Abstracte achtergrond
Porphyromonas gingivalis
is aangetoond dat osteoblasten binnen te vallen en te remmen hun differentiatie en mineralisatie in vitro. Het is echter onduidelijk of P. gingivalis
osteoblasten kunnen binnendringen in vivo en hoe zij vrezen alveolaire osteoblasten /osteoclasten dynamiek. Deze studie is bedoeld om deze vragen met behulp van een parodontitis muismodel onder repetitieve P. gingivalis
inentingen te beantwoorden.
Methods
Voor 3-maanden oude BALB /cByJ vrouwelijke muizen, 10
9 CFU van P. gingivalis
op de gingivarand van bovenkaak kiezen 4 keer werden geënt op 2-daagse intervallen. Na 2 weken werden nog eens 4 inoculaties op 2 dagen intervallen aangebracht. Calceïne werd 7 en 2 dagen ingespoten vóór offeren dieren naar het nieuw gevormde bot labelen. Vier weken na de laatste inoculatie werden de muizen opgeofferd en maxilla verzameld. Immunohistochemie micro-CT en bothistomorfometrie werden uitgevoerd op de monsters. Sham infectie met enige voertuig was de controle.
Resultaten
P. gingivalis
bleek tandvlees epitheel, parodontale ligament fibroblasten, en alveolaire osteoblasten binnenvallen. Micro-CT vertoonden alveolaire botresorptie en significante vermindering van de botdichtheid en de inhoud in de geïnfecteerde muizen vergeleken met de controles. Bothistomorfometrie een daling in osteoblasten, een toename van osteoclasten en botresorptie en een verrassend verhoogde osteoblastische bot in de geïnfecteerde muizen vergeleken met de controles.
Conclusies
P. gingivalis
binnendringt alveolaire osteoblasten in de parodontitis muismodel en veroorzaken alveolaire botverlies. Hoewel P. gingivalis
lijkt te onderdrukken osteoblasten zwembad en verbeteren osteoclastische botresorptie, is de botvorming capaciteit tijdelijk verhoogd in de geïnfecteerde muizen, eventueel via een aantal anti-microbiële compensational mechanismen.
Sleutelwoorden
Osteoblasten P. gingivalis
Invasion Micro-CT Bothistomorfometrie Electronic aanvullend materiaal
De online versie van dit artikel (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-89) bevat aanvullend materiaal, dat beschikbaar is voor geautoriseerde gebruikers is <. br> Achtergrond
Parodontitis beïnvloedt tot 20% van de wereldbevolking [1]. Het is een indicatie van slechte mondhygiëne en is gekoppeld aan een slechte algemene gezondheid en levensvreugde, vooral bij geriatrische populatie [2]. Het kenmerk van parodontitis is het verlies van connectiviteit tussen de tand, parodontale weefsels, en alveolaire bot. Vernietiging van weefsel en botresorptie resulteert in de vorming van de parodontale pocket, een vergrote subgingivale ruimte die een beschermende habitat voor parodontale micro-organismen. De ontwikkeling van parodontitis is een multifactorieel proces draait om complexe gastheer-organisme interacties [3]. P. gingivalis
is een gram-negatieve zwarte gepigmenteerde anaerobe dat de subgingivale spleet koloniseert, en is aangewezen als een van de belangrijkste parodontale ziekteverwekkers. Het heeft meerdere bekende virulentiefactoren die bijdragen tot de overleving in de orale omgeving, zoals fimbriae, gingipains, lipopolysacchariden (LPS), capsule en hemagglutinine [4].
Veel bewijs geeft aan dat meerdere componenten van P. gingivalis
kan handelen osteoblasten aan alveolair bot te remmen. P. gingivalis
LPS, lipiden, metabolieten en gesonificeerd extracten kan de differentiatie en osteogenesis van osteoblasten [5-10] inhiberen, moduleren en RANKL (receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand) en /of OPG (osteoprotegerine) expressie in osteoblasten om indirect te stimuleren osteoclastogenesis [11-14]. Onlangs heeft ons laboratorium aangetoond dat P. gingivalis kunnen
osteoblasten binnenvallen en remmen de rijping en mineralisatie in vitro [15] en fimbriae spelen een belangrijke rol in het mediëren de initiële invasieve procedure [16].
