Abstract achtergrond
De rol van celoppervlak glycoconjugaten in mondslijmvlies graft-versus-host ziekte (GVHD) is nog onduidelijk, hoewel moleculaire veranderingen in het orale epitheel zijn essentieel voor de pathogenese van deze laesies. In deze studie hebben we onderzocht veranderingen in het binden van mannose (Man) -specifieke Lens culinaris
lectine (LCA) in het orale slijmvlies van ratten met GVHD.
Methods
Lewis ratten miltcellen werden geïnjecteerd in ( Lewis x Brown Norway) F
1 ratten systemische GVHD, waaronder orale mucosalaesies induceren. Tong en milt monsters werden geëvalueerd met behulp van lectine histochemie, immunohistochemie, Western blotting, transwell migratie assays en Stamper-Woodruff bindingsbepalingen.
Resultaten
Binding van Man-specifieke LCA uitgebreid naar de epitheliale lagen van de tong in GVHD-ratten . Een uitbreiding van LCA binding werd gerelateerd aan de verhoogde expressie van mannosyltransferase in het mondslijmvlies. CD8 + cellen, effector cellen van mondslijmvlies GVHD, uitgedrukt-mannose bindend eiwit (MBP) en gemigreerd naar het medium dat de mens in de transwell migratie test. Hechting van CD8 + cellen orale epitheel kan worden geremd door voorbehandeling CD8 + cellen met MBP antilichaam en /of voorbehandelen van secties met Man-specifieke LCA.
Conclusies
Verhoogde expressie van Mens op keratinocyten leidt tot de migratie en /of adhesie van CD8 + cellen in het oppervlak epitheel, die gedeeltelijk door de MBP /Man-bindende route gemedieerd tijdens de ontwikkeling van orale mucosale GVHD.
Sleutelwoorden
Graft versus host disease Lens culinaris
lectine mannose bindend eiwit CD8 + lymfocyten Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-5) bevat aanvullende materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers. achtergrond
Graft-versus-host ziekte (GVHD) is een complicatie die kan optreden na hematopoietische stamcel of beenmergtransplantatie, die de nieuw getransplanteerde donor cellen aanvallen het transplantaat body ontvanger. GVHD wordt gekenmerkt door selectieve epitheliale ontsteking die het mucocutane organen aantast, maagdarmkanaal en lever [1]. Zowel klinische als experimentele studies hebben mondslijmvlies als een van de kritische gebieden die door GVDH [2, 3]. Histopathologische veranderingen in het slijmvlies GVHD omvatten satellitosis, waarbij lymfocyten vorm clusters rond dyskeratotic en /of necrotische keratinocyten (KCS). Lymfocyten, CD8 name + cellen migreren van de perivasculaire interstitium in de bovenliggende epitheellaag en degeneratieve veranderingen in KCs, wat suggereert dat het bepalen van de aard van KC vernietiging kunnen helpen bij het begrijpen van de pathogenese van mucocutane GVHD te induceren [4]. Tijdens dit proces, expressie van specifieke moleculen, zoals MHC klasse II en intercellulair adhesiemolecuul-1 (ICAM-1), komt voor in epitheliale KCS interactie met effectorcellen [5-8]. In het bijzonder verhoogde expressie van ICAM-1 op KCs leidt tot migratie van effectorcellen in het oppervlak epitheel, die deels wordt veroorzaakt door het pad ICAM-1 /lymfocyt functie-geassocieerde antigen-1 (LFA-1) [3].
