Abstracte achtergrond
regeneratie van parodontale weefsels is een belangrijk doel van parodontale behandeling. Dentale pulp stamcellen (DPSC's) tonen mesenchymale cel eigenschappen met het potentieel voor tandheelkundige tissue engineering. Glazuurmatrixeiwitten derivaat (EMD) en van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) zijn voorbeelden van materialen die als signaalmoleculen periodontale regeneratie verbeteren. Mineral trioxide aggregaat (MTA) is bewezen biocompatibel te zijn en lijkt een osteoconductieve eigenschappen. Het doel van deze studie was om de effecten van EMD, MTA en PDGF op DPSC osteogene differentiatie evalueren.
Methods
menselijke DPSC's werden gekweekt in medium dat EMD, MTA, of PDGF. Controle groepen werden ook vastgesteld. Evaluatie van de bereikte osteogenesis werd uitgevoerd door computeranalyse van alkalische fosfatase (ALP) uitgevoerd -stained kamertjes, en spectrofotometrische analyse van alizarinerood-S bevlekte gemineraliseerde knobbeltjes.
Resultaten
EMD aanzienlijk toegenomen de bedragen van de ALP expressie en mineralisatie in vergelijking met alle andere groepen (P Restaurant & lt; 0,05). Ondertussen MTA leverde variabele resultaten met een lichte verhoging van bepaalde parameters differentiatie en PDGF geen significante verhoging van de bereikte differentiatie.
Conclusies
EMD vertoonde een zeer sterke osteogene vermogen vergeleken met PDGF en MTA en deze resultaten geven steun voor het gebruik ervan in parodontale regeneratie.
Sleutelwoorden
Dental pulp stamcellen Osteogenesis MTA EMD PDG Achtergrond
Het belangrijkste doel van parodontale therapie is om-tand ondersteunende structuren vernietigd door parodontitis regenereren [1]. Periodontale weefselmanipulatie brengt complexe interacties tussen verschillende cellen en signaalmoleculen, alsmede biologische platforms [2].
In een poging om de oorspronkelijke ontwikkelingsgebeurtenissen bootsen, het geïntegreerd gebruik van precursor celpopulaties met specifieke biologische stimulantia onderzocht [ ,,,0],3, 4]. Stamcellen vertegenwoordigen primitieve niet-gespecialiseerde cellen met brede mogelijkheden voor differentiatie en weefselregeneratie. Tot op heden zijn mesenchymale stamcellen succesvol geïsoleerd uit verschillende lichaamsorganen [5], waaronder meerdere weefsels met tandheelkundige oorsprong [6-9]. Dergelijke dentale weefsel afgeleide stamcellen bleken krachtige vermogen tot differentiatie in dental weefsel vormende cellen [6, 10, 11] behouden. Gronthos en collega's met succes geïsoleerd humane dentale pulp stamcellen (DPSC's), en bewees zowel hun multipotentie en zelfvernieuwing vermogen [11, 12]. Verdere studies bevestigden hun bevindingen [13, 14]. Dit multipotent, naast hun relatieve toegankelijkheid gemaakt DPSC een aantrekkelijke bron van cellen in regeneratieve geneeskunde [15-18]. In feite hebben verscheidene artikelen hun superioriteit in verschillende aspecten gebleken, zoals osteogene differentiatie [19, 20], die het gebruik ervan voor het regenereren van craniofaciale defecten ondersteund [21, 22], evenals alveolaire botdefecten [23, 24]. Daarnaast hebben de soortgelijke embryonale oorsprong van tandheelkundige pulp cellen en parodontale cellen [25] en hun aanwezigheid in beschermende lagen van de tand structuur gebruik ervan voor parodontale weefselregeneratie aangemoedigd [26, 27].
Studies op tissue engineering hebben biologische mediators gebruikt selectief verbeteren van de rekrutering van cellulaire populatie in parodontale wonden [28]. Glazuurmatrixeiwitten derivaat (EMD) is een eiwit geoogst uit varkens ontwikkelen tanden die is gemeld vorming cement en parodontale regeneratie [29] induceren. Op cellulair niveau werd EMD bewezen regulerende effecten op verschillende celtypen hebben parodontale [28, 30].
Bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) is een zeer krachtig regulerende factor die vrijwel alle wondhelingscomplicaties initieert. De belangrijkste functie van PDGF celreplicatie (mitogenese) van genezing geschikte stamcellen en gedeeltelijk gedifferentieerde osteoprogenitor cellen, die deel uitmaken van het bindweefsel-botgenezing cellulaire samenstelling [31] zijn stimuleren. Aanzienlijke toename in bot en cement vorming gemeld histologisch [32]. Op cellulair niveau, PDGF verhoogde het aantal collageen synthese cellen [33] en gestimuleerd bot sialoproteïne transcriptie [34].
Ander materiaal met het vermogen tot regeneratie induceren trioxide mineraal aggregaat (MTA). MTA is een mengsel van dicalciumsilikaat, tricalciumsilicaat, tricalciumfosfaat aluminaat, gips en tetracalciumfosfaat aluminoferrite [35]. Torabinejad et al. [36] rapporteerde gunstige biologische prestatie van MTA als in direct contact met bot, door de afzetting en de vorming van hydroxyl apatiet op het oppervlak. Het materiaal bleek ook cellulaire type I collageen, osteocalcine, alkalisch fosfatase (ALP), bot sialoproteïne en osteopontine [37] verbeteren. Een systematische review over de histologische reacties van het parodontium om het materiaal tot de conclusie dat MTA bevorderd genezing in de richting van herstel [38]. Ondernemingen De bovenstaande bevindingen suggereren vergelijkbare klinische prestaties voor de drie materialen zonder eerdere pogingen voor directe vergelijkingen. Dienovereenkomstig was het doel van deze studie te onderzoeken en vergelijken van de effecten van EMD, PDGF en MTA op de osteogene differentiatie van DPSC.
Resultaten
Cell isolatie en karakterisering
dentale pulp stamcellen in de primaire culturen begon te verschijnen in 5-14 dagen en werd aan de plaatoppervlakken (fig. 1a). Cellen uit de tweede doorgang met succes gevormd meerdere kolonies, met ongeveer 50 cellen per kolonie (afb. 1b). Flowcytometrie analyses bevestigde positieve uitingen van stromale cel-geassocieerde markers, met een negatieve uitingen van hematopoietische en endotheelcellen markers (fig. 1 g). Cellen die osteogene inductie ondergingen toonde verhoogde ALP kleuring vergeleken met negatieve controle cellen (Fig. 1c, d), terwijl cellen gekweekt in medium adipogene vertoonde verschillende olierood O-lipide positieve korrels (Fig. 1e, f). Fig. 1 Omgekeerde licht microscopische beelden tonen van een tandheelkundige pulp mesenchymale stamcellen op de lagere cultuur, Vergroting 5 ×. b kiemgetal fibroblast (CFU-F) vergroting 5 x, c, d Alkalische fosfatase kleuring voor DPSC's 14 dagen na osteo-inductie (c) versus negatieve controle (d) vergroting 10 × en olie rode O kleuring voor DPSC's 14 dagen na adipogene inductie (e) versus negatieve controle (f), vergroting 40x. g FACS analyse resultaten van een representatieve tandheelkundige pulp cellijn
Material toepassing
ALP kleuring
De monsters toonden verschillende graden van ALP kleuring (fig. 2). Eenzijdige ANOVA toonde significante verschillen tussen de vergeleken groepen (P & lt; 0,0001) (Tabel 1). Fig. 2 Scanoscope foto's voor ALP gekleurd verschillende experimentele groepen DPSC's. De interne beeld vertegenwoordigt de geëvalueerde gebied, waardoor ongeveer 1/4 van het beeld. Original vergroting 1.4 ×. Schaal bar 1 mm. een negatieve controle, b Besturingsketen (OT), c EMD, d MTA, e PDGF
Tabel 1 geeft de alkalische fosfatase analyseresultaten voor alle groepen
Materiaal /Group
Gemiddeld
standaarddeviatie (SD)
post hoc-test Tukey's op significantie tussen groepen
Procent Totaal Positief
Negatieve controle
16.29
4.95
OT *
EMD *
MTA *
PDGF *
OT
72,92
9.24
Negatief control*
EMD*
MTA*
PDGF*
EMD
95.59
4.69