Periodontale pathogenen is aangetoond dat ze inbreuk maken op alveolaire oppervlak en bezetten lege lacunes bij patiënten met ernstige parodontitis [17]. Het is niet duidelijk of P. gingivalis
kunnen osteoblasten binnenvallen in vivo, en zo ja, hoe dit zou bothomeostase invloed op geïnfecteerde sites. Muizen hebben geen P. gingivalis
kader van hun endogene orale microflora [18]. Echter, parodontitis en alveolaire botverlies zijn met succes in muizen geïnduceerd door intra-orale inenting van levende P. gingivalis
[19-21]. Het doel van deze studie is om de invasie van de alveolaire osteoblasten door P. gingivalis
onderzoeken, en hoe osteoblast-osteoclasten koppeling wordt beïnvloed door een bacteriële infectie in een parodontitis muismodel onder repetitieve P. gingivalis
inentingen. Het bleek dat P. gingivalis
kon parodontale cellen binnen te dringen en verstoren de homeostase van osteoblasten en osteoclasten, die uiteindelijk bijdraagt aan alveolair botverlies.
Methoden
Bacteriën en kweekomstandigheden
P. gingivalis
stam ATCC 33277 werd anaëroob gekweekt bij 37 ° C in een Coy anaërobe kamer onder een atmosfeer van 86% stikstof: 10% kooldioxide: 4% waterstof. Kweekmedia was Trypticase Soy Broth (TSBY) aangevuld met 5% gistextract, 2% natriumbicarbonaat, 7,5 pM hemine en 3 pM menadion. TSB agarplaten (BAP) gedaan bij toevoeging van bloed 5% schapenmelk en 1,5% agar. De bacteriën werden beënt van BAP in 5 ml TSBY anaëroob en gekweekt gedurende 18 tot 24 uur bij 37 ° C, vervolgens verdund in TSBY en gekweekt tot vroege log-fase. Bacteriële cellen werden geoogst door lage snelheid centrifugatie, gewassen en opnieuw gesuspendeerd in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). De concentratie bacteriën werd bepaald met een spectrofotometer bij een optische dichtheid van 600 nm (OD = 1 10 9P. Gingivalis
per ml). 10 9 CFU levende P. gingivalis
werd verzameld en gepelleteerd door lage snelheid centrifugatie, vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 20 ui PBS met 2% carboxymethylcellulose. De bacteriële suspensie werd aangebracht op de gingivale marge van muis maxillaire kiezen zoals hieronder beschreven.
Bacteriële inenting
Een muis periodontitis model werd vastgesteld met een lichte modificatie van de eerder beschreven werkwijze [22]. Kort samengevat werden 10-12 weken oude BALB /cByJ vrouwtjesmuizen in specifieke pathogeenvrije omgeving gehouden. Zij ontvingen kanamycine bij 1 mg /ml in gedeïoniseerd water ad libitum gedurende 7 dagen. Drie dagen na de behandeling met antibiotica, werden de muizen onder korte isofluraananesthesie gemaakt en 10 9 CFU levende P. gingivalis
in 20 ul PBS met 2% carboxymethylcellulose werd op de gingivale marge van muis maxillaire molaren viermaal, 2 dagen na elkaar. De muizen werden weerhouden van voedsel en water inname van 1 uur na de inenting. We gebruikten een inenting concentratie van 1 x 10 9 CFU, omdat onze voorlopige studie toonde aan dat deze concentratie was voldoende om P. gingivalis
invasie van parodontium en alveolaire botverlies veroorzaken. Sham geïnfecteerde groep kreeg 20 ul PBS met 2% carboxymethylcellulose alleen. Twee weken later nog vier doses (2 dagen na elkaar) werden toegepast op de muizen. Vier weken na de tweede orale uitdaging werden de muizen gedood en de bovenkaak monsters werden verzameld voor micro-CT en bothistomorfometrie studies. Voor P. gingivalis
invasie studie werd immunohistochemie uitgevoerd op bovenkaak monsters verzameld 3 dagen na drie keer van bacteriële inentingen. Tien dieren werden elk opgenomen voor zowel besmette en sham groepen voor de hiervoor genoemde studies. All-diergerelateerde experimenten werden goedgekeurd door het Center for Laboratory Animal Care Medicine en aan de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston (goedgekeurde protocol dier HSC-AWC-10-145).