Recente vooruitgang in glycobiology is gebleken dat celoppervlak glycoconjugaten een essentiële rol in de gebeurtenissen erkenning spelen. Lectine probes zijn doorgaans gebruikt celoppervlak glycoconjugaten detecteren, omdat lectinen gedefinieerd als uitzondering enzymen of antilichamen (Abs) koolhydraat bindende eiwitten [9]. Ze zijn betrokken bij verschillende biologische processen in vele soorten, zoals de klaring van glycoproteïnen van de bloedsomloop, hechting van infectieus materiaal aan cellen, rekrutering van leukocyten naar ontstekingsplaatsen en cel interacties gastheer in het immuunsysteem samen met tumoren en metastase [ ,,,0],9]. Lectinebinding wordt gewijzigd tijdens het proces van epitheliale differentiatie en schade stimulatie van de huid en het mondslijmvlies [10-13]. Onder de lectinen, Lens culinaris
lectine (LCA), bekend als een mannose (Man) bindmiddel, bezit unieke bindingsspecificiteiten, met twee voelsprieten kern van 1,6-gefucosyleerde oligosachariden en glycanen van humaan serum transferrine en α-foetoproteïne [ ,,,0],14]. Celoppervlak mens is ook een ligand voor mannose-bindend eiwit (MBP), die functioneert in opsonisatie van microorganismen voor fagocyten en cel-gemedieerde cytotoxiciteit-antitumoractiviteit [14, 15]. Deze studies hebben geleid tot de hypothese dat het bepalen van veranderingen in mensenuitdrukking op KCS zal helpen bij het begrijpen van de pathogenese van mondslijmvlies GVHD. Onze benadering van dit uitgangspunt is te richten op celoppervlak-expressie door Man KCS en de interactie met MBP in ratten orale mucosale GVHD van de ratten. Onze studie had drie doelen: (1) bepalen celoppervlak expressie Man van KCS met MAN-specifieke LCA, (2) om te onderzoeken of CD8 + cellen effectorcellen in mondslijmvlies GVHD, migreren naar een Man-bevattende medium, en (3) bepalen of expressie Man van KCS medieert binding van MBP tot expressie CD8 + cellen KCS. De resultaten geven aan dat tijdens de ontwikkeling van orale mucosale GVHD bij ratten, verhoogde expressie van Man van KCS leidt tot de migratie en /of adhesie van CD8 + cellen in de oppervlakte-epitheel gedeeltelijk gemedieerd door de MBP /Man-bindende pathway.
Methods
Rats
Volwassen vrouwelijke inteelt Lewis (LEW, RT1 l) en Lewis × Brown Norway F 1 hybride (LBNF 1 RTL 1 /n) ratten van 250-350 g werden verkregen van Kyudo Co. (Saga, Japan). Het dier studies werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Animal Care en gebruik Comite van Fukuoka Dental College goedgekeurd.
Inductie van GVHD
milt verwijderd uit LEW ratten werden ontleed in Hanks 'oplossing, gedwongen door een roestvrij stalen zeef, en gefilterd door een nylon mesh (Cell Filters, BD Biosciences, CA, USA). De cellen werden driemaal gewassen in Hanks 'oplossing en geresuspendeerd bij 10 8 /ml in RPMI-1640 medium met 10% foetaal kalfsserum. Cel levensvatbaarheid werd bepaald door trypan blauw exclusie analyse. GVHD werd geïnduceerd door een 3-ml intraperitoneale injectie van 3 x 10 8 cellen in LBNF 1 ratten. Onbehandelde LBNF 1 ratten en LBNF 1 ratten geïnjecteerd met evenveel syngene LBNF 1 splenocyten werden als controles. Alle ratten werden dagelijks gewogen en zorgvuldig geobserveerd op klinische ziektesymptomen.
Beoordeling van GVHD
Klinische beoordeling van GVHD werd bepaald door gewichtsverlies en de ontwikkeling van cutane of mucosale erythema, vooral op de oren, neusslijmvlies, mond -pads en lippen. Beide klinische omstandigheden verschenen op dag 10 na de injectie en werd ernstig daarna. Een miltgewicht assay werd uitgevoerd bij autopsie om de immunologische evaluatie van GVHD bevestigen. Na dag 10, de experimentele ratten toonden opmerkelijke splenomegalie als overexpressie van GVHD immunologische reactie [16]. Alle controle dieren overleefden en leek gezond.
Tissue voorbereiding
De hele tong werd uitgesneden 1-21 dagen na de injectie van vijf dieren in elke behandelingsgroep. De helft van de tong monsters werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Paraffine secties (4 urn) werden vervolgens gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E) voor histopathologische veranderingen onderzocht. De andere helft werd onmiddellijk bevroren in vloeibare stikstof en seriële vriescoupes werden gebruikt voor immunokleuring, lectine histochemie en in vitro
adhesietesten.
