitheel en bindweefsel werden verkregen (figuur 3). De waargenomen in roxitromycine behandelde ratten (groep 4) metingen waren statistisch lager dan die waargenomen in de GO positieve controlegroep (groep 2 en groep 3). De histomorfometrische analyse toonde ook aan dat de dieren behandeld met roxitromycine gepresenteerd een lager aantal fibroblasten per microscopisch veld (figuur 4). De identificatie van fibroblasten, op basis van morfologische criteria, werd door twee verschillende onderzoekers. Ten slotte is een lager aantal inflammatoire cellen waargenomen in gingivale verkregen uit roxitromycine behandelde groep vergeleken met de groep 2 en groep 3 (figuur 5). Cytoplasmatische kleuring voor TGF-beta2 werd gedetecteerd in de meeste celtypen van het bindweefsel. TGF-beta2 is binnen bindweefsel uitgedrukt door ontstekingscellen, fibroblasten en endotheelcellen (Figuur 6). De meeste van de fibroblasten en endotheliale cellen werden TGF-beta2 positieve en toonde een variabel kleurpatroon, gewoonlijk zwak of donker positief (figuur 6). Immunohistochemische analyse toonde een lager aantal TGF-beta2 positieve cellen (figuur 7) - morfologisch erkend als fibroblasten, endotheelcellen en inflammatoire cellen in het bindweefsel monsters van roxitromycine behandelde ratten in vergelijking met GO positieve controle ratten (groep 2 en groep 3 ) (figuur 7). Geen significante verschillen werden waargenomen in vergelijking met het aantal TGF-beta2 positieve cellen in gingivale verkregen uit groep 1 en groep 4 (figuur 7). Figuur 1 Macroscopische metingen van buccale-lingual en mesio-distale bovenkaak regio's. Resultaten uitgedrukt als gemiddelde en het significantieniveau voor statistische analyse was p & lt; 0,05. G1 (n = 8 dieren) - negatieve controle groep - de toediening van een zoutoplossing. G2 (n = 8 dieren) - positieve controlegroep - administratie van CsA + zoutoplossing. G3 (n = 8 dieren) - positieve controle groeps- - administratie van CsA + AMP. G4 (n = 8 dieren) - behandelde groep - administratie van CsA + ROX
Figuur 2 Vertegenwoordiger microscopische velden.. A: Normaal bindweefsel in groep 1 (negatieve controle); B-C: uitgebreide fibrose in groepen 2 en 3 (positieve controle); D: Er zijn maar weinig gebieden met fibrose in groep 4 (behandelde groep). Originele magnificance 400 ×.
Figuur 3 Metingen van het tandvlees slijmvlies (epitheel en lamina propria). Resultaten uitgedrukt als gemiddelde (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 dieren) - negatieve controle groep - de toediening van een zoutoplossing. G2 (n = 8 dieren) - positieve controlegroep - administratie van CsA + zoutoplossing. G3 (n = 8 dieren) - positieve controle groeps- - administratie van CsA + AMP. G4 (n = 8 dieren) - behandelde groep -. Toediening van CsA + ROX
Figuur 4 Aantallen fibroblasten per microscopische velden. Vijf microscopische velden met 400 × vergroting werden bestudeerd per histologische dia's. Resultaten uitgedrukt als gemiddelde (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 dieren) - negatieve controle groep - de toediening van een zoutoplossing. G2 (n = 8 dieren) - positieve controlegroep - administratie van CsA + zoutoplossing. G3 (n = 8 dieren) - positieve controle groeps- - administratie van CsA + AMP. G4 (n = 8 dieren) - behandelde groep - administratie van CsA + ROX
Figuur 5 Aantal ontstekingscellen per microscopische velden.. Vijf microscopische velden met 400 × vergroting werden bestudeerd per histologische dia's. Resultaten uitgedrukt als gemiddelde ± SD (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 dieren) - negatieve controle groep - de toediening van een zoutoplossing. G2 (n = 8 dieren) - positieve controlegroep - administratie van CsA + zoutoplossing. G3 (n = 8 dieren) - positieve controle groeps- - administratie van CsA + AMP. G4 (n = 8 dieren) - behandelde groep - administratie van CsA + ROX
Figuur 6 Representatieve monsters aangegeven verhoogde expressie van TGF-beta2 in de cellen van het bindweefsel (groepen 2 en 3); C: Licht TGF-beta2 gekleurde cellen in groep 4. Rode pijlen - negatief kleurende cellen. Blauwe pijlen: positieve kleuring cellen. Originele magnificance 400 ×.