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
64.19
9.95
-ve control*
OT*
EMD*
PDGF*
PDGF
48.80
12.62
Negative control *
OT *
EMD *
MTA *
Gemiddeld optische dichtheid
Negatieve control
0.18
0.01
OT*
EMD*
MTA*
PDGF*
OT
0.26
0.02
Negative control*
EMD*
MTA
PDGF*
EMD
0.35
0.03
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
0.26
0.02
Negative control*
OT
EMD*
PDGF
PDGF
0.24
0.03
Negative control *
OT *
EMD *
MTA
histologische Score
Negatieve control
20.633
7.034
OT*
EMD*
MTA*
PDGF*
OT
132.974
22.944
Negative control*
EMD*
MTA
PDGF*
EMD
221.992
23.818
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
114.340
20.914
Negative control*
OT
EMD*
PDGF*
PDGF
82.330
28.254
Negative control *
OT *
EMD *
MTA *
NBIntergroup vergelijking was statistisch significant met behulp van ANOVA test, P Restaurant & lt; 0,0001
* Geeft statistische significantie met P Restaurant & lt; 0,05
Voor alle parameters onderzocht, EMD was significant hoger dan alle andere groepen (P & lt; 0,05). EMD bleek aanzienlijk hoger percentage totale positieve kleuring gebied, gemiddelde optische dichtheid, en histologische scores (95,6 ± 4,7%, 0,35 ± 0,03, 221,99 ± 23,8) dan MTA (64,19%, 0,26 ± 0,02, 114,34 ± 20,90; P & lt; 0,05) PDGF (48,8% ± 12,62, 0,24 ± 0,02, 82,33 ± 28,3; P & lt 0,05). en referentiecontrolekromme
daarentegen MTA gaf inconsistente resultaten, hoewel de ALP activiteit nam op soortgelijke wijze als de referentiecontrole bij geëvalueerd door de gemiddelde optische dichtheid, het materiaal tot een daling van de andere parameters in vergelijking met de referentie-controle, hoewel deze verlagingen waren niet altijd significant (P Restaurant & gt; 0,05) hotels met betrekking tot PDGF, ALP meningsuiting in het algemeen. openbaarde lagere resultaten in vergelijking met de referentie-controle voor de drie parameters respectievelijk, en deze verlagingen waren constant significant (P & lt; 0,05; tabel 1)
alizarinerood S kleuring
Er waren duidelijke verschillen in de bedragen van mineralisatie onder. de groepen (Fig. 3). Eenzijdige ANOVA toonde deze verschillen significant (P
& lt; 0,0001) (Tabel 2). Fig. 3 Omgekeerd beeld licht microscopisch presenteren alizarinerood S kleuring voor verschillende DPSC's experimentele groepen. Original vergroting 10 ×. Schaal bar 200 pm. een negatieve controle, b Besturingsketen (OT), c EMD, d MTA, e PDGF
Tabel 2 geeft de gemiddelde absorptie tarief voor alizarinerood S-lood kamers van alle groepen
Materiaal /Group
gemiddeld
standaarddeviatie (SD) -test
post hoc Tukey's op significantie tussen groepen
Negatief control
0.079
0.007
OT
EMD*
MTA*
PDGF
OT
0.107
0.016
Negative control
EMD*
MTA
PDGF
EMD
1.197
0.132
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
0.163
0.117
Negative control*
OT
EMD*
PDGF*
PDGF
0.097
0.010
Negative controle
OT
EMD *
MTA *
OT
verwijzing controle voor osteo-inductie , EMD
Emdogain, MTA
Mineral trioxide aggregaat, PDGF
bloedplaatjes afgeleide groeifactor-BB
NBIntergroup vergelijking was statistisch significant met ANOVA test, P Restaurant & lt; 0,0001
* Geeft statistische significantie met P Restaurant & lt; 0.05
De EMD groep had een aanzienlijk toegenomen hoeveelheid gemineraliseerde knobbel vorming in vergelijking met alle andere groepen, het geven van een gemiddelde absorptie van 1,2 ± 0,13 (P Restaurant & lt; 0,05). Ondernemingen De MTA groep aanzienlijk toegenomen hoeveelheid mineralisatie (absorptie: 0,16 ± 0,12)., vergelijking met de negatieve controlegroep (0,08 ± 0,01), en PDGF groep (0,09 ± 0,01)
Hoewel de gemiddelde absorptie van de PDGF-groep (0,09 ± 0,01) bleken enigszins anders dan de andere groepen, deze verschillen waren statistisch niet significant (P Restaurant & gt; 0,05; tabel 2).