Immunohistochemie
Muizen bovenkaak exemplaren waren geïsoleerd, in 10% neutraal gebufferde formaline gefixeerd, ontkalkt in 3,4% natriumformiaat /15% mierenzuur, en ingebed in paraffine. Antigeenterugtrekking werd uitgevoerd met 4 N HCl gedurende 10 min bij 37 ° C. Endogene peroxidase activiteit werd geblokkeerd door incubatie van 10 min met 3% H 2O 2. Niet-specifieke eiwitten werden geblokkeerd met DAKO eiwit blok (Dako, Carpinteria, CA) gedurende 30 min bij kamertemperatuur (RT). Secties werden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met 1: 4000 anti-konijn P. gingivalis
polyklonaal antilichaam. Secundair antilichaam en substraat kleuring werden uitgevoerd met DAKO LSAB + kit en vloeibare DAB + substraat-chromogeen-systeem (Dako). De objectglaasjes werden tegengekleurd met hematoxyline. Het aantal osteoblasten met bacteriële invasie werd met de hand geteld. Voor beide P. gingivalis
geïnfecteerde en controle groepen, werden 10 monsters geanalyseerd. Het totale aantal osteoblasten langs alveolaire bot oppervlak aan de sectie werd geteld. De formule om percentage positieve kleuring cacluate was: (aantal bruin gekleurd osteoblasten /totaal aantal osteoblasten geteld) x 100
Micro-CT
Vier weken na de laatste inenting, muis bovenkaak werden verzameld en afgebeeld met. een Scanco micro-CT 40 (SCANCO Medical, Brüttisellen, Zwitserland) met een resolutie van 12 micron. De micro-CT-beelden werden verkregen van het Baylor College of Medicine micro-CT Core Facility en gereconstrueerd met behulp van een gemodificeerde Feldkamp methode [23]. De beelddata die lijken op wat beschreven is door Park et al geanalyseerd. [24]. In het kort werden alle afbeeldingen geheroriënteerd zodat de cement-glazuurverbinding (CEJ) en de apex (RA) in dezelfde slice. Het gebied van belang (ROI) werd met de hand op de axiale vlakken opgesteld tussen de mediale worteloppervlak van de eerste molair en de distale worteloppervlak van de derde molaar. De contouren werden continu elke 5 data vlakken getrokken dak van de furcatie helemaal tot de wortelpunt, tot een driedimensionaal (3D) ROI wordt verkregen (Figuur 1). Alle wortel volumes werden uitgesloten van de ROI tot het totale volume (TV) te berekenen. De parameters geanalyseerd voor elk monster opgenomen botvolume fractie (BVF = BV /TV), botmineraaldichtheid (BMD, genormaliseerd op een hydroxylapatiet fantoom), en bot mineraal gehalte (BMC = BMDX BV). Figuur 1 Werkwijzen voor het genereren van 3D ROI (region of interest) in micro CT-analyse van alveolaire bot. Tweedimensionale contouren werden manueel vijf data vliegtuigen op het axiaal aanzicht getrokken, vanaf het dak van de furcatie de apex. Root oppervlak werd uitgesloten van het bot oppervlak op elke gemeten vlak. Een 3D ROI is gemaakt nadat alle 2D contouren werden getrokken. Alveolaire bot volume werd berekend als de totale ROI minus rootvolume.