Figuur 7 Aantal positieve kleuring cellen van TGF-beta2 in bindweefsel per microscopisch veld. Vijf microscopische velden met 400 × vergroting werden bestudeerd per histologische dia's. Resultaten uitgedrukt als gemiddelde ± SD gemiddelde (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 dieren) - negatieve controle groep - de toediening van een zoutoplossing. G2 (n = 8 dieren) - positieve controlegroep - administratie van CsA + zoutoplossing. G3 (n = 8 dieren) - positieve controle groeps- - administratie van CsA + AMP. G4 (n = 8 dieren) - behandelde groep -. Toediening van CsA + ROX
Discussion
Cyclosporine (CSA) is een hydrofoob neutraal cyclische polypeptide bestaat uit elf aminozuren en gemaakt van de schimmel Tolypocladium inflatuns GAMS
. Het werkt specifiek in het onderdrukken van de immuunrespons gemedieerd door T-cellen. Het gaat door biotransformatie in de lever, waardoor 14 stofwisselingsproducten, waarvan 90% wordt via de feces en 10% uitgescheiden door de nieren [23].
Tandvlees overgroei is een van de bijwerkingen van het chronisch gebruik van cyclosporine (CsA), die gebruikt wordt om afstoting van getransplanteerde organen te voorkomen en verschillende auto-immuunziekten zoals diabetes mellitus, ziekte van Behcet, psoriasis, multiple sclerose, erosieve lichen planus, systemische lupus erythematosus, bulleuze pemfigoïde, reumatoïde artritis, myasthenia gravis behandel , uveitis, en diverse glomerulopathieën [3, 24, 25].
verschillende studies hebben aangetoond dat hoge niveaus van specifieke cytokinen overgroei tandvleesweefsel, vooral TGF-beta, een multifunctioneel ontstekingsmediatoren, wat suggereert dat deze groeifactor een rol speelt in de accumulatie van extracellulaire matrix [14, 25, 26], waaronder collagene eiwitten [27, 28]. De TGF-beta isovormen kunnen worden uitgedrukt door de meeste cellen, waaronder gingivale ontstekingscellen, endotheelcellen en fibroblasten [17]. Verhoogde tandvlees TGF-beta 1 en TGF-beta2 zijn voorgesteld door immunohistochemische studie over fenytoïne en nifedipine geïnduceerde GO [29]. en onze gegevens blijkt verhoogde niveaus van TGF-beta2 uitdrukking op-cyclosporine geïnduceerde GO.
GO behandeling omvat het verwijderen van bacteriële tandplak, behoud van een adequate mondhygiëne, en bevat ook invasieve procedures, zoals gingivectomie. Behandeling voor deze complicatie tot voor kort slechts chirurgisch. Tegenwoordig hebben verscheidene studies uitgevoerd om het effect van antibiotica op de regressie van tandvlees begroeiing bepalen. In 1995, Wahlstrom, Zamora en Teichmann toevallig gebruikt azitromycine - een semi-synthetisch antibioticum, afgeleid van het macrolide erytromycine - respiratoire infecties te behandelen in twee niertransplantatiepatiënten die cyclosporine geïnduceerde GO gehad. Zij merkten tandvlees reductie na het gebruik ervan. De dagelijkse behandeling met 500 mg vijf dagen is eenvoudig, goedkoop, conservatief snel effectief en vermijdt gingivale chirurgie. Het fungeert voornamelijk tegen Gram-positieve en negatieve bacteriën, is snelle orale absorptie, niet serumspiegels van cyclosporine of niveaus van creatinine veranderen. Azithromycine wordt goed verdragen en bijbehorende efficiënte mondhygiëne programma leiden tot een vermindering tandvlees overgroei [28], maar bijwerkingen, zoals diarree, buikpijn, misselijkheid en braken [28-33] produceren.