Discussie
In deze studie, succesvolle isolatie van tandheelkundige pulp cellen werd bereikt door de toepassing van enzymatische knippen met bepaalde wijzigingen aan het protocol van Gronthos et al. [11]. De verkregen cellen ondergingen een aantal onderzoeken om hun eigenschappen te evalueren. Volgens de International Society for Cellular Therapy [39], de minimale criteria voor het definiëren van multipotente mesenchymale stromale cellen zijn onder meer: (1) de naleving van plastic schaaltjes; (2) multipotente differentiatie potentieel; en (3) specifieke uitdrukkingen stromale oppervlak merkers (CD73, CD90, CD105) met een gebrek aan uitingen van hematopoïetische merkers (CD45, CD34, CD14 en /of CD11b, CD19, CD79a) en HLA-DR marker. De geïsoleerde cellen in deze studie die alle bovengenoemde functies.
Verschillende materiaal concentraties geëvalueerd en de concentraties het beste onderscheid geselecteerd. Deze concentraties waren 200 ug /ml EMD, 5 ng /ml van PDGF en 0,05 mg /ml voor MTA. Dezelfde concentraties werden eerder in andere studies [34, 40, 41]. In deze studie computeranalyse voor ALP activiteit en een semikwantitatieve evaluatie techniek alizarinerood S kleuring werden geselecteerd, omdat deze twee technieken gerapporteerd te zijn dat relatieve gevoeligheid geven, en hebben in eerdere studies toegepast [42, 43].
Voor EMD, de resultaten bleek een aanzienlijke stijging van ALP-expressie en een overvloed aan mineralisatie verbetering na de toepassing ervan. Deze bevindingen zijn in overeenstemming met verscheidene andere studies de effecten van dit materiaal op meerdere cellijnen [40, 44-48]. Duan et al. [44] vonden dat EMD verhoogde de osteogene differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen, zoals bewezen door een toename in RUNX2 mRNA expressie. Kémoun et al. [45, 46] werden de effecten van EMD op folliculaire cellen [45] en periodontale ligament stamcellen [46]. In beide studies werd gevonden dat EMD ALP afgifte en calciumafzetting verbeteren, naast de verhoging van verschillende mineralisatie markers. Een andere studie van Guven et al. [47] vonden dat Emdogain was de meest effectieve materiaal voor het verbeteren van proliferatie en odontogene differentiatie van humane tandkiem stamcellen door de evaluatie van ALP activiteit Von Kossa kleuring en RT-PCR analyses voor dentine sialophosphoprotein (DSPP) en immunokleuring voor collageen type I en DSPP. Een studie van Wang et al. [48] vonden dat Emdogain verbeterde mineralisatie van DPSC's en hun osteogene /odontogene markerexpressie. Studies met tegenstrijdige bevindingen zijn beschikbaar [49, 50]. Er werd gemeld dat EMD geen merkbare invloed op de osteoblastische differentiatie in parodontale ligament cellen [49] of ratten beenmergcellen [50] zou kunnen hebben. Hoewel de exacte regelmechanisme onduidelijk blijft, werden deze effecten verklaard door verschillen in de mate van cellulaire onrijpheid Dit betekent dat het werd gedacht dat cellulaire proliferatie van meer onrijpe cellen, maar de differentiatie van cellen in latere ontwikkelingsstadia [51] verbeteren.
In de huidige studie, MTA gaf inconsistente bevindingen. Het materiaal bleek mineralisering verbetering ten opzichte van de referentiecontrole, verlaging van ALP bepaalde parameters (totaal percentage positieve kleuring stippellijn histologische score), en onderhoud van andere parameters (gemiddelde optische dichtheid). Hoewel Yasuda et al. [52] en Lee et al. [53] gemeld dat MTA ALP verhoogde productie en /of gemineraliseerde knobbeltjes vorming vergeleken met controle cellen, zowel Koh et al. [54] en Nakayama et al. [55] gemeld soortgelijke ALP expressie tussen MTA-behandelde cellen en de negatieve controle cellen. Deze inconsistenties suggereren dat verdere evaluatie van de verschillende parameters geleiden en die de werking van dit materiaal wordt gegarandeerd.