Lectine histochemie
LCA, Ulex europaeus I
(UEA- 1) en Archis
hypogaea (pinda: PNA) werden gebruikt voor detectie van α-D-Man, α-L-fucose en galactose β1,3galactosamine respectievelijk (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA ). LCA binding werd gedetecteerd met de Alexa Fluor 568 - gelabeld streptavidine biotine methode. Aceton gefixeerd ingevroren secties werden geïncubeerd met gebiotinyleerd LCA (25 ug /ml; Vector Laboratories) gedurende 30 min en Alexa Fluor 568-gelabeld streptavidine (1: 400; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Histochemische controles gesubstitueerd ongeconjugeerde LCA de LCA-biotine conjugaat en reactie met gebiotinyleerd LCA geïnactiveerd door de specifieke inhibitor suiker (D-mannose, 2 mM; EY Laboratories, Inc., San Mateo, CA, USA)
Immunohistochemie Abs gebruikt in deze studie waren als volgt: (a) een konijn polyklonaal Ab tegen ALG11, reactief met mannosyltransferase (1: 300; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), (b) een konijn polyklonaal Ab tegen LMAN2, reactief met MBP 2 (1: 100; Aviva Systems Biology, San Diego, CA, USA), (c) een monoklonaal Ab tegen 1A29, reactief met ICAM-1 (1: 100; Cederlane Lab, Ontario, Canada.) en ( d) een monoklonaal Ab tegen OX-8, reactief met CD8 (1:. 100; Cederlane Lab). Aceton gefixeerd vriescoupes werden eerst geïncubeerd met normaal konijnenserum afnemen specifieke binding en vervolgens met een van de Abs, overnacht bij 4 ° C. Secties werden vervolgens geïncubeerd met alkalische fosfatase geconjugeerd anti-konijn of anti-Ab Ab muis (1: 150 verdunning; DakoCytomation, Tokyo, Japan) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Immunohistochemische reacties werden gevisualiseerd met behulp van 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat /nitroblauwtetrazolium chlorideoplossing (BCIP /NBT oplossing; DakoCytomation). Als controle werden secties behandeld met normaal konijnenserum IgG in plaats van de eerste reeks Abs.
Western blotting
Totaal eiwit werd geëxtraheerd uit milt en tong specimens controle of GVHD ratten onder toepassen ijskoude cellysis buffer (20 m m Tris-HCl, pH 7,5, 150 mMNaCl, 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA], 1 mM Na 2EDTA; 1 mM ethyleenglycol-azijnzuur, 1% [v /v] Triton X-100, 2,5 mM natrium- pyrofosfaat, 1 mMβ-glycerofosfaat, 1 mM Na 3VO 4 en 1 gg /ml leupeptine en fenylmethylsulfonylfluoride). Gelijke hoeveelheden eiwit (20 ug) werden gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE, 12% gel scheiden). Na electroforese werden eiwitten overgebracht op polyvinylideen difluoride membranen (Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan). De blots werden geblokkeerd met 1% caseïne in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,1% Tween-20 (TBS-T) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en dan geïncubeerd met primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C. Primaire Abs tegen LMAN2 (eerder beschreven) en β-actine (Sigma-Aldrich) werden gebruikt. De membranen werden gewassen in TBS-T en geïncubeerd met secundaire mierikswortelperoxidase-gemerkte Ab gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Gebonden Ab complexen werden gedetecteerd door versterkte chemiluminescentie (Bio-RadLaboratories).
Isolatie van CD8 + cellen uit de milt van ratten-gemedieerde GVHD
CD8 + cellen van GVHD ratten werden in transwell migratie assays en Stamper- Woodruff bindingstesten. Lymfocyten werden geplaagd uit milt, vertonen splenomegalie van GVHD ratten en gesuspendeerd in RPMI-1640 medium bij 4 ° C. De cellen werden verspreid door snelle, in-out pipetteren, en de cel klonten werden verwijderd door doorgang door een nylon mesh (Cell Zeven; BD Biosciences). De resulterende eencellige suspensie werd driemaal gewassen in hetzelfde medium en geresuspendeerd bij een concentratie van 3 x 10 7mononuclear cellen /ml. CD8 + cellen uit de suspensie geïsoleerd met magnetische korrels zuivering via Miltenyi CD8a microkralen volgens het protocol van de fabrikant (Miltenyi Biotec, Tokyo, Japan).