Bothistomorfometrie
Vier weken na de laatste inenting, werden muis bovenkaak verzameld en in twee helften gesneden voor statische en dynamische histomorfometrie analyse, respectievelijk. Voor dynamische histomorfometrie kregen muizen 10 mg /kg lichaamsgewicht van calceïne in 2% NaHCO3 intraperitoneaal 7 en 2 dagen voor het opofferen van de nieuw gevormde bot labelen. Bovenkaak werden ontleed vrij van zachte weefsels en kronen van de tanden werden geamputeerd langs alveolaire bot oppervlak. Monsters werden gefixeerd in 70% ethanol gedurende 3-5 dagen, gedehydrateerd in toenemende concentraties ethanol, geklaard in xyleen en ingebed in methylmethacrylaat ontkalkte. Vijf micrometer dikke secties werden gesneden parallel met de lengteas van de kiezen en gedeelten nabij het centrum van pulp kamers werden ongekleurd voor visualisatie van mineraliseren oppervlak onder UV licht met een I3 filter gemonteerd. Voor statische meting werd maxilla gedurende 2-5 dagen gefixeerd in 4% paraformaldehyde in PBS, pH 7,4, bij 4 ° C. De botten werden ontkalkt in EDTA /NH 3OH nog eens 2-5 dagen en gedehydrateerd in toenemende concentraties ethanol, geklaard in xyleen en ingebed in paraffine. De ingebedde beenderen werden parallel gesneden met de lange as van de kiezen en gedeelten nabij het centrum van pulp kamers werden gemonteerd. Opeenvolgende secties werden gekleurd met toluïdine blauw (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) of tartraat-resistent zuur fosfatase (TRAP, Sigma-Aldrich) voor visualisatie van osteoblasten en osteoclasten respectievelijk. De celtypen werden verder gevalideerd door hun karakteristieke morfologie, zoals kubisch voor osteoblasten en meerkernige voor osteoclasten. Alle van de osteoblasten en osteoclasten over de gehele sectie werden geteld, de ruimtelijke variaties in hun verdelingen voorkomen. Histomorfometrische metingen werden uitgevoerd in een geblindeerde, nonbiased wijze, en de terminologie en eenheden gebruikt werden, waren de aanbevelingen van het Comité Histomorfometrie nomenclatuur van de American Society for Bone en Mineral Research [25]. Alle bothistomorfometrie analyse werd uitgevoerd aan de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center bothistomorfometrie Core Facility met behulp van de Bioquant Osteo II beeldprocessor geautomatiseerde analysesysteem (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN) gekoppeld met een Leica DM 1000 microscoop (Leica Microsystems, Wetzlar , Duitsland). Statistische gegevens
P. gingivalis
geïnfecteerde en sham groepen hebben elk 10 dieren voor alle experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd door Student's t test om significantie tussen de groepen (p & lt; 0,05) te bepalen.
Resultaten
P. gingivalis
binnenvalt tandvlees epitheelcellen, parodontale ligament (PDL) cellen, en alveolaire osteoblasten in de parodontitis muismodel
drie dagen na drie keer van orale uitdaging met P. gingivalis
, immunohistochemie vertoonde positieve kleuring voor P. gingivalis
in tandvlees epitheelcellen, PDL fibroblasten, osteoblasten langs de alveolaire oppervlak, en osteocyten ingebed in botmatrix in de geïnfecteerde groep, maar geen kleuring werd waargenomen in de controlegroep sham-geïnfecteerde groep (Figuur 2). Ongeveer 17,6 ± 2,1% van de alveolaire osteoblasten had P. gingivalis
invasie op basis van handmatige telling. Positief-gekleurd (bruin) parodontale fibroblasten werden gelijkmatig verdeeld binnen het bindweefsel. Dit resultaat toont aan dat P. gingivalis
succes binnenvalt diep parodontium in onze parodontitis diermodel. Figuur 2 P. gingivalis binnenvallen parodontale zachte en harde weefsels na herhaalde inentingen zoals aangetoond door immunohistochemie. Immunohistochemie werd uitgevoerd drie dagen na driemaal P. gingivalis
inentingen. A. Sham-geïnfecteerde controle. Anti-P. gingivalis
primair antilichaam werd toegepast in de test. Blauw is hematoxyline tegenkleuring. Let er is geen bruin positieve kleuring voor P. gingivalis
in het parodontium. B. P. gingivalis
besmette dieren, met anti-P. gingivalis
primair antilichaam uitgesloten van de assay, die geen positieve kleuring in het parodontium toont. Dit toonde dat er geen niet-specifieke kleuring van secundair antilichaam en /of substraat. C. P. gingivalis
besmette dieren, met anti-P. gingivalis
primair antilichaam in de test. Uitgebreide kleuring voor P. gingivalis
werd opgemerkt in het tandvlees epitheelcellen, PDL fibroblasten, en alveolaire osteoblasten. D. vergrote weergave in C. Positieve P. gingivalis
kleuring werd gedetecteerd in fibroblasten (aangegeven met rode pijlen) in periodontale ligament ruimte, osteoblasten langs de alveolaire botoppervlak (aangegeven met zwarte pijlen), en er wordt een osteocyten ingebed in de alveolaire bot matrix (aangegeven met zwarte pijlpunt). Afkortingen: CT, controle, sham-besmet; PG, P. gingivalis
besmet; Ab, antilichaam; R, wortel, E, gingivale epitheelcellen; PDL, parodontale ligament; B, alveolaire bot; schaal bar = 20 pm.