Wat PDGF in dit onderzoek werd waargenomen dat expressie ALP algemeen lager resultaten lieten zien in vergelijking met de negatieve controlegroep alsmede alle andere materiaalgroepen, en de verschillen waren altijd significant. Ongeacht het materiaal optreden in proliferatieve uitbreiding, PDGF-BB bleek geen extra voordeel voor osteogene differentiatie, volgens de parameters geëvalueerd in deze studie. Verscheidene andere auteurs vergelijkbare resultaten waargenomen [33, 56]. In feite, PDGF verbeterde bot collageen degradatie [33], en verstoorde of geremd botmatrix vorming [56]. Nakashima et al. [57] vonden dat PDGF toegenomen DNA synthese, maar waardoor 40-65% remming van ALP activiteit. Tanaka en Liang [58] meldde dat het materiaal wordt uitgeoefend geen effect op de cellulaire ALP activiteit of de aanmaak van collageen. Yokose et al. [59] gemeld dat PDGF-BB significante daling van de ALP activiteit van DPSC's.
Conclusies
Gunstige celoppervlak interacties met EMD werden gedemonstreerd, met inbegrip van ALP-expressie en een overvloed aan mineralisatie. EMD gaf superieure resultaten in vergelijking met MTA en PDGF over osteogene differentiatie van DPSC's. De effecten van MTA op osteogenesis van DPSC's waren niet overtuigend en de verdere studies nodig zijn. Bovendien, onze gegevens PDGF ondersteunt de mogelijkheid om osteogene differentiatie van DPSC induceren. Echter, PDGF deed celhechting en groei bevorderen, hetgeen duidt op een ander werkingsmechanisme dat verder onderzoek waard.
Werkwijzen
Isolatie van stamcellen
menselijke DPSC's werden geïsoleerd en gekenmerkt door de auteurs van de Stem Cell eenheid, koning Saud University, Koninkrijk Saoedi-Arabië (ongepubliceerde gegevens). Tanden werden verzameld van patiënten na op voorwaarde dat ze ondertekend informed consent, volgens een protocol door de institutionele ethische commissie (College of Dentistry Research Center-CDRC) goedgekeurd.
Het kort de inhoud pulp van vers gewonnen molaren werden gecombineerd en onderworpen aan 20-40 minuten enzymatische digestie gebruik collagenase type I (1 mg /ml) en dispase (5000 caseïneolytische eenheden). Vervolgens liet men de cellen groeien onder normale celkweekomstandigheden (37 ° C, 5% CO
2), met behulp Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline- streptomycine (pen-Strept), en 1% niet-essentiële aminozuren (alle gekocht van Gibco-Invitrogen, USA).
Karakterisering van stamcellen
kiemgetal-fibroblasten (CFU-F)
CFU -F werden geëvalueerd door het kweken van 2,5 x 10 3-cellen bij de tweede passage in 6-cm cultuur gerechten. Op dag 14 werden de cellen gefixeerd met 1% paraformaldehyde, gekleurd met 0,5% kristalviolet en microscopisch beoordelingsproces met een fase-contrast omgekeerde lichtmicroscoop (Zeiss, Leica, Duitsland).
Flow cytometry
Vierde passage cellen (1,5 x 10 6) werden gewassen met FACS-buffer (1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing, 5% FBS, 0,1% natriumazide) en verdund in 1,5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing. Vervolgens PE-geconjugeerd muis-anti-humaan CD146, CD73, CD29 en HLA-DR, FITC geconjugeerd muizen antihumaan CD34, CD90, CD45, CD13 en CD31, en APC-geconjugeerd muis-anti-humaan CD105, CD14, en CD44 antilichamen werden bereid in dark (alle van BD Biosciences, USA, met uitzondering van het monoklonale antilichaam tegen menselijk CD105, die werd gekocht van R & D Systems, USA) en gebruikt. Iedere FACS buis werd 100 pl cellen gemengd met 10 gl van het overeenkomstige antilichaam en gedurende 30 minuten in het donker bij 4 ° C. De uitingen van cellulaire markers werden beoordeeld met behulp van een Becton Dickinson FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences, USA), en de verkregen gegevens werden geanalyseerd met behulp van Cell Quest Pro Software versie 3.3, BD Bioscience, USA).