Transwell migratie test voor effectorcellen
Migratie van CD8 + cellen van de GVHD-milt werden geëvalueerd in een TRANSWELL® inzetstuk systeem waarin de bovenste en onderste putjes werden gescheiden door polycarbonaatmembraan (3 urn poriegrootte, Corning, NY, USA). CD8 + cellen gepreïncubeerd indien met anti-MBP Ab (50 ug /ml), werden geënt bij een dichtheid van 5 x 10 4 cellen /putje op 3 urn Transwell inzetstukken. De onderste kamer werd gevuld met alleen of medium dat Man (2 mM) 500 pl RPMI medium, een mix van Mens en LCA (50 ug /ml), of galactose (Gal, 2 mM; EY Laboratories). De cellen werden gedurende 4 uur bij 37 ° C (5% CO 2) en daarna gekleurd met Diff-Quik (Sysmex Corporation, Hyogo, Japan). Migratie activiteit werd geëvalueerd als het percentage migratie van cellen uit de bovenste kamer van de transwell te voegen aan de Tweede Kamer in drie high power velden (100x) per putje. Het experiment werd in drievoud uitgevoerd.
Stamper-Woodruff bindingstest (SWBA)
Stamper-Woodruff-diepvries-gedeelte werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [3]. In het kort monsters bevattende 2,5 x 10 5 geïsoleerde CD8 + cellen in 200 ul RPMI-1640 medium werd toegevoegd aan vers gesneden (8 um) ingevroren secties van de uit ratten in de controlegroep en GVHD groepen tong. De secties werden geschud op een roterende schudmachine (60 rpm) gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens werd de celsuspensie voorzichtig gedecanteerd en de cellen hechten aan secties werden gefixeerd met 2,5% glutaaraldehyde in PBS gedurende 5 minuten. Objectglaasjes werden vervolgens in PBS gewassen en gekleurd met 0,5% toluidine blauw. Het aantal hechtende CD8 + cellen werd bepaald door het licht microscopie onderzoek van de velden op 200 x vergroting (Elke high-power veld vertegenwoordigde ongeveer 400 pm van orale epitheel). Het aantal CD8 + cellen direct vastgemaakt via KCS (maar niet in de verhoornde laag) werd geteld. Verscheidene blokkerende experimenten werden uitgevoerd als volgt: (a) ingevroren secties van tong GVHD ratten werden geïncubeerd met 25 ug /ml LCA, PNA of UEA-I gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur na een korte wassen met PBS, en daarna toegevoegd aan lymfocyten; (B) CD8 + cellen werden vooraf geïncubeerd met 50 ug /ml MBP Ab gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, voordat het gehele reactiemengsel op ingevroren secties van de GVHD-tongen overgebracht; (C) de twee benaderingen werden simultaan gebruikt, d.w.z. CD8 + cellen werden behandeld met MBP Ab en weefselcoupes werden met MBP. De resultaten worden berekend als het percentage binding ten opzichte van lymfocyten en weefselcoupes blootgesteld alleen bufferbesturing.