P. gingivalis
infectie veroorzaakt verlies van alveolaire bot volume en de dichtheid
Vier weken na de laatste orale inoculatie met P. gingivalis
, muis bovenkaak monsters werden verzameld en afgebeeld met micro-CT-scanner. De Micro-CT-beelden tonen afgenomen alveolaire bot hoogte en furcatie resorptie van de muis kiezen (figuur 3A), en een verminderde minerale dichtheid van alveolaire bot vooral bij de gingivarand in de geïnfecteerde muizen in vergelijking met de sham controle (Figuur 3B). Kwantificatie van micro-CT resultaten toont significante vermindering van alveolaire bot volumefractie, botmineraaldichtheid en botmineraal inhoud van geïnfecteerde dieren vergeleken met de controles (Figuur 3C-E). Figuur 3 P. gingivalis infectie veroorzaakt verlies van alveolair botvolume en dichtheid zoals aangetoond door micro-CT. Micro-CT analyse werd uitgevoerd vier weken na in totaal acht bacteriële entingen. Verminderde alveolaire bothoogte en furcatie betrokkenheid (A) en verminderde botmineraaldichtheid in de alveolaire oppervlak (B) werd waargenomen in de geïnfecteerde dieren. In paneel A, rode pijlen wijzen naar de furcatie betrokkenheid. In panel B, hoe donkerder rood-paarse kleur geeft aan de regio's met een lagere minerale dichtheid. Kwantificatie van micro-CT gegevens tonen dat herhalende P. gingivalis
infectie veroorzaakt een aanzienlijke vermindering van alveolaire bot fractie (C), botmineraaldichtheid (D), en bot mineraal gehalte (E) ten opzichte van controles. Afkortingen: CT, controle, sham-besmet; PG, P. gingivalis
besmet; BV /TV%, de resterende alveolaire bot volume over het totale volume; BMD, botmineraaldichtheid (genormaliseerd naar hydroxylapatiet phantom); BMC, botmineraal inhoud (= BMD X BV); *, Geeft P & lt; 0,05 vergeleken met de controlegroep.
P. gingivalis
infectie resulteert in een toename van osteoclastische botresorptie en compensational toename osteoblastische botvorming Belgique Om te evalueren hoe osteoblast /osteoclast koppeling werd beïnvloed door P. gingivalis
, bothistomorfometrie analyse werd uitgevoerd op de bovenkaak specimens uitgevoerd. Bacteriële infectie veroorzaakte een daling van osteoblast nummer (Figuur 4A, D en E), een toename van het aantal osteoclasten (figuur 4B, D en E) en verhoogde alveolaire botresorptie (Figuur 4F). Onverwacht, osteoblastische botvorming werd gestimuleerd door P. gingivalis
, zoals blijkt uit de aanzienlijk hogere MS /BS% (procent van de mineralisatie oppervlak van de totale botoppervlak gemeten figuur 4C en F), MAR (minerale appositie rate, Figuur 4C en G), en BFR /BS (botvorming rate, figuur 4C en G) in de geïnfecteerde groep in vergelijking met de controles. Figuur 4 P. gingivalis infectie resulteert in een verhoogde osteoclastische botresorptie en verhoogde botvorming osteoblastenactiviteit zoals blijkt uit het bot histomorfometrische analyse. Bothistomorfometrie werd uitgevoerd vier weken na in totaal acht bacteriële entingen. A. toluïdineblauw kleuring voor