Osteogeen en adipogenic differentiatie
Cellen in de vierde passage werden gekweekt op 6-putjesplaten. Bij 60-70% confluentie werd osteogene differentiatie opgewekt met behulp van osteoinductie medium bereid volgens het protocol van Vishnubalaji et al. [60], en samengesteld uit DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% Pen-Strept, 50 ug /ml L-ascorbinezuur (Wako Chemicals GmbH, Duitsland), 10 mM glycerol fosfaat dinatriumzout (β-glycerofosfaat), 10 nM dexamethason en 10 nM calcitriol (1α, 25-dihydroxyvitamine D3) (Sigma, UK). Cellen die zijn aangehouden in de reguliere kweekmedium dienden als controles. De resulterende osteogenesis werd geëvalueerd na 14 dagen door middel van cytochemische kleuring voor ALP.
Adipogene differentiatie werd geïnduceerd met behulp van standaard adipogenic medium [60], bestaande uit DMEM aangevuld met 10% FBS, 10% paardenserum, 1% Pen-Strept, 100 nM dexamethason, 0,45 mM isobutyl methyl xanthine, 3 ug /ml insuline (alle gekocht bij Sigma, UK), en 1 pM rosiglitazon (BRL49653, Novo Nordisk, Denemarken). De resulterende differentiatie werd op 14 dagen door middel van olierood O-kleuring.
Materiaalgebruik
Aanvankelijk een pilotstudie uitgevoerd om drie verschillende concentraties in voor elk materiaal en de concentraties die het hoogste aantal differentiatie werden geselecteerd voor de vergelijkingen (fig. 4). Daarna cellen bij de vierde passage werden gekweekt en verdeeld in vijf groepen zoals hieronder getoond. Fig. 4 Scanoscope foto's voor ALP gekleurd verschillende experimentele groepen DPSC's. Original vergroting 1.4 ×. Schaal bar 1 mm. a, b, c EMD bij concentraties van 50, 100, 200 ug respectievelijk /ml. d, e, f PDGF bij concentraties van 5, 10, 20 ng /ml. g, h, i MTA bij concentraties van 0,02, 0,2, 2,0 mg /ml. j Percentage totale positieve kleuring gebied voor verschillende concentraties van elke onderzochte materiaal
1. Negatieve controle: cellen die zijn aangehouden in de reguliere celkweekmedium voor het gehele experiment (DMEM met 20% FBS, 1% Pen-Strept, 1% non- essentiële aminozuren). het kopen van 2. Reference Control (OT): Cellen gekweekt in de osteoinductie medium, bereid volgens het protocol van Vishnubalaji et al. [60].
3. EMD Groep: Cellen gekweekt in de osteoinductie medium aangevuld met 200 ug /ml EMD (Straumann, USA)
4.. PDGF Groep: Cellen gekweekt in osteo-inductie medium aangevuld met 5 ng /ml PDGF-BB (Osteohealth, USA)
5.. MTA. Groep: De cellen gekweekt in het osteoinductie medium aangevuld met 0,02 mg /ml MTA (Dentsply, USA)
De bereikte differentiatie werd geanalyseerd door evaluatie van ALP-expressie door middel van ALP kleuring en calciumionen afzetting door middel van alizarine rood S kleuring.
ALP activiteit
de cellen werden uitgezet op 8-kamer dia's op de dichtheid van 0,02 × 10 6 cellen /kamer en toegestaan te hechten en te groeien tot 50% samenvloeiing. Daarna werden de glaasjes verdeeld in de bovengenoemde vijf groeperingen en regelmatige of osteogene medium werd dienovereenkomstig aangebracht. Op dag 5 werden de cellen gefixeerd en gekleurd voor ALP met naftol-AS-TR-fosfaatoplossing (Sigma, UK). Vervolgens werden de kamers geëvalueerd onder een hoge-resolutie digitale microscoop waar de hele gebrandschilderde kamers op 40 × objectiefvergroting werden gescand met een ScanScope diascanner (Aperio Technologies Inc., USA). De digitale beelden van de zes verschillende kamers uit elk onderzoek werden bekeken en geanalyseerd met behulp van de kijk- en beeldanalyse instrumenten van Aperio Image Scope software (versie 10.2.2.2352; Aperio Technologies Inc.). Het gehele experiment werd driemaal herhaald onafhankelijk, dus in totaal 18 kamers /groep voor analyse. De analyse uitgang resultaten werden geëxporteerd naar Excel sheets, met de nadruk vooral op het percentage totale positieve kleuring gebied, gemiddelde optische dichtheid, en histologische score als de parameters voor statistische analyse en vergelijking.