Statistische analyse Statistische analyse werd uitgevoerd met één variantieanalyse (ANOVA) en de Scheffe's meervoudige vergelijkingstest tests ter bepaling van statistische verschillen tussen de monsters. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) en P
waarden van & lt; 0,05 werden beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
mondslijmvlies GVHD wordt gekenmerkt door ICAM-1 expressie en CD8 + T-cel infiltraten
Eerste onderzoeken we of immunohistochemische kenmerken in het mondslijmvlies worden gedetecteerd tijdens de ontwikkeling van GVHD . In onbehandelde controle tongen werden geen histologische veranderingen waargenomen met H & E kleuring (figuur 1a). ICAM-1-expressie bleef beperkt tot endotheliale en perivasculaire cellen van de bloedvaten (Figuur 1c). Slechts enkele CD8 + cellen waargenomen in de lamina propria en orale epitheel (figuur 1e). De resultaten waren hetzelfde in weefselsecties uit experimentele ratten 8 dagen na injectie. Echter, 10 dagen na inductie van GVHD in LBNF 1 ratten zowel histologische en immunohistochemische wijzigingen werden waargenomen in de tongen. H & E kleuring onthulde lesies typisch voor acute GVHD mucocutane geeft aan eosinofiel cytoplasma degeneratie en necrose van epitheliale KCs (de zogenaamde satellitosis) als gevolg van intra-epitheliale infiltratie van lymfocyten (Figuur 1b). ICAM-1 expressie werd waargenomen in de basale tot spinous lagen van het epitheel (figuur 1d) en het aantal CD8 + cellen verhoogde in de lamina propria van de tong (figuur 1f). Bovendien werden deze cellen geïnfiltreerd in het oppervlak epitheel waarbij epitheliale KCS werden gekleurd met anti-ICAM-1 Ab. Figuur 1 Immunohistochemische expressie van intercellulair adhesiemolecuul-1 (ICAM-1) en CD8 + in graft-versus-host ziekte (GVHD) -gerelateerde orale mucosa. a en b: geen duidelijke veranderingen waargenomen in hematoxyline en eosine (H & E) -stained control slotdelen (a). In tong weefsel secties van GVHD ratten is epitheliale vernietiging waargenomen (b). c en d: In tong specimens van controleratten, ICAM-1 wordt alleen tot expressie gebracht in vasculaire sleuven (pijlen) (c). Epitheliale ICAM-1-expressie wordt waargenomen in de basale tot spinous lagen van het mondslijmvlies van GVHD ratten (d). e en f: Slechts enkele CD8 + cellen worden aangetroffen in de controlegroep (e). In de GVHD ratten verhoogde aantallen CD8 + cellen waargenomen in zowel lamina propria en oppervlakte-epitheel (f). De stippellijn geeft een verbindingspunt tussen de oppervlakte-epitheel en de lamina propria van de tong. Bar = 100 micrometer.
Veranderingen in LCA verbindend in mondslijmvlies GVHD Belgique Om helderen of histochemische expressie van celoppervlak Man op epitheliale KCS wordt beïnvloed door de ontwikkeling van GVHD, onderzochten we LCA kleuring in de tongen van de controle en GVHD ratten. LCA binding was beperkt tot het celoppervlak van de basale tot KCS parabasale in het oppervlak epitheel van de tongen uit controleratten (Figuur 2a). Hetzelfde kleuringspatroon werd aangetoond in coupes genomen uit experimentele ratten acht dagen na de injectie. In tegenstelling, het niveau van LCA kleuring uitgebreid tot de doornuitsteeksels lagen van de oppervlakte-epitheel 10 dagen na injectie, wat aangeeft dat oligosachariden op KCs tijdens de ontwikkeling van GVHD kan worden gewijzigd (Figuur 2b). Bovendien is de extensiepatroon LCA kleuring was identiek aan die van ICAM-1 expressie. Figuur 2 Lens culinaris lectine (LCA) binding in graft-versus-host ziekte (GVHD) orale mucosa. LCA treedt binding aan het celoppervlak van basale cellen in de controle tongen parabasale (a). Kleuring strekt zich uit tot de doornuitsteeksels lagen van de oppervlakte-epitheel in GVHD ratten (b). De witte stippellijn omschrijft het oppervlak epitheellaag van de tong. Bar = 100 micrometer.
Verhoogde expressie van mannosyltransferase complex in het mondslijmvlies GVHD
wij naast onderzochten de immunohistochemische expressie van mannosyltransferase complex, met behulp van ALG11 Ab, in tongen van zowel controle en GVHD ratten, om te onderzoeken of de mannosyltransferase zou kunnen zijn verantwoordelijk voor de toevoeging van de mens op de oligosacchariden in KCs tijdens de ontwikkeling van GVHD. In normale tong, ALG11 gebonden zwak en /of zwak om basale en parabasale KCS van het oppervlakte-epitheel (Figuur 3a). Reactieve plaatsen met ALG11 uitgebreid naar het cytoplasma van KCs in de doornuitsteeksels lagen van de oppervlakte-epitheel in de tongen van GVHD ratten (Figuur 3b). De reactieve bereik met ALG11 leek identiek aan die van LCA binding suggereert dat verhoogde expressie van mannosyltransferase in de epitheliale lagen kunnen worden gerelateerd uitgebreide binding van LCA zijn. Figuur 3 Immunohistochemische detectie van mannosyltransferase complex in graft-versus-host ziekte (GVHD) -affected orale mucosa. ALG11 antilichaam (Ab) van mannosyltransferase complex is zwak en zwak reactief basale en parabasale epitheelcellen controle tongen (a). Daarentegen kleuring met ALG11 uitstrekt tot keratinocyten (KCS) in de doornuitsteeksels lagen tongen van GVHD ratten (b). Bar = 100 urn.