osteoblasten. Pijlen duiden osteoblasten in contact met het alveolaire botoppervlak. B. TRAP kleuring voor osteoclasten, die rood-gekleurde meerkernige cellen zijn. C. calceïne verdubbeling etikettering nieuw gevormde bot tonen. Het gebied tussen de dubbele heldergroene lijnen wanneer het nieuwe bot wordt gevormd. D-G, gekwantificeerde bothistomorfometrie data. Een significante daling van osteoblast nummer (D en E), verhoogde het aantal osteoclasten (D en E), en verhoogde osteoclastische botresorptie (F) werd waargenomen in de geïnfecteerde dieren. Verrassenderwijs werd osteoblastische botvorming sterk verhoogd in de resterende osteoblasten (F en G). Afkortingen: CT, controle, sham-besmet; PG, P. gingivalis
besmet; B, alveolaire bot; R, wortel, PDL, parodontale ligament; Ob.S /BS% procent botoppervlak bekleed met osteoblasten; Oc.S /BS% procent bot oppervlak bedekt met osteoclasten; N.Ob /B. Pm, het aantal osteoblasten per bot omtrek; N. Oc /B. Pm, het aantal osteoclasten per bot omtrek; MS /BS% procent van de mineralisatie oppervlak van de totale botoppervlak gemeten; ES /BS% procent botoppervlak uitgehold door osteoclasten; MAR, minerale bijstelling rate; BFR /BS, botvorming rate; *, Geeft P & lt; 0,05 vergeleken met de controles. Schaal bar = 20 pm.
Discussie
In deze studie hebben we onderzocht invasie van het parodontium door P. gingivalis
en hoe bacteriële infectie invloeden alveolaire bot dynamiek met behulp van een parodontitis muismodel. Murine modellen zijn uitgebreid gebruikt bij de pathogenese van parodontitis ontdekken en ontwikkelen van behandelingen, omdat de parodontale anatomie en histopathologie van parodontale laesies in muizen zijn vergelijkbaar met die bij de mens [26]. Bovendien, lage kosten, gebruiksgemak, bekend genetica, een welomschreven immuunsysteem en controleerbare orale microflora bevoordelen boven andere murine diersoorten in periodontal studies [27, 28]. Verschillende methoden zijn voorgesteld in de literatuur voor het leveren van periodontale ziekteverwekkers de mondholte van proefdieren, zoals met een dieet, bacteriën doordrenkte ligatuur, maagsonde of directe toepassing bacteriesuspensie tot gingiva [18, 21, 26, 29, 30 ]. Als u een site-specifieke infectie te bereiken en te voorkomen dat het tandvlees schade door ligatuur, we geschorst voor live P. gingivalis
in licht viskeuze oplossing (2% carboxymethylcellulose in PBS) en paste het direct op het tandvlees marge van de muis bovenkaak kiezen.
onze parodontitis muismodel is een sterk vereenvoudigde simulatie van klinische parodontitis gezien in de patiëntenpopulatie. We gebruikten enkele P. gingivalis
infectie vooral om te zien of ze kunnen binnenvallen parodontium in vivo en veroorzaken parodontale botverlies. Aangezien menselijke gingival groeve is een inwoner voor zeer gediversifieerde orale microflora [31], verdere studies met polymicrobiële parodontitis diermodellen zou extra inzicht in de pathogene mechanisme van parodontitis te bieden.