Alizarinerood S kleuring
Op dezelfde wijze cellen werden gekweekt op 24-puts platen, en de vijf verschillende groepen opgericht. Media werden tweemaal per week vervangen met vers bereide regelmatige of osteogene media. Op dag 12 werden de cellen gekleurd met 40 mM AR-S alizarinerood (Sigma, UK), en onderworpen aan spectrofotometrische evaluatie volgens het protocol van Gregory et al. [61] in een microplaat reader (Gen5 ™, versie 1.10, BioTek Instruments Inc., USA) om de absorptie bij 405 nm te meten. Hetzelfde protocol werd herhaald driemaal onafhankelijk geven negen metingen voor elk onderzoek
Statistische analyse De gegevens werden geanalyseerd met SPSS statistische software. (Versie 16.0, SPSS, USA). Beschrijvende statistiek (gemiddelde en standaarddeviatie) werden gebruikt om de kwantitatieve uitkomst variabelen. Enkele factoren variantieanalyse (ANOVA) werd gebruikt om de gemiddelde waarden van resultaatvariabelen vergelijken over de categorische variabelen (groepen), gevolgd door een post-hoc Tukey test voor paarsgewijze vergelijkingen. Waarden van P Restaurant & lt; 0,05 werden beschouwd als statistisch significant te geven
Afkortingen
ALP.
Alkalische fosfatase
AR-S:
alizarinerood S vlek
BRL:
Rosiglitazon
° C:
graden Celsius of graden Celsius
CD:
Cluster van differentiatie
CFU-F:
kiemgetal-fibroblast
DMEM:
Dulbecco's gemodificeerd Eagles medium (met een hoge glucose, natrium pyruvaat en L-glutamine)
DNA:
deoxy-ribionucleic zuur
DPSC's :
Dental pulp stamcellen
EMD:
Enamel matrix derivaten
FACS:
fluorescentie-geactiveerde celsortering (Flow cytometrische analyse)
FBS:
Foetaal runderserum
FITC:
Fluorescentie iso thioocyanide
Mg:
milligrammen
ml:
Milliliter
pi:
Micro liters
mRNA:
Messenger ribonucleïnezuur
MTA:
Mineral trioxide aggregaat
< DFN> PBS:
fosfaat gebufferde zoutoplossing
Pen /Strept:
penicilline /streptomycine
PDGF:
bloedplaatjes afgeleide groeifactor
mRNA:
Ribonucleïnezuur
verklaringen
Dankwoord
Dit werk werd ondersteund door subsidie No. 09-BIO740 -20 van het Nationaal Plan voor Wetenschap & Technology Program, Koninkrijk Saoedi-Arabië. Wij danken alle medewerkers van de Stem Cell Unit, afdeling Anatomie, koning Saud University, Riyadh voor het verstrekken van hun technische ondersteuning aan dit onderzoek.
Open AccessThis artikel wordt gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http :. //creativecommons org /licenties /door /4. 0 /), die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elk medium toestaat, mits u de juiste krediet aan de oorspronkelijke auteur (s geven) en de bron, een link naar de Creative Commons-licentie, en aangeven of wijzigingen zijn aangebracht. De Creative Commons Public Domain Dedication waiver (http:. //Creativecommons org /publicdomain /zero /1 0 /) van toepassing op de ter beschikking gestelde in dit artikel, tenzij anders vermeld data
Competing. interesse de auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.
auteurs bijdragen
SA deelgenomen aan verschillende aspecten van laboratoriumstudies zoals mobiele karakterisering en materiaalgebruik, in aanvulling op de voorbereiding van de primaire ontwerp voor deze krant. NA geholpen bij de ontwikkeling van de belangrijkste research idee, bereidde de basis studie design, en op voorwaarde dat kritisch voor de hele papier schrijven. Bovendien, ze geregeld voor het verkrijgen van de tandheelkundige testmaterialen. AD verstrekt algemene technische ondersteuning in het bijzonder in cel karakterisering en differentiatie analyse, naast zijn rol bij het verkrijgen van alle basis laboratorium materialen. MN hebben geholpen in cellulaire osteogene en adipogenic differentiatie studies, en onder toezicht het schrijven van het technische deel van het onderzoek (materialen en methoden). Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