MBP /Man-bindende route induceert CD8 + celmigratie in vitro Belgique Om helderen of migratie van CD8 + cellen wordt gemedieerd door de MBP /Man-bindende route bestudeerden we expressie van MBP de tongen van GVHD ratten en de transwell migratie test voor CD8 + cellen. Eerst onderzochten we immunohistochemische detectie van MBP in weefselsecties van de tong van de GVHD-ratten. MBP + infiltrerende cellen waargenomen in zowel de bovenste lamina propria en oppervlakte-epitheel van de tongen (figuur 4a). We onderzochten ook eiwitexpressie van MBP in de tongen en milt van de controle en GVHD ratten door Western blotanalyse. Zoals getoond in figuur 4b, is de hoeveelheid MBP accumulatie sterk toegenomen in zowel de tong en de milt van ratten GVHD. Daarentegen expressie van MBP eiwit was zwak of negatief in zowel de tong en milt van controleratten (figuur 4b). Deze resultaten suggereren dat MBP geïnduceerd kunnen worden op GVHD gerelateerd effectorcellen en MBP op effector cellen kunnen reageren tegen celoppervlak Man of KCs de talen van GVHD ratten. Om deze hypothese te testen hebben we vervolgens uitgevoerd transwell migratie assays voor effectorcellen. Zoals getoond in figuur 5, het percentage migratie van CD8 + cellen Man drastisch toegenomen (77,9 ± 4,6) dan bij controlepatiënten (1,7 ± 0,6). De migratie procent van CD8 + cellen werden lager in de onderste kamer met Man en LCA (8,3 ± 0,7) en Gal (1,5 ± 0,7). Bovendien is de CD8 + celmigratie naar Man drastisch afgenomen (5,6 ± 0,4) wanneer de cellen werden vooraf geïncubeerd met anti-MBP Ab. Deze resultaten geven aan dat migratie van CD8 + cellen mens gemedieerd door de MBP /Man-bindende route. Figuur 4 Mannose-bindend eiwit (MBP) expressie tong en milt monsters van graft-versus-host ziekte (GVHD) ratten. Infiltrerende cellen immunohistochemisch expressie door anti-MBP-antilichaam (Ab) (a). Western blot analyse van MBP niveaus van de tong en de milt van de controle en GVHD ratten (b). Zowel tong en milt van de GVHD-gemedieerde ratten tonen opmerkelijke reactie met MBP. β-actine (ACTB) werd op dezelfde wijze onderzocht als ladingscontrole. Bar = 100 urn.
Figuur 5 Inductie van mannose (Man) aan CD8 + celmigratie. CD8 + celmigratie werd onderzocht door de transwell migratie test. Man, man met Lens culinaris
lectine (LCA) of galactose werd geplaatst in de onderste kamer ook. De putjes van de bovenkamer ontvangt geïsoleerde CD8 + cellen, voorbehandeld of niet met anti-mannose-bindend eiwit (MBP) antilichaam (Ab). RPMI werd gebruikt als een negatieve controle. De figuur geeft de resultaten van drie experimenten uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking. Dezelfde symbolen vertonen geen statistisch significante verschillen. Anderen, significant verschillend bij P Restaurant & lt; 0.05.