In vitro studies hebben aangetoond dat P. gingivalis
kan infiltreren humane getransformeerde en primaire gingivale epitheelcellen evenals meerlagige zak epitheelcellen [32-35]. Middels een aangelegde menselijk mondslijmvlies model uit normale menselijke epitheelcellen en fibroblasten en een gereconstitueerd basismembraan model (Matrigel), P. gingivalis
is aangetoond infiltreren meerlagige epitheelcellen, migreren door de basaalmembraan, en bereiken de onderliggende bindweefsel [36]. In vivo studies hebben de invasie van menselijke crevicular en buccale epitheelcellen [37-39], en weefsel invasie van tandvlees biopten aangetoond door P. gingivalis
[40, 41]. Deze resultaten suggereren dat parodontitis diepe periodontale weefsels in vivo binnendringen. Onze immunohistochemie studie toont invasie van tandvlees epitheelcellen, fibroblasten, alveolaire bot voering osteoblasten, en embedded osteocyten door P. gingivalis
op de geïnfecteerde plaatsen 3 dagen na meerdere orale inentingen. Dit is de eerste studie toont aan dat die parodontale pathogeen kan binnenvallen alveolaire osteoblasten in vivo. Meerdere factoren virulentie van P. gingivalis
, vooral fimbriae en gingipains, kan een belangrijke rol spelen bij het vergemakkelijken van intracellulaire invasie en extracellulaire afbraak en, uiteindelijk, de progressie en uitbreiding van parodontale schade [4, 42, 43]. Onze vorige in vitro onderzoek toont aan dat fimbriae zijn van essentieel belang voor de eerste invasie van P. gingivalis
in osteoblasten, maar het kan niet zo belangrijk voor het voortbestaan van bacteriën in gastheercellen [16] zijn. Belgique Om initiële kolonisatie /infectie aan te tonen P. gingivalis
in muizen mondholte, werd een korte-termijn immunohistochemie studie uitgevoerd om de invasie van parodontale cellen door P. gingivalis
drie dagen geëvalueerd na drie keer bacteriële entingen. Deze vroege fase werd gekozen omdat we wilden laten zien dat de aanwezigheid van P. gingivalis
binnenkant van parodontale cellen was vooral te wijten aan de invasie in plaats van intracellulaire vermenigvuldiging van de bacteriën. Immunohistochemische kleuring toonde binnenkomst van P. gingivalis
in verschillende parodontale cellen. Echter, binnen deze korte tijd venster, geen merkbare apicale migratie van junctional epitheel en pocket formatie werd opgemerkt. Schijnbare alveolaire botverlies werd niet gedetecteerd pas veel later, dat was 4 weken na een totaal van 8 inentingen. Geen duidelijke histologische tekenen van ontsteking, zoals infiltratie van ontstekingscellen (polymorfonucleaire leukocyten, lymfocyten) cellen in het bindweefsel, werd aangetoond in onze vroege fase immunohistochemie studie. Dit was waarschijnlijk te wijten aan de lage intrinsieke vermogen van P. gingivalis Belgique Om gastheerimmuunsysteem /inflammatoire responsen stimuleren [44-47]. Celwand extracten en gezuiverde cellulaire componenten van P. gingivalis Heb je al relatief zwakke gastheer immunostimulerende activiteit [44-47]. P. gingivalis of the afscheiding van neutrofiel chemoattractant Interleukine (IL) -8, IL-1β actief kan remmen en IL-18 [48, 49]. Misschien, de onderdrukking van de gastheer aangeboren immuunsysteem & amp; ontstekingsreacties door P. gingivalis
is het handhaven van de toestand van chronische infectie tijdens parodontale aandoeningen vergemakkelijken. met uitzondering van P. gingivalis
in de polymicrobiële orale flora bacteriën lijken te kunnen bemiddelen zeer robuust gastheer immune & amp; ontstekingsreacties [30, 49]. Onze resultaten toonden dat de directe invasie van P. gingivalis
in osteoblasten onderdrukt osteoblast zwembad verstoorde osteoblasten /osteoclasten hemostase resulterend in een netto botverlies. Echter, alveolaire botafbraak vanwege ontstekingsreactie op P. gingivalis
kan niet worden uitgesloten hosten.
P. gingivalis
invasie van parodontale cellen werd aangetoond dat specifieke intracellulaire bruine kleuring van de bacteriën, die afwezig zijn in controlegroepen was. Toluidine blauwkleuring op opeenvolgende weefselsecties bevestigt dat de kubische-vormige cellen op de alveolaire botoppervlak waren werkelijk osteoblasten (gegevens niet getoond). Met de kracht van het licht microscoop die we hebben gebruikt om de beelden vast te leggen, kunnen individuele bacterie niet worden opgelost. In plaats daarvan, de cellen met bacteriële invasie aangetoond accentueren of diffuse bruine cytoplasmatische kleuring. Toekomstige transmissie elektronenmicroscopie studie kunnen verder lokaliseren de subcellulaire lokalisatie van de bacteriën.