Recentelijk gebruikten we roxitromycine in vier renale getransplanteerde patiënten en de resultaten suggereren kan dat roxitromycine een belangrijk therapeutisch instrument gebruikt om cyclosporine geïnduceerde GO [22] te verminderen. Yamabe e.a.. (2006) suggereerde dat het gebruik van roxitromycine heeft een remmend effect op de productie van TGF-beta van menselijke mesangiale cellen, en kunnen efficiënt bij de behandeling van glomerulosclerose zijn. De mechanismen die remde TGF-bèta productie roxitromycine niet duidelijk, maar in deze studie het geneesmiddel niet de activering van tyrosine kinase en MAP kinase remmen door trombine. Roxitromycine onderdrukte de trombine-geïnduceerde translocatie van NF-kB p65 eiwit in de kern. Gesuggereerd wordt dat de activatie van NF-kB reguleert TGF-beta productie, waardoor ROX remde TGF-bèta productie via de remming van NF-kB.
Conclusie In deze studie, de resultaten toonden aan dat behandeling was roxitromycine doeltreffend cyclosporine geïnduceerde GO bij ratten te verminderen. Zowel epitheel- en bindweefsels een daling in dikte roxitromycine behandelde ratten vergeleken met dieren van de controlegroepen. Bovendien is de aanzienlijke vermindering van TGF-beta2 expressie in roxitromycine behandelde ratten was geassocieerd met een lager aantal fibroblasten, met reductie van fibrotische gebieden en afname van inflammatoire infiltraat. Bij elkaar genomen, onze gegevens suggereren dat de down-regulatie van TGF-beta2 expressie een belangrijk werkingsmechanisme waardoor roxitromycine remt GO kan zijn
Afkortingen
AMP.
ampicilline
CsA:
ciclosporine
GO:
tandvlees overgroei
MAP quinase:
quinase eiwit actived door mithogen
NF-kB:
nuclear factor kappa B
ROX:
roxitromycine
TGF-beta 1:
transformerende groeifactor beta 1
TGF-beta2:
transformerende groeifactor beta2
UFJF:
Federale Universiteit van Juiz de Fora
verklaringen
Dankwoord
Financiële steun: FAPEMIG - Rede Mineira de Toxicologia; Rede Mineira de Bioterismo
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan de links naar de auteurs oorspronkelijke ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12903_2008_142_MOESM2_ESM.jpeg Authors' 12903_2008_142_MOESM1_ESM.jpeg Auteurs originele bestand voor figuur 2 12903_2008_142_MOESM3_ESM.jpeg Authors 'originele bestand voor figuur 3 12903_2008_142_MOESM4_ESM.jpeg Authors' oorspronkelijke bestand voor originele bestand figuur 4 12903_2008_142_MOESM5_ESM.jpeg Authors 'voor figuur 5 'originele bestand voor figuur 6 12903_2008_142_MOESM7_ESM.jpeg Authors' 12903_2008_142_MOESM6_ESM.jpeg auteurs originele bestand voor figuur 7 Competing belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.
auteurs bijdragen
SC betrokken zijn geweest bij het opstellen het manuscript, verwerven en analyseren van gegevens en verricht de immunohistochemie. MB deelgenomen aan de opzet van het onderzoek en coördinatie zoals de statistische analyse uitgevoerd. BV analyse en interpretatie van de gegevens. IM hielp in de experimentele fase, het induceren van tandvlees begroeiing. LV voerde de immunohistochemie. FA heeft deelgenomen aan de opzet van het onderzoek en de coördinatie en de definitieve goedkeuring van de uitvoering hebben gegeven om te worden gepubliceerd. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd de definitieve versie van het manuscript.