Anti-MBP Ab en LCA remmen hechting van CD8 + cellen om KCS met de tong monsters van ratten met GVHD
In de rat GVHD model kunnen effector cellen binden aan letsels KCS door de ICAM-1 /LFA-1 pathway [3]. We voerden SWBA behulp van CD8 + cellen en /of orale epitheliale cellen van ratten met GVHD, om het bewijs van een directe rol van de MBP /Man-bindende route in de binding van CD8 + cellen om epitheliale KCS voorzien . Voorbehandeling van de weefselcoupes bereid van het mondslijmvlies met PNA en UEA-I had geen effect, terwijl LCA daalde lymfocytadhesie met 42,3% van de controlewaarde (figuur 6). Wanneer lymfocyten van ratten met GVHD werden geïncubeerd met anti-MBP Ab, lymfocyt adhesie aan epitheliale KCS was 42,7% van de controlewaarde (figuur 6). Wanneer de twee benaderingen simultaan toegepast, d.w.z. wanneer de lymfocyten met anti-MBP Ab werden behandeld en de weefselcoupes werden behandeld met LCA, lymfocytadhesie verlaagd tot & lt; 40% van de controlewaarde (figuur 6). Deze resultaten geven aan dat de hechting van CD8 + cellen epitheliale KCS wordt ten dele gemedieerd door de MBP /Man-bindende route. Figuur 6 Effect van lectinen en anti-mannose-bindend eiwit (MBP) antilichaam (Ab) op CD8 + celadhesie de orale epitheel in GVHD. Adhesie van CD8 + cellen naar de orale keratinocyten (KCS) werden onderzocht door Stamper-Woodruff binding assay (SWBA). Binding van CD8 + cellen werd significant verlaagd wanneer de cellen werden voorbehandeld met anti-MBP Ab, en bij het epitheel werden voorbehandeld met Lens culinaris
lectine (LCA). De figuur geeft de resultaten van drie experimenten uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking. Dezelfde symbolen vertonen geen statistisch significante verschillen. Anderen, significant verschillend bij P Restaurant & lt; 0.05.
Discussie
In deze studie gebruiken we de haploidentieke allogene F 1 hybride rat model om de rol van celoppervlak expressie van de Mens residuen toe te lichten door KCS in GVHD. Hoewel dit model niet direct klinische hematopoietische stamceltransplantatie in de menselijke vertegenwoordigt, biedt een handige en genetisch goed opgezet systeem van waaruit inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan immuun-gemedieerde weefsel schade van gastheer epitheelweefsel door het bestuderen van de in vivo
krijgen interacties tussen KCS en lymfocyten [17]. We presenteren drie lijnen van bewijs de conclusie dat celoppervlak expressie van Man van KCS speelt een rol bij de migratie en /of adhesie van CD8 + cellen in het epitheel tijdens de ontwikkeling van GVHD te ondersteunen. Ten eerste, een lectine histochemische benadering bevestigde dat de celoppervlak expressie van Man van KCS werd opwaarts gereguleerd in de ontwikkeling van GVHD. Ten tweede, eiwitexpressie en transwell migratie resultaten toonden aan dat CD8 + cel migratie naar Man werd in verband met een interactie tussen MBP en Man. Ten derde, CD8 + celadhesie van het slijmvliesoppervlak epithelium werd gemedieerd door de MBP /Man-bindende route zoals geopenbaard middels SWBA.
Een up-regulatie van LCA binding op het celoppervlak van KCS aan dat de cel- oppervlakte-expressie van de mens wordt gewijzigd tijdens de ontwikkeling van het mondslijmvlies GVHD. In mucocutane GVHD, specifieke moleculaire veranderingen optreden in KCS lymfocytenmigratie zodat in het oppervlak epitheellaag [7, 8, 18]. Een eerdere studie heeft gemeld dat de inductie van ICAM-1-expressie op KCs leidt tot migratie van CD8 + cellen in het epitheel en dat dit proces wordt gemedieerd gedeeltelijk door de ICAM-1 /LFA-1 pathway [3] . De hier gepresenteerde resultaten aanvullende steun voor moleculaire veranderingen in KCs tijdens de ontwikkeling van orale mucsal GVHD. De immunohistochemische studie van de anti-ALG11 Ab gemeld hier blijkt dat Ab reactieve plaatsen ook meer doornuitsteeksels lagen in het oppervlakte-epitheel van de GVHD tong. ALG11 is bekend als alfa-1,2-mannosyltransferase in N-gekoppelde glycoproteïne en is gelokaliseerd aan de cytosolische zijde van het endoplasmatisch reticulum in basale cellen van normale squameuze epithelia [19]. Deze bevindingen suggereren dat de uitgebreide expressie van mannosyltransferase complex indirect verantwoordelijk voor de opwaartse regulatie of Man expressie op het celoppervlak van KCS in de GVHD tong kan zijn. Toekomstige werkzaamheden betreffen daarom de expressie van mannosyltransferase complex en mens groeien tijdens de ontwikkeling van GVHD.