Onze micro-CT studie toont significant verminderd resterend alveolair botvolume en minerale dichtheid in het P. gingivalis
geïnfecteerde dieren in vergelijking met de sham-geïnfecteerde controles, hetgeen in overeenstemming met eerdere rapporten [30, 50]. De alveolaire botdichtheid bleek meer af op de gingivale marge dan de rest van het gebied in de geïnfecteerde dieren (Figuur 3B), waarschijnlijk als gevolg van de nabijheid dicht bij de bacteriën en hun uitgescheiden virulentiefactoren deze oppervlakken. Ondernemingen De bothistomorfometrie analyse bleek verhoogd aantal osteoclasten en osteoclastische botresorptie in de geïnfecteerde dieren vergeleken met de controles, die vergelijkbaar is met andere bevindingen [50]. Interessant voor osteoblasten parameters, daalde aanzienlijk osteoblasten cijfers, maar aanzienlijk toegenomen botvorming activiteit werd opgemerkt in de besmette dieren. Onze vorige in vitro onderzoek toont aan dat P. gingivalis
aanvankelijk onderdrukt, maar later bevordert osteoblast apoptose na herhaalde inentingen [51]. Gezien het tijdsverloop van de in vivo studie kan de verminderde osteoblast getal zijn als gevolg van verhoogde apoptose en /of remming van osteoblastogenesis door de bacteriën. Op het tijdstip onderzocht, hoewel het totale aantal osteoblasten teruggebracht, bleek dat een groter gedeelte van de resterende osteoblasten gestimuleerd om actief vaststellen bone vergeleken met controles, mogelijk door een aantal mechanismen compensational in reactie op de bacteriële challenge. De toename van botvorming werd gecompenseerd door de toename van botresorptie derhalve een netto botverlies waargenomen in de geïnfecteerde dieren. Het blijkt dat de reactie van alveolaire bot deze periodontale pathogeen gecompliceerd en verdere longitudinale been histomorfometrische analyse zou nuttig zijn om beter ontrafelen mechanisme van de ziekte zijn.
Qua wat werkelijk intracellulaire effecten van P. gingivalis
in osteoblasten /osteoclasten, onze eerdere in vitro onderzoek toont aan dat invasie van P. gingivalis
geen invloed proliferatie van osteoblasten, maar remt hun differentiatie en mineralisatie, gedeeltelijk via een remming van de differentiatie regulerende transcriptiefactoren Cbfa-1 en osterix [15 ]. Een andere in vitro studie blijkt dat de binding tussen P. gingivalis
fimbriae en osteoblasten integrinen alph5beta1 resultaten in periferie condensatie van actine en activering van JNK route in de geïnfecteerde osteoblasten [51]. Preliminaire osteoblast-osteoclast coculture studie demonstreert verhoogde RANKL en OPG verlaagde concentraties P. gingivalis
geïnfecteerd hulpkweken vergelijking met de controlegroep, wat resulteert in een veel hogere RANKL /OPG verhouding die osteoclastogenese en daaropvolgende botresorptie (ongepubliceerde gegevens) kan stimuleren. Blijkbaar zijn grondiger onderzoek nodig om extra gastheer-pathogeen interactieve moleculen te identificeren (adhesinen, cytokines, et al.) In periodontitis, de ontwikkeling van nieuwe therapeutische doelwitten te vergemakkelijken periodontale botverlies voorkomen en /of regeneratie van alveolaire bot stimuleren.
Conclusies
Samenvattend, de hierin gepresenteerde gegevens demonstreren dat P. gingivalis kunnen
alveolaire osteoblasten binnendringen, veroorzaken een afname van osteoblasten, een toename van osteoclasten en botresorptie en een onverwachte toename van botvorming in de geïnfecteerde muizen vergeleken met de controles. De botresorptie opweegt tegen nieuwe botvorming dus de geïnfecteerde muizen tonen een algemeen verlaagde alveolaire bot volume en dichtheid. Het hebben van een beter begrip van de pathogene mechanismen van parodontitis kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe preventieve of therapeutische strategieën tegen deze refractaire ziekte
Afkortingen
P. gingivalis
:.
Porphyromonas gingivalis
CFU:
-kiemgetal
LPS:
Lipopolysacchariden
< DFN> RANKL:
Receptor activator van de nucleaire factor-kappaB ligand
OPG:
Osteoprotegerine
TSBY:
Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.