Immunohistochemische en Western blot-analyses blijkt dat hier gepresenteerde effectorcellen van GVHD vertonen de expressie van MBP gebruik LMAN2 Ab, naast CD8. MBP, ook wel mannan-bindend eiwit of-mannan bindend lectine, een Ca2 + - afhankelijke (C-type) dierlijke lectine [20-22]. Een recente studie toonde aan dat dit eiwit een specifiek effect op T- celactivering [23] kan geven. MBP voorkeur bindt aan koolhydraten getermineerd met Man, N-acetylglucosamine of fucose [24]. Daarom MBP tot expressie lymfocyten lijken te interageren met-Man uiting van KCS in mondslijmvlies GVHD. De resultaten van de transwell migratieanalyse blijkt dat de migratie van de MBP tot expressie CD8 + cellen wordt versneld door medium dat Man. CD8 + celmigratie werd geremd door een mix van Mens en LCA en voorbehandeling van cellen met LMAN2 Ab, wat aangeeft dat MBP op CD8 + cellen herkend Man specifiek. Deze resultaten suggereren dat de migratie van effectorcellen CD8 + lymfocyten aan Man-expressie KCS kan worden gemedieerd door een interactie tussen MBP en Man.
CD8 + cel-adhesie aan epitheel gekleurd met Man- specifieke LCA werd aangetoond met SWBA. Aldus de binding van CD8 + cellen op het oppervlak epitheel tijdens de ontwikkeling van GVHD toeneemt met mensenuitdrukking en correleert met ziekteprogressie. Deze resultaten zijn consistent met de in vivo waarnemingen
van KCS expressie Man-specifieke LCA houden aan CD8 + cellen gedurende het verloop van GVHD. Per hechtingsproces, MBP op CD8 + cellen speelt een belangrijke rol als kleefstof factor van de mens tot expressie KCS tijdens de ontwikkeling van GVHD. Bovendien geven de resultaten van LCA en Ab-blokkerende experimenten achter het idee dat MBP /Man interacties verantwoordelijk voor de binding van CD8 + cellen. Zo LMAN2 Ab, LCA, of LMAN2 Ab samen met LCA, blokkeerde alle CD8 + cell-binding in vergelijking met lecitns het herkennen van niet-verwante residuen Man. Onze eerdere studie toonde aan dat de inductie van ICAM-1-expressie op KCs tot de hechting van CD8 + cellen aan het oppervlak epitheel en dat dit gedeeltelijk gemedieerd door de ICAM-1 /LFA-1 pathway [3]. De MBP /Man interacties gepresenteerde bij een andere lijm pad voor de migratie en adhesie van effectorcellen in de oppervlakte-epitheel tijdens de ontwikkeling van orale mucosale GVHD.
Samenvattend, deze resultaten worden de rol van mensenuitdrukking op KCs tijdens de ontwikkeling van GVHD als het induceren van migratie van MBP tot expressie CD8 + cellen in de orale epitheel, waar zij zich aan KCS. De opwaartse regulatie van expressie man op KCS is ongetwijfeld een belangrijke stap in de pathogenese van mondslijmvlies GVHD.
Conclusie
Een verhoogde expressie van Mens op KCs leidt tot de migratie en /of adhesie van CD8 + cellen in het oppervlakte-epitheel en dit wordt gemedieerd een deel door de MBP /Man route tijdens de ontwikkeling van het mondslijmvlies GVHD
Afkortingen
ACTB:.
β-actine
Ab:
Antibody
GVHD:
Graft-versus-host disease
H & amp; E:
